（食品科学专业论文）固定化的β半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的研究.pdf

摘要 b 半乳糖苷酶可以利用乳糖合成低聚半乳糖( c o s ) ，用作功能性食品配料。d 一 半乳糖苷酶固定化是工业化处理乳汽使其乳糖合成c , - o s 的必要步骤。本论文研究8 半乳糖苷酶的固定化方法，以期获得性能良好的固定化酶，将其用于处理乳清合成 g o s 。 将乳清粉用蒸馏水溶解复原成一定乳糖浓度的溶液作为实验样品。g o s 得率使用 t l c 法检测，t l c 法的准确性用h p l c 法进行确证，证明t l c 法是检测c k ) s 的有效 方法。 选择壳聚糖作载体，戊二醛交联的方法固定化1 3 半乳糖苷酶，研究了固定化的最 适条件：确定出先固化后交联的顺序较好，4 固定化6 h ，p h 6 0 ，l 戊二醛室温交 联3 0 m i n ，加酶量为0 4 m g g 干重壳聚糖珠，活力回收率达到2 6 4 3 ，该结果不理想。 实验制备了海藻酸锷一明胶凝胶包埋法固定化酶，其最优条件为：高粘度海藻酸钠 2 5 4 ，明胶0 8 8 ，低粘度海藻酸钠0 2 4 时，凝胶获得最大的稳定性，重复使用次 数可以达到8 次。经过戊二醛交联防止酶泄漏，并目提高了固定化酶的操作稳定性， 加酶量0 0 6 ( w v ) ，活力回收率最高可达8 0 ，即固定化酶的比活力为1 5 1 u 位凝 胶。海藻酸钙凝胶包埋带恪的固定化酶最适温度为5 5 。c ，较游离酶高5 c ；最适口h 升高0 5 个单位，耐热性和p h 耐受性变宽，而且具有向碱偏移的趋巍这些特性有利 于固定化酶的直接使用。 利用海藻酸钙一明胶凝胶包埋法固定化酶，以复原乳清为底物合成g o s ，经单因素 试验和响应面法( r s a ) 优化分析，当反应时间为2 - 0 h ，乳罐洽量3 7 4 ，温度为5 8 2 ，p h 为5 0 - 6 0 ，加目每量为0 1 4 时，c o s 得率最高，理论值为2 8 9 ，经验证实 验可以达到2 9 1 。1 升的放大实验中g o s 得率为2 8 3 ，与小试相差无几。 本论文证实海藻酸钙一明胶凝胶包埋法可以制各活力回收率较高的固定化乳糖 酶，并且具有较好的操作稳定性，该酶可以用于处理高浓度乳清，合成g 0 s ，并具有 进一步扩大试验的价值。 关键词：b - 半孚黼酶固定化乳 青粉低聚半乳糖 a b s l r a c t p g a l a c t o s i d a s e c a n s y n t h e s i z e sg a l a e t o o l i g o s a c c h f i d e s ( g o s ) a t h i g hl e v e lo f l a c t o s e 1 1 1 ei m m o b i l i z a t i o no f f 3 - g a l a c t o s i d a s ew a si n v e s t i g a t e di no r d e rt om a k e f u l lu s eo fl a c t o s e f r o mw h e y i n d u s t r i a l l y 1 1 1 cg o o d m e t h o do f i m m o b i l i z a t i o no f b - g a l a c t o s i d a s ew a ss t u d i e d , t h e n t h e i m m o b d i z e db - g a l a c t o s i d a s e w a s a p p l i e d t os y n t h e s i z e g o s w h e yp o w d e r w a sr e c o n s t i t u t e dt ot h es o l u t i o nw i t hd e t e r m i n e dc o n c e a t r a t i o no f l a c t o s e f o r t h e w o r k i n g s a m p l e s q - h e y i e l d o f g o s w a s m o n i t o r e d w i t h t l c c o r r e c t e d w i t h h p l c a s p e r g i l l u s - o r y z a - d - g a l a c t o s i d a s ew a sa d s o r b e do nc h i t o s a na n dc r o s s - l i n k e d w i t h g l u t a r a l d e h y d e t h eo p 血n a lp a r a m e t e r si n c l u d e d ：c r o s s - l i n k i n g f o l l o w e dw i t hi m m o b i l i z a t i o n u n d e r4 c ，i m m o b i