（环境科学专业论文）醚类汽油添加剂与生物大分子的体内外作用.pdf

形态也发生了变化，t a m e 的影响更明显。这说明在相同浓度下t a m e 对人肝细胞产生的毒性比m t b e 大。厶7关键词：甲基叔丁基醚，生物加速器质谱法，d n a 加合物，h b 加合物a b s t r a c ta d d u c t i o no fo x y g e n a t e st og a s o l i n ec a ne n h a n c eg a s o l i n e sa n t i k n o c kp r o p e r t y ,r a i s et h eo x y g e nc o n t e n ta n di m p r o v et h ec o m b u s t i o np r o c e s s ，r e s u l t i n gi nr e d u c t i o no fv e h i c l ee m i s s i o n ss u c ha sc a r b o nm o n o x i d e ，o z o n ea n dv o l a t i l eo r g a n i cc o m p o u n d s ( v o c s ) c u r r e n t l y , m e t h y lt e r t - b u t y le t h e r ( m t b e ) i st h em o s tw i d e l yu s e do x y g e n a t es u b s t i t u t i n gf o rl e a da l k y l si nt h ew o r l db e c a u s eo ff a v o r a b l eq u a l i t i e ss u c ha si t sm a n u f a c t u r i n ga n dd i s t r i b u t i o nc a p a b i l i t i e s ，l o wb l e n d i n gv a p o rp r e s s u r ea n db o i l i n gp o i n t ，e a s i l yb l e n d i n gw i t h o u tp h a s es e p a r a t i o ni ng a s o l i n ea n di t sl o wc o s t t e r t - a m y lm e t h y le t h e r ( t a m e ) m a yb ew i d e l yu s e da sa n o t h e ra d d i t i v et og a s o l i n ei nt h ef u t u r ed u et oi t sr e l a t i v e l yl o wp r o d u c t i o nc o s t ，l o w e rv a p o rp r e s s u r e ，b o i l i n gp o i n ta n ds o l u b i l i t yi nw a t e r i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h et o x i c i t ya n dt o x i c o l o g yo fe t h e ro x y g e n a t e s ，w eh a v em e a s u r e dt h eb i o m a c r o m o l e c u l ea d d u c t i o nw i t h1 4 c - l a b e l e dm t b ei nv i v oo nm o l e c u l a rl e v e lb yu s i n gb i o a c c e l e r a t o rm a s ss p e c t r o m e t r y ( b i o a m s ) ，a nu l t r a s e n s i t i v en u c l e a ra n a l y t i c a lt e c h n i q u e w eh a v ea l s os t u d i e dt h ei n t e r a c t i o n so fm t b e t a m ea n dh e m o g l o b i n ( h b ) b o v i n es e r u l na l b u m i n ( b s a ) i nv i t r ob yf t _ i ra n d1 h - n m rs p e c t r o s c o p i e s t h e r ea r ef o u rp a r t si nt h i st h e s i s ，m a i n l ya sf o l l o w s ：( 1 ) b yu s i n gb i o a m s ，w eh a v em e a s u r e dt h ed n aa d d u c t i o nw i t hm t b ei nm o u s el i v e ra taw i d ed o s er a n g