生物法合成L_草铵膦的研究进展.docx

* 专论与综述 *生物法合成 l-草铵膦的研究进展楼亿圆，林志坚，郑仁朝，郑裕国*（浙江工业大学 生物工程研究所，杭州 310014）摘要：草铵膦是一种广谱、低毒、非选择性的除草剂，也是全球第二大转基因作物耐受除草剂，应用前景十分广阔。草铵膦具有两种对映异构体，但只有 l-构型具有除草活性。全面综述了已报 道的生物法制备单一手性对映体 l-草铵膦的生产工艺，从起始原料和所用酶系 2 个方面进行分类。 通过比较各生物法工艺的优缺点，探讨了生物法工业化生产 l-草铵膦的可行性，并对其进一步的 发展方向提出了展望。关键词：l-草铵膦；生物合成；手性对映体中图分类号：tq 457.29文献标识码：adoi：10.3969/j.issn.1671-5284.2009.03.001progresses in biosynthesis of l-phosphinothricinlou yi-yuan, lin zhi-jian, zheng ren-chao, zheng yu-guo*(institute of bioengineering, zhejiang university of technology, hangzhou 310014, china)abstract: l-phosphinothricin is the active ingredient of the broad-spectrum, low toxic and nonselective herbicide glufosinate-ammonium, and also the second largest transgene crop resistant herbicide worldwide. phosphinothricin consists of two isomers, but only the l-enantiomer has herbicidal activity. biotechnological methods for preparation ofoptical pure l-phosphinothricin were reviewed in this article from the view of substrates and enzymes involved. feasibility and development direction of industrial production of l-phosphinothricin by biotechnological methods was discussed on the basis of comparison of their advantages and disadvantages.key words: l-phosphinothricin; biosynthesis; enantiomer1971 年，bayer 的研究小组从 streptomyceshygroscopicus 发酵液中分离得到了一种具有杀菌活 性的三肽化合物双丙氨膦 (bialaphos)。对其结 构鉴定发现1，该三肽是由 2 分子 l-丙氨酸以及一 种当时还未知的氨基酸构成。德国赫斯特公司最早采用化学法合成了这种未知氨基酸，并命名为草铵膦。同时，发现这种天然氨基酸具有良好的除草活 性。草铵膦在分子结构上与谷氨酸非常相似，故其 与谷氨酰胺合成酶 (gs) 的活性位点可发生可逆结 合，抑制了谷氨酰胺合成途径，导致植物体内氮代 谢紊乱，氨过量积累，叶绿体解体，从而使光合作 用受抑制，最终导致植物死亡2。近年来，随着耐除草剂转基因作物新品种的不断开发与应用，草铵膦作为全球第二大转基因作物耐受除草剂，其市场规模不断增长。1999 年，草铵 膦的全球销售额不足 1 亿美元，但到 2006 年草铵 膦的全球销售额已约为 5 亿美元，根据权威资料预 计，到 2010 年草铵膦全球销售额将达到 10 亿美元， 国际市场前景十分广阔。草铵膦具有两种不同的对映体，但只有 l-草铵 膦具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动 物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。目 前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。 如果草铵膦产品能以 l-构型的纯光学异构体形式 使用，可使草铵膦的使用量降低 50%，这对于提高 原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力都具有收稿日期：20081231基金项目：国家重点基础研究发展规划项目 (2007cb714306)作者简介：楼亿圆 (1983)，男，杭州人，在读硕士研究生，主要从事生物催化与生物转化研究。tel：057188320614；email：通讯作者：郑裕国教授，博士生导师。tel：057188320630；email：2第 8 卷 第 3 期现 代 农 药十分重要的意义。迄今为止，化学法合成 l-草铵膦的报道较多3-6。 但是化学法合成 l-草铵膦通常步骤冗长，合成路线 复杂，收率低，且手性拆分试剂昂贵。相比之下， 利用生物法具有立体选择性严格、反应条件温和、 收率高及产物易分离纯化的优点，探索生物法生产l-草铵膦的可行性具有十分重要的产业化价值和显 著的社会效益。的过程中发生消旋化，产物为外消旋草铵膦。但经磷酸二酯酶 i、酰化酶 i 和谷氨酰胺酶 3 个酶分步作 用后，则可保持其光学活性，得到 l-草铵膦，3 步 反应的总得率为 75.7%。