l i z a t i o nf o r6 1 1 , g l u t a r a l d e h y d ep h 6 0 ，1 o ；u n d e rt h er o o mt e m p e r a t u r e f o r3 0 m i v _ m e n z y m ec o n c e n l r a l i o nw a s0 4 m g gd 珂c h i t o s a nb e a d s t h ea c t i v i t yy i e l d r e a c h e d 2 6 4 3 w h i c h w a s n o t i d e a l f o r e n z y m a t i c p r e p a r a t i o n o f g o s c o n s e q u e n t l y , c a l c i u ma l g m a t eg d w a su s e dt o e n w a p1 3 - g a l a c t o s i d m e t h eo r 虹n u m s 船 f o l l o w s ：2 5 4 h i g h - v i w o s i t y - s o d i u ma l g i n a t e 0 8 8 g e l a t i n , 0 2 4 1 0 w - v i s c o s i t y - s o d i t m a a l g m a 把，2 0 c a c l 2 ，u n d e rw h i c h c o n d i t i o nt h eg e lg o tt h eb e s ts t a b i h t yt h a tc a r lb eu s e d8 t i m e so ne n d a n dt h e a c t i v i t yy i e l dw a s8 0 t h e n i m m o b i l i z e de n z y m e 锄位唰i n g e lw a s c h a r a c t e r i z e d 1 1 1 ei m m o b d i z e de n z y m ee r l t r a p p o ：1w i t ha l g i n a t ew a ss h o w e dt h a ti t so p t i m a l t e m p e r a t u r er i s e s5 t o5 5 。c ，o p t i m a lp h r a i s e d0 5 ，e n d u r a n c et ot e m p e r a t u r ea n d p h w e r e b o t hb e t t e rt h a ns o l u b l e e n z y m e w h i c hs h o w e dt h a tt h i sk i n do f i m m o b i l i z e d e n z y m e c a nb e u s e d d i r e c t l ya n dc o n v e n i e n t l y n l ei m m o b i l i z e de n z y m ee n t r a p p e di na l g i n a t e - g e l a t i ng e lw a su s e dt op r o d u c eg o s f r o mr e c o n s t i t u t e d w h e y t h r o u g hs i n g l e f a c t o re x p e r i n a e n t sa n ds a s a n a l y s i s ，o p t i m a l c o n d i t i o n si n c l u d e dl a c t o s e c o n c e n t r a t i o n , 3 7 4 ；r e a c t i o nl i m e , 2 0 h ；僦n p 啪t u r c ，5 8 2 ；p h 5 嘶0 ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n , o 1 4 1 1 l em a x i m u mg o sc o n c e n l r a t i o nw a se s l i m a t e da s 2 8 9 w h i c h w a s p r o v e d a s 2 9 1 i n t h e t r i a l s w i t h l l r e c o n s t i t u t e d w h e y i m m o b i l i z e d b g a l a c t o s i d a s ec a l lb em a d eb ye n l m p m e 虹ti na l g i n a t ea n dg e l a t i nw i t h h i g ha c t i v i t yy i d da n dg o o dp r a c t i c a ls t a b i l i t y , h a v i n gt h ei n d u s t r i a lp r o s p e c tt os y n t h e s i z e g o s k e y w o r d s ：b - g a l a c t o s i d a s e i m m o b i l i z a t i o n w h e y p o w d e r g a l a c t o o f i g o s a w h r i d e s 垂壁塑垫奎堂堡主兰垡笙塞一 第一章绪论 1 低聚半乳糖 1 1 功能性低聚糖 低聚糖是由2 1 0 个单糖通过糖苷键i 奎接形成的直链或支链的低度聚合糖，分为 功能眭低聚糖和普通低聚糖两大类。