eb e g i n n i n ga tav e r yl o wl e v e l ( 1 4 g & gb w ) j u s te q u i v a l e n tt oe n v i r o n m e n t a lh u m a ne x p o s u r el e v e lw h i c hi sm u c hm o r el o w e rt h a np r e v i o u sr e p o r t s i ti st h ef i r s tf i n d i n gt h a tm t b ed e f i n i t e l yf o r m sa d d u c t sw i t i lh e p a t i cd n aa n dt h en u m b e r so fa d d u c t si n c r e a s e sw i t hi n c r e a s i n gd o s el e v e l si nal l gl i n e a rr e l a t i o n s h i p b a s e do no u ro b s e r v a t i o n ，w es p e c u l a t et h a tm t b em a yb eap o t e n t i a lc a r c i n o g e n ( 2 ) b yu s i n gb i o - a m s ，w eh a v em e a s u r e dt h eh e m o g l o b i n ( h b ) a d d u c t i o nw i t hm t b ei nv i v oa tt h es a m ed o s er a n g e a l s o ，i t st h ef i r s tf i n d i n gt h a tm t b ec a nf o r ma d d u c t s 、撕t l lh ba n dt h en u m b e r so fa d d u c t si n c r e a s e sw i 也i n c r e a s i n gd o s el e v e l si nal g l gl i n e a rr e l a t i o n s h i p s i n c et h e r ei sag o o dc o r r e l a t i v er e l a t i o n s h i pb e t w e e nh ba d d u c t sa n dh e p a t i cd n aa d d u c t so v e raw i d er a n g eo fd o s e s ，w ei i is u g g e s tt h a tt h eh ba d d u c t sc o u l db eu s e da sa na p p r o p r i a t eb i o m a r k e ri n s t e a do fd n aa d d u c t sf o re x p o s u r eo f m t b e ( 3 ) w eh a v es t u d i e dt h ei n t e r a c t i o no fm t b e t a m ea n dh b b s ai nv i t r ob yf t - i ra n d1 h - n m rs p e c t r o s c o p i e s m t b e t a m es e e m st oo n l yi n d u c el i t t l ec h a n g e so fh b b s as e c o n d a r ys t r u c t u r e ；i nt h e1 h - n m rs p e c t r ao fm t b e t a m e ，a l lp r o t o np e a k ss e e m sn oc h a n g e sw h i l ea d d i n gh b b s a t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tm t b e 仃a m ea n dh b b s ah a v en od i r e c ti n t e r a c t i o nw i t he a c ho t h e r nv i t r oi nt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ( 4 ) b e s i d e s ，w eh a v ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fm t b e t a m eo nl 0 2 ，t h en o r m a lh u m a nl i v e rc e l l s e s p e c i a l l yf o rt h eg r o w t hv a r i a t i o n 、i t ht i m e t a m eh a sm o r es e v e r er e s t r i c t i o no nt h eg r o