（发酵工程专业论文）γ亚麻酸产生菌的选育及其发酵条件的研究.pdf

摘要 i l l要 ? 一亚麻酸是人体必需脂肪酸，是现代保健食品和化妆品的重要营养物质，又是具有 多种药理作用的治病良药。其主要生产方法有植物种子提取法和微生物发酵法。微生物 发酵法生产p 豫廓酸的关键和前提是菌种的生产性能。据文献报道，深黄被孢霉 ( m o t i e r e l l ai s a b e h i n a ) 和雅致小克银汉霉( c u n n i n g h a m e l l ae l e g a n s ) 发酵生产卜亚麻酸 的潜力较大。 本文以深赞被孢霉a s 3 ，3 4 1 0 和雅致小克银汉霉a s 3 ，2 7 1 7 为出发菌株，采用物理和 化学诱变法对其进行诱变筛选，获得了高产y 亚雠酸的产生菌株深黄被孢霉h 3 ，3 4 1 0 - 5 。 h 3 3 4 1 0 5 摇瓶培养，每1 0 0m l 发酵液中菌体生物量为2 4 3 9 ，产脂量为1 + o l g ，而出发 萤株相应指标为2 1 2 9 和0 8 4 9 。气相色谱测定，h 3 ，3 4 1 0 5 所产油脂中7 - 鼗麻酸眈率为 9 4 3 ，而出发菌株为8 + 6 4 。 本文又对h 3 ，3 4 1 0 5 发酵培养基和培养条件进行了优化，优化后发酵培养基为；葡 萄糖，1 0 ；m g s 0 4 ，o ，0 3 ；n h 4 n 0 3 ，o 3 ；酵母膏，o 0 3 ；k t l 2 p 0 4 ，o 3 ；f e s 0 4 ， 2 0 p p m ：c a c h ，2 0 p p m ：c u s 0 4 ，0 a p p m ；z n s 0 4 ，2 p p m ；m n c l 2 ，2 p p m ；柠檬酸钠， 1 2 ；柠檬酸，0 3 ；吐温8 0 少许。采用此培养糕，2 8 。c ，p h 5 4 条件下摇瓶培养1 2 0 h ， 干菌体平均得率为2 5 9g 1 0 0 r o t ，总油脂平均含量为4 4 o ，r 驻廓酸比率为1 0 9 7 。 菌体得率比优化前提高了约6 6 ，总油脂含量提高了5 8 ，r 亚麻酸比率提高了1 6 3 。 关键谰：r 亚麻酸；r 亚麻酸产生菌；菌种选育；发酵条件 a b s t r a e t a b s t r a c t 7 - l i n o l e n i ca c i df g l a ) i si n d i s p e n s a b l et oh u m a nb o d y i ti sa l li m p o r t a n tn u t r i m e n ti n h e a l t hf o o da n dc o s m e t i c t h em e t h o d s o f p r o d u c i n gg l a a r ee x t r a c t i o nf r o mp l a n ts e e da n d f e r m e n t a t i o nb ym i c r o o r g a n i s m t h ek e yt of e r m e n t a t i o ni st h ea n i m a l c u l ec a p a b i l i t y i tw a s r e p o r t e dt h a tm o t i e r e l l ai s a b e l t i n aa n dc u n n i n g h a m e l l ae l e g a n sh a dah i g hp o t e n t i a la b i l i t y p r o d u c i n gg l a i nt h i sp a p e r , m o t i e r e l l ai s a b e l l i n aa s 3 ，3 4 1 0a n dc u n n i n g h a m e l i ae l e g a n sa s 3 ，2 7 1 7 w e r em u t a t e db yu va n dd i e t h y ts u l f a t e am u t a n ts t r a i nh 3 ，3 4 1 0 5w i t hh i 【g h e r7 - l i n o l e n i c a c i dy i e l dw a so b t a i n e d t h ed r yc e l lw e i g h ta n dt o t a ll i p i di nh 3 ，3 4 1 0 - 5f e r m e n t a t i o nw e r e 2 4 3 9a n d1 0 1p e r1 0 0m lf b r m e n t a t i o ns o l u t i o nr e s p e c t i v e l y , b u to n l y2 1 2 9d r yc e l lw e i g h t a n do 8 4 9t o t a ll i p i di nt h eo r i g i n a ls t r a i n t h ec o n t e n to f7 - l i n o l e n i ca