蔗糖、乳糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等属 于普通低聚糖，它们可被姐体消化吸收，不是肠道有益细菌双歧杆菌的增殖因子。功 能性低聚糖包括水苏糖、棉籽糖、低聚乳果糖、乳酮糖、大豆低聚糖、低聚半乳糖、 低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚异麦芽酮糖和低聚龙胆塘等。人体胃肠道内没有水解 这些低聚糖( 异麦芽酮糖除外) 的酶系统，因此它们不被消化吸收而直接进入大肠内优 先为双歧杆菌所利用，是双歧杆菌的增殖因子【i 捌。 功能性低聚糖因具独特的生理功能而成为种重要的功能性食品配料，己引起全 世界广泛的关注。目前，日本在i 妨面的研究、开发与应用位居前列，己形成工业化 生产规模的低聚糖品种达十n 种，1 9 9 0 年的总产值就达4 6 亿美元，成为功能食品基 料的一大支柱。在日本，功能性低聚糖替代或部分替代蔗糖而广泛应用在饮料、糖果、 糕点、冰淇淋、乳制品及调味料等4 5 0 多种食品。目前日本的彳觥能够工业化生产 的品种多，总产量已越5 万吨。低聚异麦芽嘟苎到1 1 0 0 0 吨年( 市场价格1 4 万日刃 吨) ，低聚半乳糖为6 7 0 0 哲年( 市场价格5 万日元砘) ，低聚果糖为4 8 0 0 吨，年( 市 场价格4 万日元髓) ，低聚才镛为5 0 0 日蛑( 市场价洛2 5 万日元啊屯) 。2 0 0 0 年我国 功能性低聚糖总产量约3 万吨，主要品种是低聚异麦芽糖和低聚果糖。同时，国家批 准了低聚异麦芽糖的行业标准和功能性低聚糖通用技术标准，为规范行业发展发挥了 重要作用。 低聚半乳糖( & a l a e t o o l i g o s a e e h a r i d e ，g o s ) 是指在乳糖的半乳糖侧又结合上了 l 4 个分子的半乳糖的结合糖，分子式；勾( g a l ) n - g l c ，以母乳中含有的6 b 半乳糖基 为主要成分，含单糖数2 西个，半乳糖之间以b ( 1 - 3 ) 、b ( i - a ) 、b ( 1 - 6 ) 键相连，其中 以0 ( 1 4 ) 键为主，半乳糖与葡萄糖之间的键主要为b ( 1 4 ) 键。在自然界中，低聚半乳 糖仅存在于动物的乳汁和母乳中，而目含量很低。利用b 一半乳糖苷酶作用于乳糖可以 合成不同单糖数目的低聚半乳踣混合物，到目前为止，被证实和分离的f 氐聚半乳糖已 有几十种，如表所示： 二糖 b d g a l ( 1 6 ) 一目一d 书a l b d - g a l ( 1 6 ) 一1 3 - d - g l c b l d 书a l ( 1 - 3 ) 一b d _ g a l b dg a l ( 1 3 ) 一b - d _ g l c 一- 。 d d 书a l ( 卜2 ) 一b 一咖1 c 三糖 1 3 一肛g a l ( 1 6 ) 一b d _ g a l ( 1 4 ) 一d - g l c 1 3 _ d _ g a l ( i - 6 ) 一1 3 一d - g a l ( 1 ) 一d _ g 1 c b d - g a l ( 1 6 ) 一p d - g a l ( 1 6 ) 一d g a l p d g a l ( 1 6 ) 一b d - g i c ( 1 2 ) 一d 七a 1 口- d _ g a l ( i 一6 ) 一b d _ g i c ( 1 - 4 ) 一眦a l d d _ g a l ( 卜4 ) 一1 3 一d - s a l ( 1 _ 6 ) d _ g l c p d 屯a 1 ( 1 4 ) 一1 3 一d - g a l ( 卜4 ) d g 1 c 1 3 一d _ g a l ( 卜4 ) 一1 3 一吨a l ( 卜3 ) 一d - g l c 0 一d - g a l ( 1 棚一0 一d _ g a l ( 1 2 ) 一d - g l c b d g a l ( 1 3 ) 一b d - g a l ( 1 6 ) 一d g 1 c 1 3 d 嵋a l ( 1 - 3 ) 一b d 6 a l ( 1 4 ) n _ g 1 c b d - g a l ( 1 _ 2 ) 一b d g l c ( 1 4 ) 一d g a l b d g a l ( i - 2 ) 一b d g l c ( 1 - 3 ) 一d - 6 a l 四糖b d - g a l ( 1 6 ) 一8 