w t ho fl - 0 2t h a nm t b e ；m t b e t a m ea l s oi n d u c e st h ec h a n g e so ft h es h a p e so fl 一0 2 ，w h i l et a m eh a sm o r ei n f l u e n c e i naw o r d a tt h es a m ec o n c e n t r a t i o n t a m ei sm o r et o x i ct ol 0 2t h a nm t b e k e yw o r d ：m e t h y lt e r t - b n t y le t h e r ( m t b e ) b i o - a c c e l e r a t o rm a s ss p e c t r o m e t r y( b i o a m s ) ，d n a - a d d u c t s ，h e m o g l o b i na d d u e t s ( h b - a d d u e t s )i v第一章绪论一、无铅汽油添加剂为了提高汽油的抗爆性，保证汽车具有良好的动力性能，满足发动机高压缩比对汽油高辛烷值的要求，长期以来，四乙基铅 p b ( c 2 h 5 ) 4 】由于成本低、来源广、抗爆性好，在全世界得到了广泛的应用。但随着汽车工业的发展，机动车尾气中铅排放量的增加，造成了大气的铅污染，城市和公路两侧是铅污染比较严重的地区，研究表明，公路边土壤中铅含量可达1 0 0 5 0 0 m g k g i ”。大气中8 0 的铅来源于含铅汽油的尾气排放【2 】，自四乙基铅抗爆剂应用于车用汽油以来，经汽油燃烧排放进入大气的铅已达数百万吨。铅是一种对人体尤其中枢神经系统有害的重金属元素，有机铅对儿童的智力发育尤为有害，铅颗粒还会吸附在催化剂表面，使氧化型和三效型催化转化器中的铂、钯和铑等贵金属催化剂发生“中毒”，从而使催化剂的转化效率大幅度降低，显著地缩短其使用寿命，阻碍了汽车机外净化排气催化转化装置的应用f 3 】。为减少和控制铅污染，美国、日本等工业发达国家早在7 0 年代后期即开始实施汽油低铅化和无铅化：美国在1 9 7 3 年1 2 月6 臼宣布开始实施逐步淘汰含铅汽油的战略，经过二十多年的努力，含铅汽油从1 9 9 6 年1 月起已从美国市场消失。日本于1 9 7 2 年开始汽油无铅化进程，1 9 8 7 年普通和优级汽油已全部不加铅，成为世界上完全实现汽油无铅化最早的国家。欧洲各国则对汽油限铅的态度不一，但目前欧洲汽油无铅化的进程正在加速，1 9 9 3 年，奥地利成为第一个停止使用含铅汽油的欧洲国家，其后，瑞典、芬兰、挪威也已全部实现汽油无铅化。我国于1 9 9 7 年开始推广使用无铅汽油。1 9 9 8 年9 月2 日国务院办公厅发布关于限期停止生产销售使用车用含铅汽油的通知( 国办 1 9 9 8 1 2 9号) ，规定自2 0 0 0 年1 月1 日起，全国停止生产含铅车用汽油，改产标号9 0 号以上的无铅汽油，7 月1 日起即停止销售和使用含铅汽油；自2 0 0 0 年1 月1 日起，汽车制造企业生产的所有汽车都要适合使用无铅汽油，新生产的轿车要采用电子喷射装置并安装排气净化装置。在实现汽油无铅化的同时，为控制无铅汽油中的其他有害物质，1 9 9 9 年6 月1 日，国家环境保护局发布了我国第一个国家燃油污染控制标准车用汽油有害物质控制标准( g w k b l - 1 9 9 9 ) ) ) ( 该标准为强制性标准，自2 0 0 0 年1 月1 日起实施) h j 。要在除铅的同时保持汽油的抗爆性及动力性能，实现车用汽油高标号化，需要在汽油生产过程中采取其他技术措施来提高辛烷值。无铅化的方法通常是以催化裂化、烷基化、重整汽油来代替简单的直馏汽油，以各种含氧化合物作为汽油添加剂代替四乙基铅。在众多的汽油添加剂中，甲基叔丁基醚( m t b e )由于价格比较低廉，与汽油相溶性好，调和蒸汽压、沸点低，易于生产和运输，成为目前世界上提高汽油辛烷值比较有效和使用较为广泛的四乙基铅替代品1 5 】。乙基叔丁基醚( e t b e ) 、甲基叔戊基醚( t a m e ) 、甲醇、乙醇及叔丁醇( t b a ) 、金属含氧化合物甲基环戊二烯三羰基锰( m m t ) 在一定范围内也有使用。这些含氧化合物的添加不但可以提高汽油的燃烧效率，还可以减少机动车尾气中c o 、c h x 的排放，有利于大气环境的改善。由于醚类含氧化合物有一定的挥发性，汽油中醚的添加量比较高，人们在生产、调和、；b h q - 等过程中都有可能接触到。汽油通常贮存在地下的油罐中，若不采取防腐措施，有l o 一3 5 的汽油有可能发生泄漏，其中的这些含氧化合物会污染地下水。因此，人们越来越关注汽油中含氧化合物的使用对环境和人体健康的影响。1 醚类含氧化合物1 1 甲基叔丁基醚甲基叔丁基醚( m t b e ) 于1 9 7 9 年经美国环保局批准首先作为汽油辛烷值改进剂使用，1 9 9 0 年，美国清洁空气法( 修正案) ( c a a a ) 要求那些冬季c o 排放浓度超标地区所用汽油中的m t b e 的添加量须达到1 5 ( 体积比) ，m t b e 的产量和使用量因而得到迅猛增长。