c i di nt o t a ll i p i do f h 3 ，3 4 1 0 - 5w a s94 3 b yg a s c h r o m a t o g r a p h y , w h i l e8 ，6 4 i nt h eo r i g i n a ls t r a i n c u l t u r em e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sp r o d u c i n gg l ab ym o t i e r e l l ai s a b e t l i n a m u t a n th 3 ，3 4 1 0 5w e r eo p t i m i z e d t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mw a s g l u c o s e ，1 0 ；m g s 0 4 ， o 0 3 ；n h 4 n 0 3 ，o 3 ；y e a s te x t r a c t i o n ，0 0 3 ；k h 2 p 0 4 ，o - 3 ；f e s 0 4 ，2 0 p p m ；c a c l 2 ， 2 0 p p m ；c u s 0 4 ，o 4 p p m ；z n s 0 4 ，2 p p m ；m n c i z ，2 p p m ；c i t r i ca c i ds o d i u m ，1 2 ；c i t r i ca c i d ， 0 ；as p o to ft o w e n - 8 0 a f t e rc u l t u r e 谢t 1 1s h a k i n ga t2 8 。c ( p h 5 4 ) f o r1 2 0 h ，c e l ly i e l d w a s2 5 9 9 1 0 0 m l ，l i p i dc o n t e n tw a s4 4 o a n dr a t i oo f 卟l i n o l e n i ca c i dw a s1 0 9 7 a f t e r o p t i m i z a t i o n ，w h i c hw a s6 6 ，5 8 a n d1 6 3 h i g h e rr e s p e c t i v e l yt h a no p t i m i z a t i o n b e f o r e k e y w o r d s ：7 - 1 i n o l e n i ca c i d ；m i c r o o r g a n i s mp r o d u c i n gg l a ；b r e e d i n g ；f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题i ! i ：羔二壁鏖夔主塞堕数鎏匿丛墓筮醛鍪登鳇堡塞 本学位论文作考完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文的 规定，大连轻工业学院有权保留并问胬家有关部门或枧构送交论文龅复印 件和磁盘，允许论文被奁阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据痒进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文，并且本人电予文档酶内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密() ，保密期至年 月目为止。 学生签名：邋导师签名：巡 - o 扩6 年丫月f r 日 第一章文献综述 tt一 _w 一。一te 第一章文献综述 自然界存在的脂肪酸有4 0 多种。亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等几种多不饱和脂 肪酸人体自身不能合成，必须由食物供给，称为必需脂肪酸【1 1 。亚麻酸包括小亚麻酸和 丫- 亚麻酸。* 亚麻酸即全顺9 ，1 2 ，1 5 一十八碳三烯酸，r - 亚麻酸( g a m m al i n o l e n i ca c i d ) 则是全顺一6 ，9 ，1 2 一十八碳三烯酸，二者是同分异构体。实际上，a 亚麻酸较多地存在于 各种植物油中，动物脂肪中也有少量存在，因此人体通过食物摄入不难获得。而g l a ( r 亚麻酸) 在通常食用的植物油及动物脂肪中极少存在，人体通过食物摄入一般难以 满足正常需要，它作为前列腺素前体而具有较高的医用价值，是防治高血脂症、高血压、 动脉粥样硬化以及肥胖症等的优良药物。它也直接参与人体组织膜的化学组成，也是一 种保持机体正常代谢及防止皮肤衰老过快的营养剂。如果人体一旦缺乏t 亚麻酸，就会 引起变态性反应疾病，形成血栓等心血管病，对健康成严重影响。所以t 亚麻酸既是治 病良药，又是现代保健食品和化妆品的一种重要营养物质的添加剂，因而更应引起人们 的重视。 m 1 1r 亚麻酸 1 1 1r 亚麻酸的结构和性质 t 亚麻酸( g a m m al i n o l e n i c a c i d ) 是全顺6 ，9 ，1 2 一十八碳三烯酸( g l a ) 是多不饱和 脂肪酸，学名十八碳三烯酸，非共轭立体构型，分子式为c 1 8 h 3 0 0 2 ，其结构式如图1 1 所示。 