一d g a l ( 1 6 ) 一1 3 d 勘l ( 1 4 ) 一i ) - g l c 1 3 d - g a l ( 1 - 6 ) 一b d - g a l ( 卜3 ) 一b 一眦a l ( 1 叫) 川_ g 1 c 1 3 一d _ g a l ( 卜3 ) 一1 3 一d - g a l ( 1 - 6 ) 一b h a l ( 1 4 ) 一d _ g l c i 糖 b d - g a l ( 1 6 ) 一b i ) - g a l ( 1 6 ) 一b d - g a l ( 1 4 ) 一b d g a l ( 1 4 ) 一d g 1 c 1 2 g o s 的生理功能 i 2 i 调节肠道菌群平衡 体肠道中存在e 百种细菌，组成了个复杂的微生态环境，参与人体正常的生 理功能，并j c 寸宿主的免疫性、生物拮抗性等有重要影响【4 】。大量的动物试验结果表明 b 删，双歧杆菌在肠道内大量繁殖，提高机体的抗体水平，激活巨噬细胞的吞噬活| 生， 提高机体的抗感染能力，预防、抑甫l 胄中瘤细胞的产生和杀死肿瘤细胞。有一分子水 平进行研究( 检测r r n a 的增减) 发现g o s 有抑制大肠杆菌，促进双歧杆菌生长的 作用。 1 2 2 防【e 便秘 低聚半孚嵫 有利于促进有机酸生成，f 9 j i i j j 萱p h 值降低，抑制了外源菌的生长代 谢。另外，双歧杆菌发酵低聚糖产生的大量短链脂防酸能刺激肠道蠕动，增加粪便湿 润度，并保持一定的渗透压，从而防止便秘的发生。在人体试验中，每天摄入3 1 0q 低聚糖，一周内便可起到防止便秘的效黝 1 2 3 改善脂质代谢 g o s 还能改善血潮旨质的代谢。切除卵巢的雌性鼠豫血清胆固醇含量偏高，喂食 g o s 后，显著降f 踟旦固醇水平，提高了血清中高密度瞻蛋白的含量。g o s 可以在大 肠被细菌发酵，促迸挥发性脂肪酸的生成，降低总血清胆固醇浓度。双歧杆菌蝎过影 天津科技大学硕士学位论文 响1 3 习圣基；0 。甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶的活性，控制胆固醇的合成而刚氐血清 胆固醇的含型“。 1 2 4 改善矿物质的吸收 g o s 自约多促进钙质吸收和防止骨质减少。临床试验发现，绝经后的妇女发生骨质 疏松和冠瞒几率颇高，为此，c h o n a n 等【9 ，1 0 w m t a r 鼠施行卵巢切除手术后进行g o s 喂养试验，发现实验组的鼠能更有效地吸收钙质，骨质中的灰分重量及股骨中的钙含 量明显高于对照组。c o s 在肠道内的代谢产物主要是短链脂肪酸，有利于改善肠道内 环境，利于肠道对钙、镁的吸皑”，1 蛐 。 1 2 5 难消化和低能量| 生 人体试验和其他动物试验证明t 9 1 g o s 不能被人体和其他动物消化吸收，能够直接 到达结肠，并且不能被大多数微生物番q 用，是哥十低能量糖，不会导致肥胖，这是因 为4 - g o s 和6 - c o s 是b - 构型的f 氏聚糖， 类劂酋中的1 3 半乳糖苷酶活力比较低， g o s 可以直接达到大肠为肠道乳酸菌利用，从而起到防l e 便秘和腹泻的作用。 1 2 6 低龋齿性 口腔微生物产生的葡萄糖转移酶不能将c o s 分解成粘着| 生单糖葡萄糖和半 乳糖，从而口腔微生物不能利用g o s ，因而不易造成龋齿，且有利于预防龋齿。 1 2 7 抑制肠道癌现象 高齐幢的g o s 有抑带燃的扩散和增长的作用，但对癌定的发生带舴 用卅。 1 3 g o s 的安全性 删c , o s 的b - 半乳糯喵韵来源于无毒安全的霉菌和酵母，而rg o s 是母乳 和传统酸奶的组成成分，所以它的安全陛得到了普遍认可。以乳糖为原料、酶法合成 的g o s 进行大鼠急性试验测得c o s 的) 卯大于1 _ 5 9 k g 体重，经过漫生毒理实验， 未发现g o s 的任何不安垒因素。嬲x c o s 膨f 有引超镕l 写的副作用，不引 起腹泻的c o s 摄入量般在o 3 o 4 9 k g 体重。 1 a g o s 的物理化学性质 市场上出售的低聚半乳糖是各种糖类的混合物，其中c o s 含量大于5 5 、乳糖 和葡萄糖含量在2 0 k 箝，还有少量的半乳糖，以粘稠的液态或者粉末形式存在。 o l i g o m a t e 5 5 是日本市场上销售的种g 0 s 产品，其粘度大手果糖，渗透压湘持水| 生 与同浓度的蔗糖相同，但吸湿性低于果糖，易于保藏。 g o s 渤￥性好，糊羝，不结合矿物凰n e g - 睛爽，黻约为藤塘的1 5n2 5 。 对撕锭，中性条件下力姆01 8 0 或者p m 0 时力嗽到1 2 0 靓_ 分解，侧辩定 性很好，本身没有不良气味和影响加工的质阿琏1 6 1 7 1 。 1 5g o s 在食品等行业的应用 g o s 可以广泛地应用于食品工业( 见表1 2 ) 和医药、化妆品、饲判等工业中。 绪论 它除了具备优异的生理功能外，还具有如下良好的加卫| 生甜避。 1 吸湿性低，因此减少食品变质； 2 甜味纯正，较蔗糖清爽，甜度仅为0 2 - - 0 4 ； 3 热稳定性好，受热不易分解； 4 在较低的p h 下不易分解，即对酸稳定。 