1 9 9 8 年，世界各国m t b e 的总产量达6 6 1 0 9 加仑，其中，单美国就消耗了4 3 1 0 9 加仑，居全球之首。m t b e 在使用之初并未有足够的毒理学资料来评定人体接触可能会造成的危害，直到8 0 年代末毒理学家才开始进行一系列试验来研究其毒性。在流行病学方面，1 9 9 2 年冬天，美国阿拉斯加州在使用了含1 5 ( v v ) m t b e的汽油后，1 5 0 多人主诉出现了不同程度的头痛、眩晕、眼花、恶心等症状1 6 1 。但随后的从业人员【7 1 、实验室控制条件下人员接触m t b e 的流行病学研究1 8 - 1 0 l结果表明，这些急性症状的出现与m t b e 的暴露水平之间并没有显著的相关性。在毒理动力学方面，大鼠试验表明，无论是吸入还是口服染毒，m t b e 在生物体内均表现为低吸收、高呼出，其吸入后接触m t b e 的靶器官为上呼吸道、中枢神经系统和肝脏。进入大鼠体内的m t b e 主要分布于血、脑及肾周围脂肪组织，在肝脏中经细胞色素p 4 5 0 的氧化去甲基作用代谢生成叔丁醇( t b a ) 和甲醛，t b a 再进一步代谢为羟基异丁酸( h b a ) 、2 - 甲基1 ，2 丙二醇( m p d ) ，而尿中所含的这三种代谢物的清除均很快( 半衰期低于5 h ) t 1 1 l 。另外，有数篇有关m t b e2被人吸入后代谢情况的研究报道 1 2 - 1 3 】。结果显示，当人吸入浓度为4 p p m 、4 0p p mm t b e4 h 后，人血液中的m t b e 浓度与相同条件下大鼠血液中的m t b e 浓度一样。但m t b e 在人体内的代谢比大鼠慢，大鼠尿中发现的代谢产物同样见于人尿中。对人而言，m t b e 主要经c y p 2 a 6 代谢【1 4 】。由于m t b e 只在高浓度条件下才诱导肿瘤的发生，因而，有学者认为，m t b e 的致癌性是由细胞损伤引起的。m t b e 的急性动物毒性试验显示，动物中毒后，主要症状有麻醉、共济失调、震颤等。慢性动物的毒性试验表明，经吸入或口服染毒，雄性大鼠在中、高剂量组患。肾小管肿瘤和睾丸间质细胞肿瘤的显著性增加【1 。”】；雌性大鼠患淋巴瘤和白血病增加。小鼠试验发现，m t b e 可引起其白细胞数量的短暂下降，当m t b e 浓度超过最大耐受剂量8 0 0 0 p p m 时，雌性小鼠肝腺瘤的发生率明显增加1 6 1 。由于m t b e 的代谢产物t b a 可导致试验动物肾脏肿瘤的形成【1 7 】；甲醛具有致突变性 1 8 - 1 9 】，因此，有学者认为，在评价m t b e 的毒性时，必须考虑到t b a 和甲醛的作用，而h o n g j y 2 1 1 的研究则认为代谢产生的甲醛在m t b e 的致癌作用中影响不大。在基因毒性方面，m t b e 在标准a m e s 试验【2 2 】、小鼠骨髓微核试验2 2 l 、体内小鼠肝细胞非常规合成试验f 2 3 1 、小鼠脾淋巴幼护突变体试验口4 1 中均呈阴性结果。但是，w i l l i a m s h i l ld 的研究【”】发现，在大鼠s 9 混合功能酶的作用下m t b e可诱导t 1 0 2 中等程度的回复突变，添加甲醛脱氢酶( f d h ) 可抑制2 5 - - 3 0 的回复，人s 9 取代大鼠s 9 时，m t b e 和t b a 均能诱导t 1 0 2 回复突变，作者认为，m t b e 及其代谢产物有一定的致突变性。另外，z h o uw t 2 6 】用大鼠肝原细胞进行程序外d n a 合成试验时发现，高浓度条件下m t b e 对d n a 有损伤，且这种损伤能被切割修复系统所修复。实验结果的不一致可能是由于m t b e 挥发性大、水溶性好，而目前所用的实验体系或程序尚不健全，尚未找到合适的实验体系【2 ”。由于动物试验中m t b e 的染毒浓度偏高，目前的试验结果又仅局限于啮齿类动物，人们接触到的m t b e 的浓度通常较低，美国e p a 暂将m t b e 定为一种可能对人体致癌的物质1 5 j 。m t b e 在水中的溶解度比较高，在水中流动性很好而且不易降解，随着m t b e 越来越广泛的应用，人们越来越关注因m t b e 的使用所导致的大气和水的污染【2 8 1 。1 9 9 6 年，在美国加利福利亚州的s a n t am o n i e a ，有七口井供应该市的5 0 饮用水，遭到了m t b e 的污染，浓度高达6 0 0 u g l ，导致了该市8 0 的地下水供应受污染，现在该市每年不得不花费3 3 1 0 6 美元从外地买水。据美国地质勘探局( u s o s ) 的调查，全美在使用配方汽油( r f g ) 的地区地下水的2 0 中发现有痕量的m t b e 。2 0 0 0 年3 月2 4 日美国e p a 发布了一项通告( a n p r ) ，建议限制或中止m t b e 在配方汽油( r f g ) 6 e 的使用【2 9 】，加利福利q v , n 贝i j 计划用3 年的时间逐步淘汰m t b e ，到2 0 0 5 年底禁止使用m t b e 。由于m t b e 所造成的水污染，国外对m t b e 的降解、去除正进行着广泛的研究 3 0 - 3 4 】。