y 一亚麻酸 圈卜1y 一亚麻酸的结构式 f i g 1 1s t r u c t u r eo fy ii 1 1 0 i e l l i ca c i d 第一章文献综述 其物理性状为无色油状液体，由于它分子中有三个双键，其高度的不饱和性使它在 空气中不稳定，尤其在高温条件下极易氧化；在碱性条件下易发生双键位置及构型的异一 构化反应，形成共轭多烯酸。因此，进入体内经过一系列的代谢转化，可以保证体内前 列腺素的正常代谢，从而消减疾病。 1 1 2r 亚麻酸的生理功能 作为前列腺素( p g s ) 和白三烯等的前体，t 亚麻酸在心脑血管系统、呼吸系统、 肝脏、糖尿病性神经病变和生殖系统具有非常重要的调节作用【i ，2 1 。正常人一般可以亚 油酸为原料合成人体所需的所有的p 亚麻酸1 3 ，钔，但在某些情况下，如年老、糖尿病、 酗酒，湿疹、病毒感染，缺乏维生素b 6 、锌，镁、生物素和钙等，人体不能有效地将亚 油酸转化成t 亚麻酸，此时就有可能患有某些p g s 失调性疾病。 t 亚麻酸作用的发挥是靠转化成p g s 和白三烯类物质，t 亚麻酸的摄入一定会影响 p g s 的合成水平，尤其是p g e l 的合成，由于这一类物质在人体内的调控机制非常复杂， 如不同浓度的p g s 会产生截然不同的生理效应，所以t 亚麻酸在人体内发挥何种生理效 应在不同的个体中往往会有所差异爿亚麻酸生理效应的发挥还依靠人体内未明调控因 子的协同作用。另外，r - 亚麻酸作用的发挥和人体微量元素、维生素以及其它多价不饱 和脂肪酸都有一定的联系，如果孤立地研究t 亚麻酸，往往很难得到统一的结论。 抗菌作用g l a 对多种革兰氏阴性菌、阳性菌及藻类的生长抑制作用已被证实。一 般认为g l a 进入细胞壁后，结合或插入细胞膜，改变膜的流动性及其它生理性质，从而 使生长受到抑制。在革兰氏阴性菌类群中g l a 可以抑制铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a s a e l u g i n o s a ) ( m i c = 2 0 0 3 0 0 1 t g m 1 ) 大肠杆菌等u ”。当g l a 达到5 0 0 p 咖l 时，1 5 m i n & p 可 杀死全部的细菌【6 】。同样，许多藻类生物在g l a 存在下生长也受到抑制，如绿藻纲 ( c h l o r o l l p h y c e a e ) 的蛋白核小球藻( c h l o r e l l ap y r e n o i d o a ) 、莱因衣藻( c h l a m y d o n m r a s r e i n h a r d i 0 及针胞藻纲( r a p h i d o p h y c e a e ) 的h e t e r o s i g m aa k a s h i w a ( m i c = 2 5 i _ t g m 1 ) 。g l a 被5 脱氢酶氧化所得产物6 ，9 ，1 2 ，1 5 十八碳四烯酸( o d t a ) 对藻类表现出更高的抗菌 活性( 约1 0 倍于g l a ) 。 抗h i v 感染作用k i n c h i n g t o n l 7 1 等人的研究表明，在添加t - 亚麻酸锂( l i g l a ) 的培养 基中培育4 天后，大约有9 0 的被h i v 感染的细胞被杀死，同时未被感染的对照组细胞只 损失了2 0 。在添加抗氧化剂v e 后，l i g l a 的毒性明显降低，所以认为l i g l a 对h i v 慢 性感染细胞的选择性杀伤效果可能与膜脂过氧化状态的变化有关 7 1 类似的实验也证实 2 第一章文献综述 了上述结果。 抗肿瘤作用g l a 已被确认对4 0 多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，包括乳腺癌、肺 癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌细胞及胰腺癌细胞等 8 - 1 1 l 。实验表明【1 2 1 ，在体 外培养的3 株不同肿瘤细胞中，仅一株不能对吸收的g l a 进行延长和脱氢。g l a 对其表 现最大毒性( 致死量5 i _ t g m 1 ) ，其余2 株能不同程度地将g l a 代谢为d g l a 或a a ，致死量 则为l o 2 0 p 咖l ，因此g l a 的抗肿瘤活性可能在于分子自身而非其代谢产物，供给 g l a 可能改变了细胞的脂肪酸组成，增加了多不饱和脂肪酸的含量，改变了细胞膜脂酰 基团的组成，正是这些结构变化影响了膜上运输蛋白、离子通道、一些受体及酶的性质 1 1 3 】。j i a n g 等人发现在体外实验中，l i g l a n - 以抑s t h g f s f 引起的肝癌细胞转移性及侵 袭性，而且细胞表面e 粘着蛋白也发生了变化，e 粘着蛋白是抑制细胞移动的胞间连接 分子，用0 l a 处理2 4 h 后，在肺癌细胞、乳腺癌细胞、黑素癌细胞及肝癌细胞中，e 粘 着蛋白表达量显著增加，亚油酸a ) 和花生四烯酸( 从) 均不能导致类似的变化。