表1 2 g o s 在食品行业中的应用 食品类别应用品种 乳制品、饮料 保健饮料 糖果点心 甜点一 面包 果酱 其他 发酵乳、乳酸菌饮料、各种奶粉、碳酸饮料、麦芽饮料、果汁饮 料、粉末饮料、酒精饮料、咖啡饮料 营养饮料、中草药饮料、加 提取物饮料、美容饮料、保健茶 糖果、片齐9 睹、口香糖、胶质软糖、巧克力、曲奇饼干、小甜饼 干、薄脆饼干、馅饼、日式点心、蛋糕 布丁、牛奶巧克力点心、果冻、蜜饯 主食面包、点心面包、纤维面包 果酱、调味品 低热值甜味齐u 、保健豆腐、纳豆、草莓果酱、水产肉糜制品、蜂 蜜制品、各种冰淇淋等 低聚糖对动物也有和人体相似的功效。近1 0 年来，功能性f 氐聚糖在饲料中大规模 使用，其添力i ：i 于饲料。 从绝对消费量来看，我国已和日本接近，但在食品工业中的应用，我国更多地应 用于含乳饮料，少量用二于i 踣果、酒类，另有呻分作为保健晶或黜品毗市。我 【到功能胜低聚糖在食品行业应用的品种相对较少，且用得较多的乳饮料还是饮料行业 中的小品种，保健食品也是花色多而绝对用量较小的领域。与日本、欧洲比较，我国 功能性低聚糖在食品应用方面还有很大潜力。 功能性低聚糖作为一个新兴行业，有其广阔的发展前景。但由于我国起步较晚， 尚有不少需要完善和进一步开展的工作。 1 6 低聚半乳糖的商业生产 目前生产低聚半乳糖的公司有y j k u l t i o n s l l a ( 日本) ，n i s s i n 制糖公司( 日本) ， s n o w b r a n d 嫦4 品( 日本) ，u n i t i k a ( 日本) 已获准生产，产品即将上市。b o r e u l o 乳 淋0 品已在荷兰生产和销售低聚半乳糖。 我国还没有正式生产。 2 g o s 的酶法合成 2 1 游离酶法合成g o s 2 1 1 水溶液中的反应 在水溶液中游离酶法进行的低聚糖合成工艺已经成熟。k a n 一在专利中报道了 天津科技大学硕士学位论文 用米曲霉来源的b 一半乳糖苷酶生产低聚糖的方法：在乳糖浓度为5 0 - - - 9 0 。o ，温度 5 5 8 3 。c ，自然p h 值条件下反应若干小时，即可获得g o s 、少量未反应的乳糖和水 解产生的单糖。例如：在沸水浴中制得8 0 ( w v ) 的乳糖溶液，冷却到6 5 。c ，加入 一定量的1 3 半乳糖苷酶( 1 0 t r a i t s 酶电乳糖) ，在6 5 。c 反应4 h 后，于9 0 保持2 0 m i n 使0 一半乳糖苷酶失活而终止反应，低聚糖的转化率达到3 1 ( 均以最初加入的乳糖 计) 。经过进一步脱色、过滤、脱盐、干燥、浓缩，最终得到高纯度的1 氐聚糖产品。 2 1 _ 2 有机相中的反应 由于低聚半乳糖的合成是利用水解的逆反应转半乳目蕾苷得到的，控制水分使反应 趋于转半乳糖苷，其中利用有机相进行酶催化反应是研究异常活跃的领列刭】。6 0 年代 发现酶在有机溶剂中不仅能够保存其催化活力而且酶的稳定性大大提高。在有机溶剂 中酶能够获得许多水溶液中所不具备的新特性。如酶催化反应的平衡点发生转移，可 催化水溶液中不能搿亍的反应，使一些水解反应逆转吲。通过选择合适的溶剂体系， 可以维持酶的活力甚至提高酶的稳定性。酶不溶于有机溶剂，因而即使不固定化也可 以通过简单的过滤或离蝴分离回收。长期反应中可避免微生物的污染。所有这些 新特i 生引起了世界各国学者的浓厚兴趣。 1 9 9 4 年，韩国的h y u nj a es h i n 等人洲利用疏水性的有机溶剂作为反应主体相， 在9 5 ( v v ) 环己烷5 水的体系中得到4 5 ( w w ) 的f 氐聚半乳糖，产率高于水相 反应。华南理工大学生物反应工程实验室归莉琼等人 2 4 】选择8 5 ( v v ) 乙酸乙酯：8 5 环己烷：3 0 水两相体系合成g o s ，其得率不到4 0 。 2 2 固定化酶法合成低聚糖 2 2 l 固定化酶水解乳清中的乳糖 国内外对以乳清为底物的1 3 一半乳糖苷酶应用的研究主要集中在水解乳清中乳糖 及其初步理论。 c , - i a c a a 和j a k u b o w s k i ( 1 9 7 4 ) 驯对p - 半乳糖苷酶的固定化以及水解乳糖和酸陛乳清 中的乳糖进行了初步的研究，发现酸陛乳清对酶具有部分不可j 封4 】制作用。j a k u b o w s k i a n d g i a c i n ( 1 9 7 5 ) p 6 将酶固定在胶原上，分别以5 乳糖、乳清粉和超滤酸化的乳清粉 为底物考察酶的比活力，发现乳清蛋白对反应有抑制作用。s i s o 和f r e i r e ( 1 9 9 4 ) 鲫 将d 一半乳糖苷酶固定在谷物碎粒上，建立经济型循环填充床反应器，用以水解乳清， 水解反应没有受到扩散作用的影响。s 蹦捌r 椒l 缈将酶固定在多孔玻璃一戊二醛 载体上，固定化酶活力回收率为9 0 ，最适p h 和最适温度发生明显移动，p h 和温度 而寸受眭优于游离酶，乳糖转化率达到8 4 8 8 需要4 8 h 。水解乳清生产的乳清糖浆可 以用于软饮料、甜食、发酵饮料中。 