oh nnh2acopo h3 2ooon hn hooh cp3honh2 c2h5op(ch3)h1制备方法通过对文献的分析、归纳，我们可以将生物法 生产 l-草铵膦的工艺从起始的原料和途径进行分 类，主要包括以下 3 大类：1) 以 l-草铵膦的衍生 物为底物，通过酶法直接水解获得；2) 以外消旋草 铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得；3) 以 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，通过酶 的不对称合成获得。其中涉及的酶系主要有以下 7 种：1) 蛋白酶；2) 磷酸二酯酶 i；3) 脱乙酰基酶；4) 酰胺酶；5) -胰凝乳蛋白酶；6) 谷氨酸脱氢酶；7) 转氨酶。1.1以 l-草铵膦的衍生物为底物1.1.1基于蛋白酶的制备方法生物法制备 l-草铵膦最简单的方法就是利用 蛋白酶直接水解双丙氨膦 (1)。双丙氨膦是一种天 然的三肽类化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦 脱去 2 分子 l-丙氨酸，生成 l-草铵膦 (l-2)(图 1)。hno1) phosphodiesterase i2) acylase i3) glutaminasel-phosphinothricin图 2 磷酸二酯酶 i、酰化酶 i 和谷氨酰胺酶协同催化制备 l-草铵膦该方法需要 3 个酶的协同作用，工艺路线较长，而且必须从手性原料出发，增加了生产成本，在实 际生产中难以应用。1.2以外消旋草铵膦的前体为底物在实际工业化应用中，l-草铵膦的衍生物制备 困难，且成本较高。相对经济可行的方法就是利用 酶催化拆分外消旋草铵膦衍生物得到 l-草铵膦。1.2.1基于-胰凝乳蛋白酶的拆分方法natchev8 报道了一种采用-胰凝乳蛋白酶拆 分双丙氨膦乙酯制备 l-草铵膦的方法 (图 3)。该法 首先经 3 步反应，将外消旋草铵膦合成为双丙氨膦 二乙酯，接着利用碱性 mesinterico 肽酶将其 c 端酯 基水解。再经-胰凝乳蛋白酶催化水解肽键。在该 步反应中，-胰凝乳蛋白酶能选择性水解 l-双丙氨膦乙酯，生成 l-草铵膦乙酯。最后，利用磷酸二酯酶 i 水解 p 端酯基得到 l-草铵膦。ch3oooh n e.coli proteaseh3c pnohho-2h-ala-ohhnh2 och3ooalkaline mesinterico peptidaseh3c pala-ala-oc2h5c2h5oh o+3nh2o图 1 蛋白酶催化水解双丙氨膦o1.1.2基于三种酶协同水解的制备方法手性化合物在进行化学反应的过程中容易发 生消旋化，这对于利用手性原料制备 l-草铵膦非常 不利。natchev7以 l-3-氨基-2-环戊酰胺为原料，利 用 michaelis-becker 反应，制备了 l-3-乙酰氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺 (图 2)。l-3-乙酰氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺在酸催化水解脱去乙酸h3cp -chymotrypsinala-ala-ohc2h5onh2oo h3c pphosphodiesterase iohl-phosphinothricinc2h5onh2图 3胰蛋白酶拆分法制备 l-草铵膦o oh3c pho ohnh2l-phosphinothricin (l-2) d172009 年 6 月楼亿圆，等：生物法合成 l-草铵膦的研究进展3利用上述方法虽然可以制备纯度较高的 l-草铵膦，但是，原料中的 d 构型对映体衍生化后已经 无法回收重复利用，造成了原料的浪费，增加了生 产成本。1.2.2 基于脱乙酰基酶的拆分方法专利 us 43894889报道了利用 e.coli 的青霉素 酰化酶拆分 n-苯基乙酰-草铵膦制备 l-草铵膦的方法，并且发现该青霉素酰化酶对 n 端芳基取代的草铵膦衍生物拆分效果理想，而对于 n 端脂肪族取代 的草铵膦衍生物选择性较差。然而，制备 n-苯基乙 酰-草铵膦的成本比较高，所以开发 n-乙酰-草铵膦 作为拆分底物成为一条理想的替代途径。开发 n- 乙酰-草铵膦替代途径的关键就是筛选获得具有较高立体选择性的生物酶。有学者发现，脱乙酰基酶对于乙酰基取代的氨基酸有比较理想的拆分效果。 us 668618110中报道了脱乙酰基酶 (重组酶) 的筛 选、纯化的过程，以及利用该纯化酶制备 l-草铵膦 的过程 (图 4)。在 37，ph 8.0 条件下，脱乙酰基 酶催化 48 h，当底物浓度小于 100 mmol/l，可获得 对映体过量值 (ee 值) 约为 100%的 l-草铵膦，底 物最高浓度为 500 mmol/l，产物的 ee 值为 66%。 将脱乙酰基酶固定化后应用于塔式反应器，采用流 加底物的方式反应 10 d，底物浓度累计达到 500 mmol/l，l 构型乙酰草铵膦的转化率为 83%。时释放 nh3。28下振荡 15 h，转化液中 l-草铵膦的 ee 值为 95.7%。ooh3cp emterobacter aerogenes 9164 nh2hol-specific amidasesnh2ooooh3cpnh2h3c phooh +nhho2nh2图 5l-酰胺酶催化制备 l-草铵膦酰胺酶拆分法的理论产率为 50%，因此，未反应的 d-pta 必须回收。在适当 ph (911 之间) 下， d-pta 被有机溶剂萃取，然后在一定条件下消旋化 后，重新作为原料。1.3以 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸作为 原料的制备方法1.3.1基于谷氨酸脱氢酶的制备方法谷氨酸脱氢酶 (glutamate hydrogenase) 是合成 谷氨酸的关键酶，参与谷氨酸的合成和分解。