g l a 也可以促进a - c a t e n i n ( - - 种在e 粘着蛋白和细胞骨架之间的连接蛋白) 的表达，而在许多 肿瘤细胞中小c a t e n i n 的含量明显低于正常水平i l 卑i 。 抗炎作用近年来的研究发现，g l a 对类风湿性关节炎、肠炎、脉管炎、肾炎等多 种炎症均具有疗效或改善作用”7 1 实验表明【1 8 】，喂服3 6 9 d 的g l a 可以导致血清脂 类中的g l a 、d h g l a 和a a 增加，嗜中性白细胞磷脂中d g l a 的量亦明显增多，但其中 g l a 和a a 水平无任何变化。嗜中性白细胞合成更少的白三烯b 4 ( p 0 0 5 ) 和血小板活化因 子，这些数据揭示，g l a 的抗炎效果是通过在嗜中性白细胞等炎症相关细胞中升高 d h g l a 含量水平并减弱a a 生物合成来实现的。 ， 抗粥样硬化作用巨噬细胞和血管平滑肌细胞( v s m c ) 是粥样硬化中主要反应细 胞，将巨噬细胞从喂以不同剂量g l a 的雌鼠腹膜中分离【1 9 】，用不同抗体处理后，与v s m c 共培养，发现g l a 可明显降低v s m c 的繁殖，升高c a m p 水平。类似的研究也证明了 v s m c 的d n a 合成能被8 2 1 0 1 的g l a 所阻止1 2 0 l 。另外，g l a 及其代谢物d g l a 、a a 、 p g e 还具有调节血脂的功能【2 1 搿, 2 6 1 ，可以降低血浆总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白， 升高高密度脂蛋白含量，并能抑制血小板的聚集和动脉粥样斑块的形成，使实验性心肌 梗死区缩小。所以g l a 在临床上可以用于防治冠心病、心肌梗死、阻塞脉管炎等疾病。 治疗高血压g l a 在肾脏内可以转化为d g l a 和a a ，进一步产生血压调节物质一 一前列腺素( p g e 2 ) ，p g e 2 能够通过激活血管平滑肌腺苷酸环化酶，增n c a m p 水平而舒 张血管，调节机体水和电解质代谢，增加肾血流量或与其它血管活性激素相互作用等方 式来参与血压调节田】。此外，g l a 还被发现可以用于糖尿病的辅助治疗，锌缺乏症的改 3 第一章文献综述 善，t 射线放疗的增敏，对于亨廷顿氏舞蹈症、苯丙酮尿症、更年期综合症、帕金氏症、 哮喘、湿症、甲状旁腺亢进等多种病症也具有不同的治疗效果1 2 3 , v , 。、。 3 此外，p 亚麻酸的营养功能在于其是合成花生四烯酸的前体，它可以弥补人类花生 四烯酸的不足。花生四烯酸最早被人所关注是因为它是人体p g s 最主要的前体，目前， 花生四烯酸的一个广受关注的焦点是它在婴幼儿营养中的作用。营养学家普遍认为，脂 肪酸营养和婴幼儿的健康发育至关重要，脂肪酸营养均衡对婴幼儿大脑和视力发育尤其 重要。在所有的脂肪酸中，最受关注的是d h a 和花生四烯酸( a a ) ，这睡种脂肪酸是婴幼 儿脑部和视力发育的重要成分，但天然的食品中，d h a 和从并不是普遍存在，f a o 和 w h o 推荐在婴幼儿食品中补充这两种脂肪酸【9 】，但这两种脂肪酸的添加有很大难度，首 先，这两种脂肪酸非常容易氧化，尤其是d h a 氧化后带来强烈腥味，同时造成产品过氧 化值偏高，导致奶粉等食品保质期缩短，这是食品生产厂家最不愿接受的事情；其次， 这二者价格比较高，发酵来源的d h a 和a a 目前的价格还很难为一般人所接受，但鱼油 来源的d h a 价格低廉，目前已在不少食品中添加，a a 在天然植物和动物油脂含量极微， 所以a a 的食品营养强化难度比d h a 还大。目前，添加微生物来源d h a 和a a 的奶粉也只 有在发达国家和经济发达地区出售。人体脂肪酸营养存在着一个平衡，从营养学的角度 来讲，婴幼儿食品不能只强化d h a ，过量的d h a 和酗3 脂肪酸摄入可能存在着某些负面 效应。a a 是从t 距麻酸合成来的，丫- 亚麻酸氧化速度远低于a a ，所以食品中可以添加p 亚麻酸替代a a 在防止产品氧化方面还具有一定的优势。在实际营养配方中也有a 亚麻 酸和p 亚麻酸同时采用的，营养学原理就是兼顾了3 脂肪酸和6 脂肪酸的营养均衡。 1 1 3r 亚麻酸的存在与分布 在自然界存在的十八碳三烯酸中，m 亚麻酸比较普遍，而g l a 则较稀少，但是它广 泛分布于从原生动物到人类的所有生物中，而且具有典型的代谢产物特征。人乳汁中含 有微量的t 亚麻酸，这是婴幼儿获取r 亚麻酸的主要方式。丫- 亚麻酸还广泛分布于人体 和脊椎动物、纤毛原生动物、鞭毛虫类等动物性来源物中 2 7 1 。但t 亚麻酸以固定形式在 动物组织中仅有很低的含量，没有实际利用价值，而在少数植物和某些微生物中却含有 较多的数量。 目前已知g l a 存在于8 0 多种高等植物种子油脂中【2 8 1 ，它们分别属于六科二十九属。 