2 , 2 2 固定化酶合成g o s 2 r 2 2 1 以乳糖为底物合成g o s m o z a 丘h r 和n a k 觚i i l i ( 1 9 8 8 ) 鼢将来源于环状芽孢杆菌的1 3 一半乳糖苷酶固定在经 戊二醛复卜理的多猢敲匕或昔将酶直 妾用戊二醛处理，合成f 氐聚糊睛，将产率从2 1 绪论 提高到4 0 。z a h i d 等人刚将来源于环状枯草芽孢杆菌的b 一半乳黼固定在酚醛树 脂d u o l i t ee s 7 6 2 和多孑| 硅胶已c o s 最高得率为3 5 4 0 ，但固定化酶容易失活， 可能是产物的不可逆抑制作用造成的。虽然可以用乙烯基甘油减小固定化酶的活力损 失，但是相应地固定化酶合成g o s 的能力下降到8 。d e y 等”川用固定化b - 半乳糖 苷酶一填充床式反应器合成 氐聚半乳褚，结果发现随着底物浓度的增加，合成g o s 的量不断增加。而目连续操作3 0 天，固定化酶的活力没有明显降低。秦燕等 ( 2 0 0 l 圳 用聚丙烯酰胺包埋法制备的固定化酶合成g o s ，最高得率为4 0 0 o ；王筱兰等人1 ) m 】 用纤维床反应器以乳糖为底物连续生一氐聚糖，最高得率为6 6 2 。 2 2 2 2 以乳清为底 身合成g o s m e r v a t ( 2 0 0 z a 】用固定化酶分批反应器合成低聚半乳睹，最高得率为2 0 ，用超 滤膜反应器连续反应，流加新鲜底物，随时分离产物，g o s 得率基本稳定在3 1 ( 以 最初总乳糖量十，以下同) 。m i g u e l ( 1 9 9 5 ) 脚j 用多孔p v c 膜固定化p 一半乳糖苷酶用于 乳清的处理，发现当乳糖浓度为2 0 ，水解率在4 2 时，可以得到1 4 的g o s 。 国内还未报道以孚情为底物的研究。 2 3 固定化细胞合成g o s 魏东芝和王筱兰吲固定嗜热脂肪芽孢杆菌，以乳踣为底物，在纤维床反应器中连 续合成g o s ，最高得率为5 0 7 。在连续反应体系中，研究了底物浓度、讯、反应温 度和停留时间对c , - o s 合成的影响，最佳反应条件为底物浓度4 5 0 9 n 、反应温度5 5 。c 、 p h 7 0 、停留时间1 0 0 m i n 。在连续反应2 4 h 后，流加1 5 的d - 半乳糖能提高合成g o s 的能力，固定化细胞反应体系可连续稳定操作1 2 0 h 。 陈! ! 欣等人( 2 0 0 1 ) 研l 利用明胶包埋嗜热脂肪芽孢杆菌合成g o s ，并研究了反应 器类型：分批反应器最大g o s 得率为3 1 2 ，经过9 6 h ，得率下降为原来的8 8 。填 充床式反应器，最大g o s 得率为3 1 。5 0 0 ，连续反应1 4 0 h ，g o s 得率下降2 0 。 3p - 半乳糖苷酶 3 1b - 半乳糖苷酶的来源 p - 半乳糖苷酶( e c 3 2l ，2 3 ) 在动植物和微生物体中分布广泛。植物来源有桃、 李、杏、捌 豆等，动物组织来源主要有肠、脑器官和皮肤组织。然而实际应用时一 般从微生物中获得，其来源也很广泛p 田。但是| 立用于食品工业的酶必须是符合f d a 的g r a s ( g e n e m u y r e g a r d e d a s s a f e ) 要求的。现在商业上所有的b 半乳糖苷酶部来源 于微生物发酵法，基本上由酵母和霉菌发酵获得。现阶段用于水解牛乳中乳糖的商品 酶主要局限在黑曲酶0 n i g e r ) 、米曲酶轵o r y z a e ) 、乳酸克鲁维酵母噼妇卿、脆壁克鲁 维酵母 厅罐沈) 及嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l i s ) 掣口9 】。 3 2 酶本身特性 不同来源的b 一半乳塘营酶有不周最适p h 值。通常，霉菌的胞外b 。半乳糖苷酶最 适p h 在2 5 4 5 之间，适合作用于酸乳清中的乳糖；酵母菌的胞内半乳嬉菅酶最 墨望垒垫盔堂! ! 主兰堡丝苎一一一 适d h 范围接近中性，适用于牛奶( p h 6 6 ) 和甜乳清( p h 6 ，1 ) 中的乳糖。 不同酶有不同的最适温度。一般来讲，多数菌种所产生的b - 半乳糖苷酶最适温度 较低，热稳定性较差，在乳制品生产中有一定局限性。高温酶在生化反应中具有些 明显的优点，如：可以加快反应速度和减少微生物的污染等，因此人们更注重对一些 耐热性0 半乳糖苷酶生产菌株的研究。 离子类型也影响酶活力。但是对于黑曲酶和米越酶来源的8 一半乳搪营酶，其活性 不依赖于离子类型【删朋j 。 不同来源的酶对抑制剂的敏感程度不同。半乳糖是米曲酶的非竞争性抑制荆f 3 9 ， 半乳糖和葡萄裙是k f i - 画l i s 的抑制剂，其中葡萄糖的抑带舴用较强。 不同来源的酶能够合成不同类型的低聚半乳糖( 结构、分子大小) ，具有不同的合 成能力。b c i r c u l a n s 菌株合成的主要是四糖和五糖，且产量高。米曲酶主要合成三糖 和少量的四糖州。 3 3b 半乳糖苷酶的改造 m a c i u n s k a 和s e i b i s z ( 2 0 0 0 ) 吲从经过基因改造的大肠杆菌中分离出热稳定眭高的 p 一半乳糖苷酶，其合成 艨糖的最适温度为9 3 ，大幅度地降i 氐了微生物的污染， 提高了乳糖的溶解度；s a i t o 和y o s h i d a ( 1 9 9 4 ) 4 3 1 将含l a c n 基因的大肠杆菌与嗜热链球 菌的耐热基因重组，从重组体中纯化得到耐热1 3 半乳糖苷酶，据报道，在7 0 作用 3 h ，活力没有降低。