实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶.ppt

实验23琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 蚌埠医学院医学检验系武文娟 实验目的 掌握 电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶的基本原理 熟悉 电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的的操作过程 注意事项及对疾病诊断的临床意义 了解 琼脂糖凝胶电泳的临床应用 乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同 在一定的电泳条件下 使其在支持介质上分离 然后利用酶的催化反应进行显色 实验原理 1 巴比妥缓冲液 ph8 6 离子强度0 075 2 0 082mol l巴比妥 盐酸缓冲液 ph8 2 3 10mmol l乙二胺四乙酸二钠4 5g l缓冲琼脂糖凝胶5 8g l缓冲琼脂糖凝胶6 显色试剂7 固定漂洗液 试剂与器材 1 制备琼脂糖凝胶玻片2 加样用微量加样器加约40 l血清于槽内 3 电泳电压75v 100v 电泳30min 40min 4 显色5 固定和漂洗 操作步骤 1 目视观察在碱性介质中 ld同工酶电泳条带由正极到负极依次为 ld1 ld2 ld3 ld4和ld5 按各区带呈色的深浅 比较ld各同工酶区带呈色强度的关系 2 光密度计扫描用光密度计在570nm波长下扫描 求出各同工酶区带吸光度所占百分比 结果观察 3 在不具备光密度仪扫描条件下 如果需要进行定量 可将各区带切开 分别装入试管中 加入400g l尿素4ml 于沸水浴中加温5min 10min 取出冷却后以570nm波长比色 空白管则取大小相同但无同工酶区带的凝胶 用上述相同的方法处理 比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率 结果观察 吸光度总和 a总 a1 a2 a3 a4 a5 式中a1 a2 a3 a4 a5为各同工酶区带的吸光度各同工酶百分率 为 x 1 2 3 4 5 计算 健康成年人血清中ld同工酶百分比有下述规律 ld2 ld1 ld3 ld4 ld5 参考范围 1 ld同工酶电泳分析在临床上常用于急性心肌梗死的诊断 在急性心肌梗死时ld1与ld2活性均升高 但ld1升高更早 更明显 导致ld1 ld2比值增大 2 溶血性疾病 幼红细胞贫血症 肾坏死 以及假性肥大性肌营养不良 活动性风湿性心肌炎 急性病毒性心肌炎患者血清ld1和ld2的活性也可增高 临床意义 3 肝炎 急性肝细胞损伤时ld5增高 急性肺损伤 白血病 胶原病 心包炎以及病毒感染时ld2和ld3增高 4 胃癌 结肠癌和胰腺癌患者血清中五种ld同工酶均可升高 但以ld3增高最为显著 骨骼肌损伤时ld4和ld5增高 临床意义 1 严禁溶血 2 ld4与ld5 尤其是ld5 对热很敏感 因此底物 显色液的温度不能超过50 否则易使ld5等变性失活 3 ld4和ld5对冷不稳定 容易失活 应采用新鲜标本测定 如果需要 血清应放置于25 条件下保存 一般可保存2d 3d 4 pms对光敏感 故底物显色液需避光保存 否则显色后凝胶板背景颜色较深 注意事项 操作简便 重复性好 标本用量少 明显的溶血会导致假阳性 评价 1 ld同工酶测定时为什么要严禁溶血 为何测定ld的血清标本不能冰冻或冷藏 2 ld同工酶测定