1 2 甲基叔戊基醚甲基叔戊基醚( t a m e ) 于9 0 年代被用作汽油添加剂。t a m e 的雷德蒸汽压、沸点较m t b e 低，水溶性稍差，而且其合成原料异戊烯来源更丰富，较之m t b e有更为广阔的应用前景。目前英国、德国和法国已建成了万吨级的t a m e 装置。到目前为止，对t a m e 的研究较少。t a m e 在水中不易降解，若不慎倾泻到地面会透过土壤到达地下水且不易清除，但对水生生物毒性很低【3 5 】。实验动物在吸入高浓度的t a m e 后会产生瞬间的中枢神经系统抑制作用，在相同浓度下，t a m e 的抑制作用比m t b e 稍大。t a m e 在体内的主要代谢产物为异戊醇、2 羟基2 一甲基丁酸、3 羟基3 甲基丁酸等 3 6 - 3 7 】。在遗传毒性方面，t a m e 的a m e s试验和小鼠体外微核试验均未见异常口引。随着t a m e 越来越广泛的应用，其对人体健康和环境的影响有待进一步研究。2 醇类含氧化合物作为汽油添加剂的醇类含氧化合物有甲醇、乙醇和叔丁醇。叔丁醇的溶解性较好，一般作为甲醇的共溶剂使用来增加汽油的辛烷值，乙醇的添加可以使成品油的辛烷值提高2 3 倍，甲醇可以单独作燃料或作为汽油添加剂使用。甲醇和叔丁醇的毒性较大。乙醇作为汽油添加剂使用不会增加人体健康的毒害性，但由于乙醇价格比较高，其应用受到一定限制。目前美国和南美已成功地把乙醇作为汽油调合剂来应用。当汽油中含有水时，醇与汽油的相溶性较差，而且甲醇和乙醇的蒸汽压高，因此醇类的应用受到一定限制。3 甲基环戊二烯三羰基锰甲基环戊二烯三羰基锰( m m t ) 蒸汽压较低，不溶于水，易溶于碳氢化合物，于上世纪5 0 年代由美国e t h y l 公司首创，用于替代四乙基铅的汽油辛烷改进剂。m m t 原来只允许添加到含铅汽油中，1 9 9 5 年底含铅汽油的全面淘汰后则禁止使用。但美国e p a 现又同意将m m t 添加到无铅汽油中。加拿大也从1 9 7 6 年开始广泛使用m m t ，而欧盟、日本却一直禁止使用。4动物试验表明，吸入后的m m t 主要分布在肝脏、肾脏和肺中，9 5 从尿中排出。由于汽油中m m t 的添加量一般较低，美国的允许添加浓度仅为1 3 2( 0 0 3 1 ) gm n j j u 仑，m m t 在空气中又容易光解，作为汽油添加剂，人体接触m m t 的水平一般较低，人们现在更为关注的是m m t 燃烧后随尾气排出的锰所可能带来的健康影响。随着无铅汽油添加剂的大量使用，其毒性及毒理学的研究急待深入。在各种添加剂中，以醚类添加剂，特别是m t b e 的应用量最多，范围最广，目前，我国高标号汽油中也添加了2 一7 的m t b e 。我国现有十多套m t b e 装置，t a m e 的催化合成也已完成了中试。随着经济的发展，我国机动车正以年平均约1 5 的速度增长，在实施汽油无铅化的过程中，必然对醚类汽油添加剂有更多的需求。如前所述，关于醚类汽油添加剂的毒性已有不少报道，但由于受实验方法和条件的限制，实验动物的染毒浓度往往偏高，其结果与低水平接触下引起的毒性可能有差异。另外，m t b e 是否有基因毒性更需进一步的研究。我们用超灵敏的生物加速器质谱法从分子水平上研究m t b e 与生物大分子的体内加合，并用体外谱学的方法研究m t b e 和t a m e 与血液蛋白的体外直接作用，以深入研究醚类添加剂的毒性及毒理，具有一定的理论意义和现实意义。二、生物标志物近年来，化学污染物所导致的生物有机体在生物化学和生理学上的改变越来越多地被运用于检测和评价化学污染物的暴露及其效应。那些能与生物大分子作用、存在剂量响应关系、在生物体内具有足够长的存留时间的指示物被称作生物标志物。生物标志物有多种，如血红蛋白加合物( h b a d d u c t s ) 、脱氧核糖核酸加合物( d n a 。a d d u c e ) 、姐妹染色体交换( s i s t e rc h r o m a t i de x c h a n g e ) 、微核信，息( m i c r o n u c l e u sf o r m a t i o n ) 、d n a 束断裂( d n as t r a n db r e a k s ) 笔j d 3 9 】。生物标志物是污染物作用于生物机体的早期反应，应用其进行监测能在最早阶段发现污染物的危害，起到“预警”系统的作用。生物标志物不仅能提供个体“内接触量”或“有效接触量”的定量数据，还可提供化学物质结构与毒性之间的关系及毒物代谢动力学方面的信息，所以生物标志物可作为长期暴露于外源物的生物体的指示物，用于环境危害物的危险性评价( r i s ka s s e s s m e n t ) 4 0 - 4 h 。生物标志物在环境监测与评价中还可以反映在特定环境中的生物体在生理上是否正常，这与人类医学上的临床生化测定法的应用相似，可反映个体是否健康和是否恢复到正常，起到环境论断作用。但机体组织中毒物的含量高低与产生毒性效应之间的关系非常复杂，很难进行简单的推断。因而，在环境科学领域，发展有效的生物标志物，以便预测最早期疾病，进行健康危险性的评价，尚是一个前瞻性的研究工作【4 2 4 4 】。由于d n a 的重要生物学意义，近年来d n a 加合物作为人接触有毒物的生物标志物，是国内外相关领域的研究热点。