y a m a j i 和1 勰a i ( 2 0 0 0 ) 删用网状聚乙烯生物载体固定化经过基因工 程修饰的昆虫细胞，摇瓶培养生产b 一半乳糖苷酶，酶产量得到显著提高。 3 4 催化反应特性及g o s 合成机理 p 一半朝糖苷酶，又称乳糖酶，主要催化水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖。除了具有 水解能力外，该酶在水解糖的过程中还会发生转半乳糖苷反应，生产具有多种生理功 能的g o s 。因而，近年来有关b 一半乳糖苷酶的研究和开发受至旷泛的关注。目前， 已从许多微生物中分离得至0p 半乳糖苷酶，对其水解反应的动力学模型做了研究f 4 5 l ， 但对反应机理仍不是很清楚，已经知道的催化机制都是以大肠杆菌的b 半烈糖苷酶作 为研究对象的。 g o s 由1 3 一半孚瞻苷酶催化孚l 糖、牛奶嬲l 清中的孚皤台成。b 糊l 糖苷酶自够 催化p 一半乳糖苷化合物中b - 半乳糖苷键水解断裂。在b 半乳糖苷酶的活陛位点有两 个功能团：巯基和咪唑基，其中巯基可以作为广义酸使半乳糖苷的氧原子质子化，咪 唑基可作为亲核试剂进攻半乳糖分子的第一个碳原子上的亲核中心。当半乳糖苷的受 体是水分子时，发生的反应是水解；当受体是另外的糖或醇时，发生转半乳糖苷作用 俐7 小1 ( 见图1 1 ) 因为b 一半乳糖苷酶作用的关键一步是形成酶一半乳糖苷复合体的同时释放葡萄 糖，半乳糖是b - 半乳糖苷酶的竞争性抑制剂。由0 半乳糖变旋形成的。一半乳糖为非 竞争陛抑制剂，抑制作用是0 一半乳糖的1 2 倍。另外，d 葡萄糖在达到定浓度后也 绪论 会产生非竞争 生抑制作用。b 半乳糖苷酶的转半乳糖苷作用强烈地依赖乳糖浓度和底 物| 生质。生物催化剂可以使用游离酶或者固定化酶或者含有1 3 半乳糖苷酶的完整细 胞。不管是游离酶还是固定化酶，合成低聚糖的最佳条件都是高底物浓度为好【2 0 j 。 田1 1 乳蒲一球算鞘转半氕藿苛枫匍 3 5b - 半孚l 糖苷酶的应用 0 一半乳糖萤酶可以水解乳培，从营养角度和工艺角度来讲，都是十分有利的。将 乳膪水解成斡睹，生一氐乳路制品，利于消化吸收，缓辅酗言不耐霓定的症状，水解 干酩乳清，生产甜味剂，同时解决乳糖低溶解度的缺点。对于b 半乳糖苷酶，过去的 几十年里，主要研究酶的水解特性，直到5 0 年代，才开始关注它的转半乳糖苷活l 生， 最近，主要研究低聚半乳糖增殖双歧杆菌，促进嘣鲔益菌群生长的功能，而且转半 乳糖苷( 乍- i i 还可以将乳糖连接到其他化合物分子上，用于生产食品配料、医药和其他 的生物活性物质。 b 一半乳糖苷酉鳍e 食品工业中的应用引起了人们广泛的关注： 1 、乳糖不耐受症在一定程度e 限制了乳制品的销路，用b 半乳培苷酶水解乳皓， 可以解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的腹泻、腹胀等多种不良反应。 2 、使用6 一半乳糖苷酶有利于乳制品的生产加工：减少酸奶凝固时间，延长酸乳 的货架期，增加甜度，减少糖的用量，增加风昧；缩短干酪凝固时间，利于成型，产 量提高1 0 ；用于生产低乳糖食品，改善乳制品的风味、营养以及品质，防止因乳糖 溶 $ 渡低引起的产品结晶现象。 3 、制备乳清糖浆。乳清糖浆由未变陛的蛋白和糖组成，可以代替蛋白和糖。用于 牛愀食品，同时改善色泽；乳清糖浆可以代替加糖冷冻牛奶用于生产太妃糖、砂 性软糖、条形糖果，改善乳糖结晶和焦化现象。 4 、b 。半乳糖苷酶在水解糖的过程中还会发生转半乳语苷反应，生成具有多种生 理功能的低聚半孚i ；l l ( g o s ) 。 天津科技大学硕士学位论文 4 固定化酶 在水溶液中迸 亍豹酶反i 撼于均 g 反应。均相酶反应系统简便，但也有许多缺点， 例如：溶液中的游离酶随排出的产物_ 起流失，不仅造成酶的损失，而且会增加产品 分离的难度和费用，影响产品质量；反应后的酶难以分离，无法重复使用：溶液酶很 不稳定，容易变胜和失活。如能将酶制剂制成保持其原有催化活性、性能稳定、又不 溶于水的固形物，即固定化酶( i r 【j f r i o b i l i z e de n z y m e ) ，则可像固体健化剂那样使用 和处理，可大幅度提高酶的利用率。 酶的本质是蛋白质，酶和细胞的固定化实际是具有催化活性的蛋白质的固定化。 酶的催化活陧主要依赖于它特殊的高级结构活性中心。当高级结构发生变化时， 酶的催化活性、底物特异性者阿以发生改变，因此，在制备固定化酶时应尽量避免那 些可能导致酶蛋白高级结构破坏的因索。由于蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键等 相互作用较弱的非共价键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件。 