g l a 含量较高的有：聚合草( s y m p h y t u mo 妒c i n a l e ) 含量约2 1 - 2 5 、玻璃苣( b o r a g o o f f l c i n a l i sl ) 约2 0 - 2 6 、黑穗醋栗( r i b e s n i g r u ml ) 约1 3 2 、微孔草( m i c r o u l a 4 第一章文献综述 s i k k i m e n s i s ) 和西藏微孔草( m i c r o u l a t i b e t i c a ) 约7 1 3 、月见草( o e n o t h e r a6 耙h h 妇l ) ” 约8 1 2 等 2 9 1 。但由于植物的不同生长时期内，种子中g l a 含量不同，而且随气候、 * 地域而有很大的波动，所以人们一直在寻求g l a 的其它来源。 研究较多的是利用微生物发酵法来获得g l a 。微藻类、细菌、丝状真菌等都含有一 定量的g l a ，但不同种，菌株含量不同。藻类中研究较多的有螺旋藻属( s p i r u l i n as p p 1 和p o r p h y r i d i u ms p p 。钝顶螺旋藻 p l a t e n s i s ) 和巨大螺旋藻 m a x i m a ) 中g l a 最具特 色，g l a 在脂肪酸中含量可达2 0 3 0 。对于结合菌纲丝状真菌，人们先后从小克银汉霉 ( c a n n i n g h a m e l l a ) 、枝霉( t l u i m n i d i u m ) 、被泡霉( m o r t i e r e l l a ) 、毛霉( m u c o r ) 、根霉( r h i z o p u s ) 、 曲霉( a s p e r g i l u s ) 等的油脂中发现了g l a l ” 植物来源的t 亚麻酸月见草是目前r - i v 麻酸最主要的来源，它之所以能推广于商 业性生产，主要是它有很强的适应性和较高的种子产量，它在我国南北许多省区都有栽 培。目前产量大的还是东北和西北地区，有野生的，也有栽培的。月见草种子细小，含 油量2 0 以上，油脂中一般含t 亚麻酸8 1 2 。琉璃苣油脂是丫- 亚麻酸含量较高的一种 油脂，其种子油中含2 0 - 2 6 的r - i v 麻酸，种子含油3 0 - - 4 0 ，主要产于欧洲，是一种花 卉植物。其种子产量较低，在我国生长适应性不如月见萆，我国少见种植。在欧洲，琉 璃芭民间也作药用。黑加仑油脂中含有1 5 2 0 的t - 亚麻酸，同时还含有大量的洳亚麻酸， 具有较高的保健价值。我国东北地区有大量种植。黑穗醋栗在我国东北地区已有大面积 栽培，种子含油1 6 ，油脂中含p 亚麻酸1 3 2 2 【2 s 】。其果实营养丰富。含有维生素a 、 b 、c 、p 等，果实多汁，可加工果酒、果糖，果酱、果汁饮料等，这也是栽培它的主要 目的之一。果实紫黑色，果皮富含红色素，可提食用色索，它既可以综合利用，加工上 述产品，又可开发利用油脂和t 亚麻酸，是具有潜在利用价值的t 亚麻酸资源。 其它具有潜在利用价值的植物还有很多，目前还多为野生，如紫草科植物微孔草 ( m i c r o u l a s i k k i m e n s i s ) 、糙草( j s p e r u g o p r o c u m b e n s ) 等。如何提高植物种子中y - 亚麻酸含量 是当前植物生物技术领域的一项重要课题，人们己开始尝试采用基因工程的方法将细菌 的6 脱饱和酶克隆进烟草，并成功地表达p o j 。 微生物来源的t - 亚麻酸微生物是t 亚麻酸的重要来源之一，t 亚麻酸的分布不象 弘亚麻酸那样普遍，但在某些种属中也有分布，这也成为微生物类群的一个重要标志， 螺旋藻中就含有大量的r - i v 麻酸t 3 n ，这是螺旋藻生理功能的一个重要原因，另外小球藻 中也含有丫- 亚麻酸，微藻油脂含量较低，又不易大规模培养，不适于产业化生产t - 亚麻 酸。s h a 、】l ，f 3 8 j 从藻状菌纲的的4 个目，子囊菌纲的7 个目，担子菌纲的5 个目中挑选了 若干菌种进行发酵，分析其中的脂肪酸发现，只有藻状菌纲的菌株含有t 亚麻酸，且不 5 第一章文献综述 含弘亚麻酸。结合菌纲的某些菌株是最有希望成为工业化大规模生产y 亚麻酸的菌种， 结合菌纲属低等真菌，这类真菌从腐生到专性寄生的类型都有，菌丝体发达多分枝，菌 丝体多无隔多核，无性繁殖形成孢子囊或单孢子的孢子囊，有性生殖形成结合孢子【3 9 l ， 有潜力成为1 r - 亚麻酸生产的菌种有被孢霉属( m o r t i e r e l l a ) ，根霉属( r h i e o p u s ) ，毛霉属 ( m u c o r ) 和小克银汉霉属( c u n n i n g h a m e l l a ) 等，这些菌广泛分布在土壤中，特别是在含有 机物丰富的腐殖质土壤中，具有生长旺盛的特点，在固体培养基上长时间培养可产生类 似泥土的腐败味，所以土壤的特殊气味和这些菌的代谢物有关。 1 9 9 8 年，w e e t e 选取了1 5 0 种结合菌纲的微生物菌株进行了发酵实验，发现在某些 菌系可高产丫- 亚麻酸。t 一亚麻酸可占油脂的3 5 6 2 。被孢霉属微生物是已经用于工业 化生产丫- 亚麻酸的菌种，多采用的菌种为深黄被孢霉( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ) 。