与d n a 形成加合物的物质一般也可与h b 形成加合物，而且h b 具有寿命长、容易取样等特点，所以常把h b 加合物作为d n a 加合物的间接指标。1 d n a 加合物作为肿瘤启动的标志物d n a 加合物是化学物质经生物转化后的亲电活性产物与d n a 链特异点位上的结合物，多数为共价结合。要判断某种药物或化学物质是否有致畸、致癌性，往往要对它进行多个体内体外的基因毒性试验和( 或) 致癌性试验。当实验的结果出现不一致时( 某些实验结果阴性，某些结果阳性) ，测定它能否与d n a加合是一种比较有效的方法【4 5 1 。1 1d n a 加合物的形成【4 6 】d n a 是生物体内重要的大分子，也是生物体内重要的遗传物质。d n a 可能受到不同途径的损伤，如正常细胞活动过程中的损伤，紫外线和放射性物质的直接损伤，外源性化合物及其活性代谢产物与d n a 结合等等。d n a 发生损伤的生物学后果是严重的，但细胞本身具有修复能力，一旦损伤发生，修复能力便被迅速诱导，各种修复酶增加并被活化。如果损伤的d n a 不能被修复，则产生对d n a 的结构和功能的影响，导致细胞死亡或细胞突变，产生遗传疾病。大量的研究表明，外源性化合物及其活性代谢产物能引起d n a 损伤。外源性化合物及其活性代谢产物与d n a 相互作用及产生突变有一定的顺序，可分为四个阶段：形成d n a 加合物( d n a a d d u c t s ) 可能会发生d n a 的二次修饰，如链断裂或d n a 修复率提高；d n a 结构的破坏被固定。在此阶段，受影响的细胞常表现出功能的改变，最常见的染色体异常是姊妹染色体交换；当细胞分裂时，外源性化合物造成的危害可导致d n a 突变及其基因功能的改变。由此可见，外源性化合物及其活性代谢产物与d n a 相互作用所形成的d n a 加合物是最早对d n a 产生损伤的物质。目前国内外学者正大量研究生物中d n a 加合物的形成。以d n a 加合物作为生物指标来评价环境中化学污染物的遗传毒性，越来越广泛地受到人们的重6视。然而环境污染水平与d n a 加合物形成的程度以及最终效应( 遗传疾病) 之间的关系相当复杂。实际上，化学物质导致的d n a 损伤不仅反映了作用于d n a的多种化合物质的综合效应，还反映了化学物质在体内的代谢、组织中的分布、生物可利用性和解毒作用等，也反映了机体对d n a 损伤的修复能力，这是生物保持遗传机构相对稳定的重要因素。1 2d n a 加合物的测定d n a 加合物的测定除采用各种色谱法外，主要有免疫法、荧光法、3 2 p 后标记法、h p l c 法、加速器质谱法( a m s ) 等。( 1 ) 免疫法：其基本原理是抗原一抗体反应。根据应用技术又可分为放射免疫法( r i a ) 、酶联免疫法( e l i s a ) 2 及超敏酶放射免疫法( v s e r i s a ) 。一般而言，灵敏度为1 个加合物1 0 7 1 0 8 核苷酸。( 2 ) 荧光法：某些化合物的d n a 加合物具有荧光特性，对其荧光进行定量测定。常见的技术有同步荧光法、低温激光法和激光一发射荧光法。其优点是该法不破坏d n a 链，并可区分出加合物的不同立体异构体及d n a 链不同位点上的加合物。( 3 ) ”p 后标记法：这是近期较常用的半定量的检测方法。基本原理是先将分离出的d n a 用一定的酶水解成正常的单核苷酸和已形成加合物的单核苷酸，并进一步将二者分离，再用3 2 p 标记的a t p 将带有加合物的单核苷酸标记，然后用双向层析、放射自显影、液闪计数等方法定量。此法的最大优点是检测能力强、应用范围广、可检测任何化学物与d n a 的连接，尤其是可用于环境中生物样品的加合物测定以及判断化合物的毒性，包括纯品或混合物是否有潜在的致癌作用，同时具有极高的灵敏度。( 4 ) a m s 法：该法灵敏度极高，可检测到1 0 1 1 一1 0 1 2 个碱基中的一个d n a加合物。但步骤较为繁琐，且只能测量标记的物质。2 蛋白加合物作为生物标志物近年来许多研究表明，各种蛋白质亦可作为大分子与外来物质形成加合物，且加合数与特定化学物的接触程度有关。其血红蛋白( h b ) 、血清白蛋白( s a ) 最为引人注意。中2 1 蛋白加合物的形成理论上，外来物质经代谢活化为亲电子类物质，凡是能与d n a 相互作用的化学物质均可能与体内的其他生物大分子相互作用。h b 的生命周期长( 人为1 2 0 天，啮齿动物为4 5 - - 6 5 天) 、样品易得( 1 m l 全血含h b1 5 0 m g ) ，且至今尚未发现其修复系统。因而，h b 在一定程度上可以代替d n a 用于检测加合物。动物实验中已发现有5 0 多种化学物质可与h b 反应，致突变物及致癌物均可与h b 相连接。s a 和h b 一样，分子中存在许多可以和亲电剂结合的亲核部位。外来物质要键合到h b 上，亲电剂必须有足够的稳定性以便能从外来物发生代谢的细胞中扩散出来，并进入红细胞。在这个过程中，活性分子须穿过两层细胞膜。相比而言，活性分子更可能优先与血清蛋白形成加合物，这是因为：活性分子可与s a 直接作用，不必穿过细胞膜；肝细胞是大多数外源性物质代谢的场所，也是血浆蛋白合成的场所，能与肝细胞d n a 结合的物质可能容易与s a 作用。