据 fang jm 等12报道，利用谷氨酸脱氢酶，2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸在磷酸铵缓冲液中被还原 为 l-草铵膦 (图 6)，反应需要辅酶 nadh 参与， 同时由葡萄糖氧化过程提供反应所需的能量。反应在 ph 为 7.5 条件下进行，6 d 后终止反应。l-草铵膦的收率仅 25%，ee 值为 89.2%。ooh3cph deactylase hohnoooo glutamate dehydrogenaseh3c p hoh3c hop+nh3oohohoonh2oooh cp3hohnad +h3c pnadh+ohhnhonh2gluconateglucoseoglucose dehydrogenase图 6谷氨酸脱氢酶催化合成 l-草铵膦图 4 脱乙酰基酶拆分 n 端乙酰化草铵膦衍生物制备 l-草铵膦1.2.3基于酰胺酶的拆分方法某些微生物体内的酰胺酶 (e.c.) 具有 立体选择性，可选择性地将外消旋酰胺中的某一对映体优先水解成相应的羧酸，因此在制备手性氨基 酸领域有着广泛的应用。w lothar 等11报道利用酰胺酶制备 l-草铵膦 的方法 (图 5)。他们利用从土壤中筛选到的 entero- bacter aerogenes 9164 l-酰胺酶水解 (r,s)-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺制备得到 l-草铵膦，同上述氨同化途径合成 l-草铵膦过程中，谷氨酸脱氢酶 的利 用效率 非常 低 ( 酶活 仅为 0.5 1u/mg)，产物收率低，而且辅酶 nadh 需再生，因 此，难以在工业化生产中应用。1.3.2基于转氨酶的生物合成法-氨基酸可由相应的-酮酸在氨基转移酶的催 化下，通过转氨作用生成。氨基转移酶是广泛存在 于生物体内的一类酶，催化的底物无严格的专一 性，不需要辅酶，所以，相对于谷氨酸脱氢酶，利4第 8 卷 第 3 期现 代 农 药用氨基转移酶的草铵膦制备工艺具有明显优势。研究草铵膦在土壤微生物体内的代谢途径时 发现，l- 草铵膦发生转氨作用被分解成- 酮酸2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸。转氨作用是 一个可逆反应，2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸也 可在转氨酶的催化下通过逆反应生成 l-草铵膦。由 此思路，a schulz 等13利用从 e.coli k-12 中分离到转氨酶，然后以 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，l-谷氨酸作为氨基供体，利用转氨作用生产 l-草铵膦 (图 7)，产物最高浓度可达 76.1 g/l。转 氨酶经固定化后安装至生物反应器，反应器的最高 产物生成速率为 50 g/(lh)，l-草铵膦的 ee 值超过99.9%。值较低，很难达到光学纯异构体的标准。因此，利用酶催化剂选择性高、专一性强和过程简单等优 势，开发一种简捷、高效、绿色的生物制备方法将 是今后生产 l-草铵膦的重要突破口和发展方向。从目前的工艺看，最具产业化潜力的生物法为 酰胺酶选择性水解法和转氨酶不对称合成法。但是 要实现工业化，还需在降低底物合成成本、底物及辅底物的回收利用、酶活力及立体选择性的提高和产物的回收利用等方面有较大突破。参考文献1kato h, nagayama k. isolation, structure and biological activity oftrialaphos j agricultural and biological chemistry. 1991, 55 (4):11331134.张宏军, 刘学, 张佳, 等. 草铵膦的作用机理及其应用 j. 农药科 学与管理, 2004, 25 (4): 2327.minowa n, hirayama m. asymmetric synthesis of (+)-phos-oocoooo2ohhonh2h3c p hoh3c p hoohohe.coli k-12 transaminasenh2o3phinothricin and related compounds by the michael addition of图 7 转氨作用制备 l 草铵膦glycine schiff bases to vinyl compounds j. bulletin of thechemical society of japan, 1987, 60: 17611766.可逆反应中存在着一个反应平衡，为使平衡向产物方向移动，提高转氨反应的转化率，就必须加 入过量的 l-谷氨酸，这既造成了原料的浪费，而且 未反应的 l-谷氨酸提高了产物的分离难度14。解决 这一问题的途径之一就是利用 l-天冬氨酸代替 l- 谷氨酸，l-天冬氨酸经转氨作用后生成草酰乙酸， 草酰乙酸易分解为丙酮酸，从而打破了转氨反应的 平衡。鉴于此，k bartsch15筛选取得了能够特异性 转化 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的草酰乙酸转 氨酶。当底物浓度为 552 mmol/l，高温 (80) 下 保温 4 h，在该草酰乙酸转氨酶的催化下，反应转 化率达到了 75%，l-天冬氨酸完全转化。4zeiss h j. enantioselective synthesis of both enantiomers ofphosphinothricin via asymmetric hydrogenation of -acylamidoacrylates j. 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