目前， 在英国和日本，已利用它们工业化生产p 亚麻酸，目前发酵法生产的微生物油脂中t 亚麻酸含量尚不高，一般约为1 0 ，和月见草油中的含量相当。另外，被孢霉也是产花 生四烯酸的重要菌株，还发现该属的少量菌株可产e p a l 4 ”。 1 ，1 4r 亚麻酸的体内代谢 t 亚麻酸是多价不饱和脂肪酸中的一种，它是由亚油酸经6 - 脱氢酶的作用代谢而 来，它分子中有三个双键，易氧化，游离酸比酯化形式更容易氧化。t 亚麻酸的体内代 谢过程如图1 2 所示。可以看出，p 亚麻酸是代谢过程中一个重要的中间代谢产物，它 是前列腺素( p g ) 、血栓素f i x ) 、白细胞三烯( l 1 ) 等一系列重要人体生命活性物质的前体， 这些物质在人体生命活动中具有重要调节作用，突出表现为降血脂、降血压、抗血栓和 缓解某些代谢失调性症状。糖尿病人、婴幼儿、老年人代谢紊乱者等人群因体内脱氢酶 活性较低而不能由亚油酸生成足够的t 亚麻酸和后续代谢产物，就会导致多种疾病发 生，因此有必要补充p 亚麻酸。 g l a 作为人体3 种必需脂肪酸之一，直接参与了人体新陈代谢并合成机体所需的 活性成分，是组成人体各组织生物膜的结构材料，存在于各组织中，也是合成人体一系 列前列腺素的前体物质，但它在人体组织中存在时间很短，且含量很少。正常人从食物 中摄取的亚油酸( 1 i n o d e i ea c i d ，l a ) 经a - 6 脱氢酶转化为r 一亚麻酸，进而代谢为二高 t 一亚麻酸( d i h o m o - - t - - l i n o l e n i ca c i d ，d g l a ) ，再转变成前列腺素e i ( p g e i ) ，或经5 脱氢酶转化为花生四烯酸( a r a c h i d o n i ca c i d ，a a ) 生成其它前列腺素( p g s ) 、白三烯( l t s ) 和前列环素( f g l 2 ) 当人体摄取过量的饱和脂肪酸或出现脂肪酸代谢紊乱时，6 - 脱氢酶 6 第一章文献综述 受到抑制，则影响亚油酸向 t - 亚- 麻酸的转化，可造成体内前列腺素缺乏，导致心血管系 统、免疫系统等多种系统疾病。此时，如及时补充y - i f _ 麻酸，便可保证体内前列腺素的4 。 正常代谢，从而消减疾病的产生。 亚油酸 i 。食物。c 1 $ 3 y 亚麻酸 j i 系前列腺索- 一二高0 y 盘麻酸 6 及l t： 系前列腙素_ 一花生四烯酸 竺： l 系前列腺素一c 2 2 4 主要代谢途径次要代谢途径 图1 - 2t 一亚麻酸代谢过程 f i9 1 _ 2 m e t a b o ii cp a t h w a yo f7 - 1i i l o l e n l ca c i d 1 1 5r 亚麻酸的应用 临床应用p 亚麻酸在国内临床上已得到广泛的正式应用，包括用于防治冠心病和 心绞痛、抑制血小板凝聚、抗高血压、雷诺氏综合症所引起的血管痉挛、糖尿病、降低 胆固醇及抑制溃疡、胃出血、妇女经前期综合症及乳腺病、肥胖症等1 4 2 , 4 3 , 4 4 , 4 5 1 。早在1 9 8 6 年我国首先以月见草油胶丸的形式用于防治动脉粥样硬化、高血压、肥胖症等。r 亚麻 酸降低胆固醇的作用是亚油酸的1 6 3 倍，是现今已知天然药物中降胆固醇药物之冠，可 见它的效果显著。t 亚麻酸的重要生理活性在于它是人体合成前列腺素的前体，就这一 7 第一章文献综述 点就足以展示它的价值不菲。作为减肥药，丫- 亚麻酸( 前列腺素的前体) 在体内合成前列 腺素进而使瘦中枢的褐色脂肪活化，达到减肥的效果。 “ 1 9 8 8 年英国国家卫生部在欧洲率先批准了以月见草油胶囊形式用于治疗湿疹，后来 又批准了用于治疗妇女经期综合症及乳腺病。不久前又批准将十亚麻酸与二十碳五烯酸 ( e p a ) 合用，试用于爱滋病患者，以期通过提高患者体内前列腺素水平，从而稳定和恢 复免疫功能。 y 亚麻酸在国内外临床上已获得广泛应用，它作为一种类似荷尔蒙的的物质，一种 合成人体前列腺素的前体，随着人们对它认识的不断加深它的临床应用前景也越来越广 阔。 。 营养保健食品的应用p 亚麻酸在营养学方面，被高度评价为“2 1 世纪功能性食品 主角”。p 亚麻酸是构成人体内n 3 系不饱和脂肪酸的母体，大量调查结果显示，一般 大陆国家的人群普遍缺乏n - 3 系不饱和脂肪酸，我国的缺乏现象较为严重，人均日摄入 不足推荐量( 1 克每日) 的1 0 ，可见提高n - 3 系不饱和脂肪酸的摄入量是急待解决的问 题。由此可知p 亚麻酸在国内市场的销售前景非常可观。一些发达国家如美国、英国、 德国、法国、加拿大、日本等，以富含十亚麻酸的月见草油作为保健品早已在超级市场 上市。在英国，t 亚麻酸被营养学会以法律形式规定食用油中必须含有一定量的t - 亚麻 酸成分。在日本，老年人和儿童服用的奶粉制品中已加入了t 亚麻酸。丫- 亚麻酸加入食 品中制成营养补充剂的目的在于改善人类的饮食结构，纠正脂质代谢，增强人的免疫功 能。 美容化妆品方面的应用在美容及减肥方面法国等欧洲国家的超级市场上早就有 以p 亚麻酸为主要成份的“夜来香精胶囊”上市，且效果很好。在国外还有利用t 一亚麻 酸抗黑色素生成的作用，制成美容器用于抗色素沉着的报道。 t 亚麻酸的开发前景 r 亚麻酸可从一些植物中获得，但是植物资源受到一定的限 制，更广阔的植物来源有待于寻找，开发。 