但到目前为止，有关白蛋白加合物的研究报道较少。2 2 蛋白加合物的测定目前，各种测定方法在灵敏度、选择性、费用等方面相差很大，常用的方法有：( 1 ) 电泳法( e l e c t r o p h o r e s i s ) ：蛋白加合物的形成可改变蛋白质的总电荷和电泳淌度，因此可用电泳法测量。电泳法分析蛋白加合物具有普适性，但选择性差、灵敏度底，不适合低剂量样品的测量。( 2 ) 放射分析法：用来测定被放射性同位素标记过的化合物与蛋白质加合物的总量，只适用于动物实验，不能用来测量人的样品。( 3 ) 荧光法：适合于具有荧光性质的化合物的蛋白质加合物的分析，灵敏度高( 5 p g m gh b ) ，但仪器昂贵，仅局限于有荧光的环境污染物的测定。( 4 ) 蛋白质全水解物g c m s 法：步骤多，耗时长，灵敏度低( 2 0 0n g gh b ) ，适用于分析不会被水解破坏的蛋白质。( 5 ) 改进的埃特曼降解法：适用于n 末端缬氨酸加合物的测定。( 6 ) r a n i 催化还原g c m s 法：该方法步骤简单，灵敏度高( p m o l gh b ) ，但仅适用于半胱氨酸的加合物分析。( 7 ) 免疫法：灵敏度高( o 1 p m o l gg o b l i n ) ，简便、快速、廉价，但必须培养和筛选对分析对象有特征性的抗体。( 8 ) a m s 法：灵敏度极高( 4 6a m o l m gh b ) ，但步骤较为繁琐，且只能测量标记的物质。总之，a m s 法提供了最灵敏的d n a 、h b 加合物的检测方法，因而在环境剂量的药物和化学物质的基因毒性及危险性评价方面有着广泛的应用前景【4 ”。三、加速器质谱法及其在生物医学领域中的应用加速器质谱法( a m s ) 是7 0 年代末发展起来的一项超灵敏的核分析技术，它将加速器技术与质谱技术相结合，用于测量宇宙成因核素的同位素丰度比，从而推断样品年龄，进行示踪研究。它具有灵敏度高、样品量少和测量时间短等优点。与常规质谱法相比，a m s 的灵敏度要高5 7 个数量级。a m s 广泛用于地球科学、考古学与人类学、核物理学与天体物理学、材料科学、环境科学的研究【4 8 】，被测定的长寿命核素主要有3 h 、1 4 c 、1 0 b e 、2 6 a 1 、3 6 c l 、4 1 c a 、1 2 9 l 等。1 加速器质谱法的工作原理和特点1 4 9 i1 1 加速器质谱法的工作原理和结构加速器质谱法( a m s ) 是将加速器与质谱仪联合起来并加以改进的超灵敏质谱仪，在测量过程中，先将样品引入到加速器离子源中，经电离后把粒子加速到高能，再应用近代核物理实验发展起来的电荷剥离技术、射程过滤技术以及e e 探测技术等粒子分离鉴别技术将粒子挑选出来并对单个原子进行计数。加速器质谱仪大部分由串列静电加速器加上特殊的质量分析系统组成，具体包括( 1 ) 离子源：( 2 ) 离子注入系统：( 3 ) 加速器：( 4 ) 后加速分析与输运系统；( 5 )检测系统。北京大学2 6m ve n 串列加速器质谱仪( 我们检测样品用) 如图1 一l所示。( 1 ) 离子源：具有球面电离器的强流型结构，以铯溅射( 快原子轰击) 将固体样品中的一部分原子或分子转成为负离子，产生的束流可达l - - 2 8u a 。( 2 ) 离子注入系统：大半径( r = 4 0 0m m ) 9 0 。注入磁铁，有效地抑制高丰度同位素的强峰拖尾，提高了分辨率。负离子在这一部分被分类，即单一质量或一系列已知质量的负离子被注入到加速器。( 3 ) 串列加速器：由负离子加速器、气体电子剥离室和正离子加速器构成。负离子在负离子加速器部分被加速，再在中间气体( n 2 ) 室中被剥离成正离子，最后在正离子加速器部分迸一步被加速。( 4 ) 高能系统：由静电四极透镜、静电导向器、主分析磁铁和法拉弟杯等组成。高能正离子束线离开加速器部分，经静电四极透镜选择和聚焦，由主分析磁铁将待测核素与普通核素分离，普通核素的正离子束由法拉第杯测量，待测核素离子经过磁铁选择系统，进入检测系统。9o s l 3 恻竺竺! 竺竺竺硼p a耻1ii 二= = 、，旦s盯。j l 钝。s l 2 叫jf 一3 0 。1 1锕嗣王l 虹嚣”一i f i 品s “r ab m i 陀= 二了j 衰i 二e l i $ t t 2 。i g 。一li m 。分析磁铁光阑偏转磁铁探测器单透镜发射度仪静电四级透镜静电分析器法拉弟杯栅网单透镜间隙透镜注入磁铁离子源磁四极透镜预加速缝其它离子源注入磁铁导向器图1 - 1北京大学加速器质谱计( p k u a m s ) 装置示意图( 5 ) e e 检测系统：测量能量损失( e ) 和总能量e ，由e e 二维图确定待测核素的含量，与标准和本底样比较从而确定未知样品中待测核素的含量。1 2 加速器质谱法的特点( 1 ) 灵敏度高。传统质谱仪只将离子加速到几个k e v ，而a m s 用加速器将离子加速到几个m e v ，甚至几百个m e v ，从而在a m s 中可使用多种高能技术( 全剥离、同量异位素分离、重离子探测器等) 消除分子干扰，抑制本底。这样，a m s 的检测灵敏度大为提高，可检测同位素丰度低至1 0 。1 2 一1 0 。5 的放射性核素。