4 1 固定化酶的优缺点 固定化酶具有以下优点：( 1 ) 极易将固定化酶与底物、产物分开：( 2 ) 可以在较长 时闻内进行反复、分批式反应幂h 装柱连续反应；( 3 ) 在大多数情况下可以提高酶的稳定 性：( 4 ) 酶反应过程能够加以严格控制；( 5 ) 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工 艺；( 6 ) 可以提高产物的质量； ( m ) 备礁易程度 海藻酸钙凝股包埋法定化0 半乳糖昔酶 试验结果表明：当海藻酸钠的浓度为】晰2 溉时，形成的凝胶强度铡氐i 活 力回收率也低，这可能是因为凝胶强度低包埋的p 半乳塘苷酶较少造成的。从试验严 谨的角度来讲，应该作偶联效率的测定，但是我们使用的试剂不纯，本身含有蛋白质， 加入的少量酶蛋白无法测定，因此没有测定结合效率。当海藻酸钠的浓度为4 o 和 5 0 9 6 时，制备凝胶颗粒比较困难，而且由于凝胶强度过大，扩散作用影响了酶和底物 的作用。所以活力回收率刚氐。因此选用浓度为3 0 9 6 的海藻酸钠固定化酶。 萝嚣 瑟 瞄 02 03 0 405 0 海藻酸钠浓度( ) 图3 1 海藻酸钠浓度对活力回收率的影响 3 1 2 氯化钙浓度对活力回收率的影响 配制3 0 9 6 的海藻酸钠溶液，加入相同酶量，用注射器滴入不同浓度的氯化钙溶液 中制成固定化酶，测定活力回收率。结果如图3 2 ： 一8 0 郭 囤5 0 础 05 l0 l5 2025 瓤化鹕珠度( ) 图3 2 氯化 5 浓度对活力回收率的影响 从实验数据可以看出，除了2 0 9 6 的效果较好外，其他水平效果相差无几。可能的 原因是过低的钙离子浓度形成的凝胶网状结桁l 彳至比较大，网住的酰妙，而过高 的钙离子浓度又厶使网格孔径过小，、没有足够的空间容纳b 一半乳糖苷酶。所以删 选 用2 0 9 6 的氯化钙用于固定化酶。 3 1 3 加酶量对活力回收率的影响 天津科技大学顺士学位论文 配制3 o 海藻酸钠，加入l m l 不同浓度的酶液，滴入2 o 氯化钙溶液中制成固 定化酶。处理后，测定活力回收率。结果如图3 3 ： 一1 0 0 0 墨8 0o 璧6 0o 回4 00 曩2 0o 00 681 0 0 2 00 加酶量( g ) 图3 3 加酶量对活力回收率的影响 由实验数据可知，随着加酶量的增加，活力回收率逐渐降低，这是因为每种载体 都有它的最大上载量，即饱和量，所以我们选用6 f 1 1 9 的加酶量，即6 r a g * 2 0 u i 1 1 9 = 1 2 0 u ， 1 2 0 u 6 3 5 4 9 ( 1o j 】l 凝胶一共得到的凝咬重量) = 1 8 ，8 u g 的加酶量。 用海藻酸钠固定化b 半乳糖苷酶的最优条件是3 0 9 6 海藻酸钠，加酶量为1 8 8 u g 湿重，凝胶诱导剂为2 0 9 6 的氯化钙溶液，活力回收率最高可达8 0 9 6 ，即每克凝胶( 湿 重) 含酶1 5 1 u 。 3 2 固定化酶的特性表征 3 2 1 游离酶与固定化酶的最适温度 以o n p g 为底物按照相应的测定酶活力的方法测定，以最高点为1 0 0 ，计算百 分率。结果如图3 4 3 0蚰 5 06 07 0 8 0 溢度( ) 图3 4 游离酶与固定化酶的最适温度曲线 从图中可以看出，固定化酶的最适温度向高温移动，移至5 5 o c ，而且对温度的适 应范围变宽。这表明可以适当提高反应温度以增大反应速度从而缩短反应时问，提高 乳糖或乳清粉中乳糖的溶解度，利于反应的进行。 阳椰蚰m 0 一基一r烘茛罢 海藻陵钺凝睃包埋法矧定化0 i 乳耱_ 甘酶 32 2 游离酶与固定化酶的耐热稳定性 试验方法：将待测的游离酶和固定化酶分别在不同温度( 5 0 ，5 5 ，6 0 ) 保温不 同时间( 0 5 ，l ，2 ，3 ，4 h ) ，观察酶活力的变化，结果如图3 ，5 。 不管在任何温度下，固定化酶的热稳定性都好于游离酶，所的结论与b r a d y 和 l o g a n ( 1 9 9 8 ) 的结论相同，这为其在乳制品中应用，连续合成g o s 奠定了良好的基础。 固定化酶最适温度升高，可以防止 教生物污梨。 图3 5 游离酶与固定化酶的耐热性曲线 图中y 5 0 ，y 6 0 ，y 7 0 ：分别为5 0 4 c ，6 0 。c ，7 0 。c 条件t 的固定化酶 1 5 0 ，1 6 0 ，1 7 0 ：分别为5 0 。c ，6 0 | 。c ，7 0o c g d 牛下的游离酶 3 2 3 游离酶与固定化酶的最适p h 值 基1 ： l | | 6 0 1234 567891 0 1 1 p h 值 e 互亟三珂 图3 6 游离酶与固定化酶的相对活力 游离酶的最适p h 为5 0 ，固定化酶的最适p h 为5 5 ，固定化酶的最适p h 值没有 发生太大的偏移，可能是因为海藻酸钙呈中胜，对酶的最适p h 没有太大的影响，b r a d v 和l o g a n ( 1 9 9 8 ) 也得出了相同的结论。 3 2 4 酸碱稳定性 同or l m ll m g , n l 游离酶中加入5 n _ l l 不同p h 的缓冲溶液，室温处理3 0 m i n ，然 后将p h 值调至懒0 定酶活力的p h ( 游离酶在5 o ) ，定容体积至1 0 m l ，然后吸取o 1 m