。 利用微生物发酵技术生产y 亚麻酸已实现工业化，但收率的提高及纯度的提高仍有 待于进一步研究。目前市场上出售的p 亚麻酸含量仅为7 1 0 。高纯度丫_ 亚麻酸对心血 管疾病，糖尿病综合症，生殖紊乱，炎症、皮肤病等都可以起到更好的疗效，可见采用 一定的技术方法生产高纯度的丫- 亚麻酸开发前景广阔。 十亚麻酸是一种类似荷尔蒙的物质，是人体合成前列腺素的前体，它的特殊结构和 特殊的生理作用决定了它在新药开发及保健食品、美容化妆品方面的开发前景看好。 8 第一章文献综述 1 2r 亚麻酸的生产方法 i 2 1 直接提取法 ， 丫亚麻酸的提取可分为机榨法、浸出法和c 0 2 超临界萃取法。 机榨法将经过清理、软化后的月见草籽直接进行压榨处理。此方法的主要特征是： 投资小、设备简单，操作维修方便，所产生毛油品质好，色泽较浅，精炼过程中脱色效 果好，酸值低，易精炼。但这种工艺出油率低，饼残油高。工艺流程： 月见草籽一初清一软化一压榨一毛油一精炼一成品油 l 饼 浸出法利用浸出工艺设备对月见草籽饼进行直接浸出。此方法主要特征是：产量 大，出油率高，但设备复杂，投资大，操作维修难度大。毛油酸值高，色泽深、炼耗大。 需要高温脱脱臭，有价值成分易损失，因此影响成品油品质。工艺流程： 一 月! 日覃耔一预处理一轧坯一渴出一柏 毛油 j ， 。 成品油q 气提蒸发 溶剂 c 0 2 超临界萃取法c 0 2 超l 临界萃取法是近年来迅速发展起来的一种新型提取技 术用超临界流体萃取技术，从月见草种子中提取月见草油，与传统提取方法相比，在 提取过程中，各种营养成分不会逸散和氧化，脂肪酸含量高，油品纯度好，无溶剂残留， 避免有害物质对油的损害嗍。分离工艺中可以根据不同馏分在不同的c 0 2 中溶解度的差 9 第一章文献综述 别进行分离，因而产品品质高；但是设备较昂贵，投资多，整个过程需要保持各个不同 的压力范围，对设备的制造和维护能力要求较高对生产工艺的操作能力也有较高要求。 工艺流程： 月见草籽一预清理一破碎一革取器一分离器一成品油 各种分离成分 通过以上分析比较可以看出，超临界萃取法以其萃取时间短。分离效率高，操作温 度低，不存在溶剂污染等技术优势，显示出其强大的生命力和发展前途。所得油脂质量 好，r 亚麻酸含量高。但上述诸方法提取所得p 亚麻酸，均为多种不饱和脂肪酸的混和 物，要获得纯的t - 亚麻酸还必须做进一步的分离。 1 2 2 化学合成法 目前获取g l a 的主要途径有两种：其一是全合成法，o s b o n d 的合成路线为炔类化合 物与格氏试剂反应、l i n d l a r f l 化加氢等过程，反应步骤比较多，操作复杂；其二是从植 物种子油及微生物发酵液中分离纯化，工艺简单，成本低，适合规模化生产。最新研究 发现，植物种子中含g l a 较多的主要有虎耳草科植物黑加仑、柳叶菜科植物月见草、紫 草科植物微孔草等，适合于g l a 的批量提取与分离。 g l a 因其结构中的不饱和双键而呈不稳定性，通常以酯的形式保存和应用，在体内 还原为g l a 发挥作用，因此其酯的形式、合成方法与体内生物代谢及工业生产关系密切 目前研究及应用的均为g l a 甲酯，而g l a 甲酯在合成过程中需用甲醇，毒性较大，因此 将用于医药和保健品的g l a f l j i j 成乙酯更为科学、安全m t 。以黑加仑油为起始原料其方法 为： ( 1 ) 皂化反应 氢氧化钠3 0 9 溶于适量水中，加乙醇2 0 0 m l 、7 , - - 胺四乙酸二钠0 5 9 ，然后将黑加仑 油1 0 0 9 倒入其中，搅拌至全溶。氮气保护，加热回流2 5 h ，冷却至室温，搅拌下加稀盐 酸至p h 2 时分出油层，水洗至p h 7 ，得总脂肪酸。 1 0 第一章文献综述 ( 2 ) 尿素包和 总脂肪酸加入含有尿素的乙醇溶液中，氮气保护，加热回流进行包和。回流液冷却“ 至尿素结晶析出，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩液再进行分次包和得至u g l a 粗品。 ( 3 ) g l a 柱色谱 制备硝酸银硅胶柱，g l a 粗品置于硅胶柱中，用石油醚和己烷为洗脱剂进行分离， 分级截留洗脱液可以获得不同饱和度的脂肪酸，回收洗脱液得到9 5 以上g l a 。 ( 4 ) 酯化反应及反应条件的筛选 在装有冷凝管、搅拌器、分液漏斗的5 0 0m l 三颈瓶中加入乙醇、盐酸、g l a l o g ， 置于电热套内，氮气保护，搅拌，加热。控制条件分别为反应温度、反应时间、p h 、酸 性溶媒、底物浓度。终止反应后用2 m o l l 盐酸调p h e p 性。减压回收乙醇，浓缩液加适 量水，用石油醚萃取3 次，合并石油醚，加适量无水硫酸钠干燥，冷藏2 4 h 。减压回收石 油醚，得到淡黄色油状物即g l a 乙酯。在酯化基本反应系统中，分别采用不同温度、不 同时间、不同浓度盐酸、不同种类的无机酸和不同比例的乙醇与g l a 进行实验，其中后 3 种条件的温度为8 0 ，时间为9 0 m i n 。 ( 5 ) 酯化率测定 在酯化反应过程中，每隔一定时间取适量反应混合物作为供试品，用气相色谱法测 定混合物中g l a 乙酯的含量，判断某一反应条件下的酯化率。 