( 2 ) 样品量少、测量快。对长寿命核素的检测，a m s 与传统的衰变计数法相比，具有样品量少、探测效率高的特点。a m s 测量h c 样品一般为l 一2 m g碳。测量现代碳样品时，为了达到l 的统计误差，衰变计数法一般要十几小时，而a m s 只需十几分钟。( 3 ) 生物医学示踪应用有优势。在生物医学的示踪研究中，当核素的寿命很短( 9 5 )c i 1 3c h 3 - 4o c h 3c h 31 4比活度1 0 m c i m m o l ，5 0l ac is i g m a 公司u l t i m ag o l d l ml i j闪烁液蛋白酶kt r i s ：三羟甲基氨基甲烷( 缓血酸胺) a rh c la r s d s ：十二烷基硫酸钠a r苯酚a r 8 羟基喹啉a r 异戊醇a r 氯仿a r 无水乙醇a r 9 5 乙醇a r n a c la r n a a ca r n a c i t r a t ea r e d t aa r rn a s ea 酶1 2 材料和设备美国p a c k a r d 仪器公司m e r c k 公司成都化学试剂厂上海鑫达化工厂北京鼎国生物技术发展中心北京化工厂北京化工厂北京化工厂金山华工厂上海化工振兴一厂上海菲达工贸有限公司和桥分公司上海试剂一厂上海试剂一厂上海试剂一厂上海试剂一厂中科院上海生化所东风生化技术公司2 0 m l 玻璃闪烁瓶2 5m l 带玻璃杵匀浆器5 0 0 m l 可调加样器耐高速的5 0 m l 离心管昆明种小白鼠，雄性，2 0 一3 0 9中国科学院动物研究所动物中心电磁搅拌器，7 8 1 型杭州仪表电机厂5 0 1 型超级恒温槽上海市实验仪器厂超高速冷冻离心机日本岛津u v - 2 4 0 紫外一可见光分光光度计日本2 实验步骤2 1 配制试剂开放射源：在通风橱中小，t l , 地用3 0 m 1 0 9 n a c i ( 分四次) 溶液把c m t b e源液转移到5m l 的试剂瓶里，密封保存在4 c 的冰箱中，该储备液理论浓度为1 4 6 9m g m l 。配染毒用的放射性溶液：根据每只小鼠( 2 5 9 ) 灌胃0 2 0 m l ，同一剂量染毒8 1 0 只小鼠，算出大概需要的用量，用o 9 n a c l 溶液逐级稀释放射性储备液。拟配制的染毒浓度由高到低依次为1 2 5 0 i tg m l1 2 5ug m h1 2 51 - tg m l ；1 2 5i tg m l ；0 1 2 5 l ag m l ；( 分别相当于1 0 0 m g k gb w ；1 0 0 m g k gb w ：1 0 0 i tg k gb w ；1 0 0i tg k gb w ：1 0 0ug k gb w 。但考虑到m t b e 的挥发性，实际浓度以液闪测定结果为准) 。lmt r i s - h c i ( p h = 7 4 ) ：称取6 0 5 9t r i s 溶解在4 0 m l 水中，慢慢滴加浓盐酸，调节到所需p h 值( 酸度计测定) ，再定容到5 0 m l 。1 s d s 1 m m e d t a 溶液。重蒸酚：临用前蒸馏，收集1 8 0 1 8 2 c 的馏分，加o 1 8 - 羟基喹啉抗氧化，同时用1 0 一1 5 5 0m m 的t r i s h c i 饱和。s e v a g e ：氯仿：异戊醇= 2 4 ：l 。1 ：1 苯酚：s e v a g e 。5 m n a c l 。lm g m l r n a s e a 酶：1 5 m g r n a s e a 酶溶于3 m l l o m m t r i s h c i 1 5 m mn a c i ( p h = 7 5 ) 中，沸水浴中加热1 5 m i n ，放冷至室温，加4 倍体积的5 0 m mt r i s h c i ，混匀，分装后冰冻保存于- - 2 0 冰箱中。d n a 溶解液：0 1 5 m n a c i 0 0 1 5m n a c i w a t e 1m m e d t a 。使用时稀释1 0 0 倍。2 2 染毒( 1 ) m t b e 染毒方式的确定动物实验中，给药的途径和方法多种多样。其中，胃内注入( 灌胃) 法应用较多；呼吸道给药法在毒理学实验研究中应用则极为广泛。在实际生活中，人体接触m t b e 的主要途径有二：呼吸道吸入和饮用被m t b e 污染的地下水【5 1 。作为第一次尝试，我们首先选择把m t b e 溶解于生理盐水中，以灌胃的方式给小鼠单次染毒进行试验( 由于m t b e 挥发性强，吸入染毒的浓度更不易控制和测定) 。( 2 ) m t b e 给药剂量的选择关于人体接触m t b e 所允许的环境剂量水平问题，目前尚无明确统一的规定。考虑m t b e 的嗅阈及健康影响，美国e p a 推荐饮用水中m t b e 为2 0 4 0“g l t 7 3 j ；c a l i f o r n i a 州则限制得更严，要求饮用水m t b e 应控制在5 一1 4 “g l1 6范围之内【7 4 1 ；根据毒理学资料，h a r t l e yw r 则建议饮用水中m t b e 的最高允许水平为1 0 0ug l 75 1 。根据b r o w nl 【7 6 1 的调查，在美国，考虑