1 2 3 微生物发酵法 微生物发酵法生产y - 亚麻酸一般采用液态发酵法和固态发酵法。 自然界中除了一些植物、动物、藻类能产生y 亚麻酸外，一些微生物也有产生y 亚 麻酸的能力。在有利于油脂积累的培养条件下，一些微生物( 如霉菌、酵母菌) 还具有超常 的油脂合成能力，在这些油脂产生菌中，低等丝状真菌不但可以产生大量的油脂，而且 油脂中还富含大量的y - 亚麻酸，这就为发酵法生产y 亚麻酸展示了一个广阔的前景。 1 9 4 8 年b e m h a r d 和a l b e r c h t 首先从布拉克须霉( p h y c o m y c e sb l a k e s l e e a n u s ) 的菌丝体脂肪中 鉴定出真菌的y - 亚麻酸，其含量为菌体脂肪酸的1 6 。以后的研究发现，低等丝状真菌， 如被孢霉属、小克银汉霉属、毛霉属、根霉属、犁头霉属、共头霉属等属的一些菌株均 有产生y 亚麻酸的能力。微生物发酵法生产y 亚麻酸流程大致如下： 菌体发酵一收获菌体一造粒、烘干一萃取油脂一纯化一质量检测 第一章文献综述 由于含y 一亚麻酸的油滴存在于菌体细胞内，需进行细胞破壁，再经乙醇、正已烷 分步抽提油脂，也可用氯仿甲醇等体积混合溶剂抽提。一般菌体得率2 5 3 0 ，油脂含 量4 0 - 4 5 ，其中y - 亚麻酸含量5 t 2 ，可与月见草油相媲美，月见草油油脂中含y 亚麻酸为3 - 1 5 ，微生物油脂的脂肪组成与月见草油差别较大，与母乳脂肪较接近。 由于月见草为一年生草本植物，产量少，受地域、气候等因素影响大，因此从月见 草等天然植物中提取y - 亚麻酸价格昂贵( 日本市场售价每公斤5 万日元，约折合人民币 3 4 0 0 元) ，大大地限制了y 一亚麻酸在诸多方面的应用。与从月见草等天然植物中提取y - 亚麻酸的传统方法相比，采用微生物发酵法生产y 亚麻酸具有以下优点： ( 1 ) 微生物繁殖能力强、生长快，菌丝体易于收集和提取。 ( 2 ) 生产不受原料和产地限制，不受季节和气候的影响，不占用土地，可长年工 业化生产，生产周期短，生产过程可人为控制。 ( 3 ) 低等丝状真菌产生的油脂及y - 亚麻酸的含量相对较高，而且其油脂成分与人 乳的油脂成分接近，营养学上独具特点。 ( 4 ) 可以通过先进的生物技术手段大幅度提高y 亚麻酸的产量和降低生产成本。 日本和英国在世界上率先开展了发酵法生产y 亚麻酸的研究工作t 4 8 j 。日本工业技 术院化学技术研究所从1 9 7 6 年开始利用丝状真菌生产油脂的研究工作，他们在被孢霉属 中发现了油脂含量高并富含y 亚麻酸的菌株，建立了高密度培养法制造含y 亚麻酸的 油脂及生产y - 亚麻酸的方法。此后，日本的资生堂公司、日光石油化学公司以及英国 的一家公司相继采用发酵法商业化生产y 亚麻酸。从1 9 8 6 年以来，英、日等国已相继 投入工业化生产，英n j h o n 公n 和s t u r g e 公司发酵法生产t - i w 麻酸的年产量为1 0 0 吨以上。 日本1 9 8 6 年1 9 8 7 年为4 0 5 0 吨，1 9 8 8 年达1 0 0 吨。 目前生产的菌丝体油脂含量已达3 5 以上，脂肪酸中y 亚麻酸的含量已达1 8 左 右。发酵法生产的y 亚麻酸产品已广泛用于药品、保健食品和高级化妆品的生产。我 国对微生物发酵法生产y 亚麻酸的研究起步较晚，目前仅有上海工业微生物研究所、 天津南开大学微生物系等几家单位在近年来开展了研究工作，但这些研究仍处于实验阶 段，仅有上海工业微生物所进行过5 0 0 l 发酵罐生产y 亚麻酸的小型试验，结果菌体脂 肪酸中y 亚麻酸的含量仅为8 。目前国内水平同日本、英国相比有较大差距。主要表 现在菌株产生y - 亚麻酸的水平低，还不能商品化生产。 第一章文献综述 1 3 r 亚麻酸产生菌 。 5 一；- 7- z 一 一 一 。“。 一“ 。一 1 3 1r 亚麻酸产生菌的种类 最有希望成为工业化大规模生产t 亚麻酸的菌种是结合菌纲的某些菌株，结合菌纲 属低等真菌，这类真菌从腐生到专性寄生的类型都有，菌丝体发达多分枝，菌丝体多无 隔多核，无性繁殖形成孢子囊或单孢子的孢子囊，有性生殖形成结合孢子，有潜力成为 丫亚麻酸生产的菌种有被孢霉属( m o r t i e r e l l a ) ，根霉属( r h i e o p u s ) ，毛霉属( m u c o r ) 和小克 银汉霉属( c u t h t i t i g h a m e i i a ) 、枝根霉、犁头霉属、共头霉属和螺旋藻属的某些菌株 4 9 , 5 0 j ， 但野生型菌株合成p 亚麻酸的能力较低，不能直接用于发酵生产，需经诱变来选育高产 的菌株目前国内多采用被孢霉作为出发菌株对其诱变选育高产t 亚麻酸突变株，采用 枝霉、高大毛霉作为出发菌株也有报道。 o s a m as u z u k 等人利用深黄被孢霉、葡酒色被孢霉，拉曼被孢霉和矮被孢霉经发酵 培养，菌体油脂含量达3 5 - 7 0 ，其中g l a 占3 1 l ：a k j r a s e t o 利用枝霉( t h a m n i d i u m e l e g a n s ) 进行发酵生产g l a ，含量达2 0 ；日本培养钝顶螺旋藻和一种