（轻工技术与工程专业论文）上面ale啤酒研制及其关键酿造工艺研究.pdf

摘要 摘要 本论文主要研究了上面酵母发酵啤酒的酿造生产工艺，分别对酵母菌株的选择，酿 造过程中关键工艺进行了系统而细致的研究。在对小试结果优化的基础上，进行了传代 稳定性的试验，并且进行了感官品评和实际品尝，得到了评委和消费者的一致好评，一 致认可上面a l e 啤酒酯香醇厚，香味浓郁，口味独特。 通过对3 0 支上面发酵菌株的产酯能力和酿造性能的研究与分析，最终决定f s 1 7 ( 比 利时菌株) 作为酿造上面啤酒的菌株，该菌株具有产乙酸乙酯能力高、发酵速度快、还 原双乙酰时间短、发酵度比较高和产异戊醇低的优良特性。感官品评香气和口感较好， 泡沫洁白丰富，酯香突出，酒体协调感好。 通过实验确定了可靠的上面a 1 e 啤酒发酵的工艺，原料采用全麦发酵，酒花采用的 添加比例为5 0 香花，5 0 苦花；满罐酵母数为5 1 0 1 0 6 个m l ，主酵温度采用1 8 2 0 ，满罐后3 5 4 0h ( 4 5o p ) 的高泡液作为种酵母接种到下一罐。 通过总结分析三种不同浓度( 8o p 、l oo p 和1 1o p ) 上面啤酒小试实验的结果，最终确 定将上面啤酒的生产工艺放大到规模化的实际大生产中实施，全程跟踪检测的结果也表 明，小试试验的工艺基本能满足大生产的要求，生产出的上面啤酒可以达到预期的目标， 作为一种新的啤酒品种的技术储备积累了一定的实验数据。 关键词：a l e 啤酒；啤酒酵母；酿造工艺；传代稳定性 a b s 虹a c t a b s t r a c t t h eb r e w i n gt e c 王u l o l o g ya n dp r o c e s so f 触eb e e r 诚也t o pf e 唧e n t a t i o ny e a s tw 舔 r e s e a r c h e di 芏lt h i sp 印e r nw a ss t u d i e do nt h ey e a s ts t r a i n ss e l e c t i o na n dm ek e yb r e 埘n g t e c m c a lc o n d i t i o n ss y s t e m a t i c a l l ya i l dc a r e 伽l y t h ea 1 eb e e rw t l i c hw a sp r o d u c e d 晰t h l a 唱es c a l et r i a lw a sf a v o r a b l ew 【t 1 1i t sg o o ds m e l la i l d 咖i c a it a s t ea f t e rt 王1 es e n s o re v a l u a t i o n b y 吐l ee ) 币e r t sa n dc o n s u m e r sb a s e do n 畦1 eo p t i m i z a t i o no fs m a l ls c a l ee x p 幽e n t s t m i i lf s - 17 ( t l l e b e l g i a ns t r a i n ) w a sf m a l l ys e l e c t e da st h et o pf e 吼e n t a t i o nb e e r p r o d u c t i o ns t r a i na r e rm ee s t e r c o n t e n tw h i c hw a sp r o d u c e db y3 0s t r a i n sa r l db r e w 证g p e r f b 吼a n c ew a sa i l a l y z e da n dc o m p a r e d t h es e l e c t e ds 仃a i nh a dg o o dc h a r a c t e r i s t i c ，s u c h 淞 1 1 i g he t h y la c e t a t ec o n t e n t ，f a s tf e m l e n t a t i o ns p e e d ，s h o r tt i m ef o rd i a c e t ) ，lr e d u c t i o n ，1 1 i g h f e 肌e n t a t i o nd e g r e ea 1 1 dl o wi s o a i l l y lc o n t e n ta i l ds oo n t h ea r o m aa n dt a s t eo fb e e r p r o d u c e db yt b j ss t r a i nw a s9 0 0 d ，、i n lr i c ha 1 1 dw h j t ef o 锄a i l dc o o r d i n a t e dt a s t e t h ef e n l l e n t a t i o nt e c h l l i c 2 l ic o n d i t i o n so fa l eb e e rw a se s t a b l i s h e d 行o mt l l er e l i a b l e e x p 嘶m e n t t h er a wm a t e r i a lw a sb a r l e ym a l to m y ，h o p sw a sa d d e d 切t h ep r o p o r t i o no f5 0 a r o m ah o pa n d5 0 b i t t e rh o p y e a s tw a sp i t c h e d b y5 ot o1 0 o 1 0 6 札i nt 1 1 e 如l lt a n k t h e m a i nf e r m e m a t i o nt e i n p e r a t u r ew a s18 2 0 t h em a i nf e 衄e n t a t i o nl i q u i dw a st 1 1 ep i t c h e dt o n e x tf e m e n t a t i o nt 砌【a 俞e r3 5 4 0h o 砒sw i t h 向l lt 龇汰( 4 - 5o p ) t h ea l eb e e rp r o ( i u c t i o nw a se i d a 玛e dt ot h el 鹕es c a l ep r o d u c t i o nf i n a l l ya r e rt h er e s u l t o fs m a us c a l eo fa l eb e e rp r o d u c t i o n 、析t l lt 王l r e ed i a e r e n te x t r a c tc o n c e n t r a t i o nw a s s 呦砸z e da n da n a l y z e d nw a ss h o w nt h a tt l l ep r o c e s s i n go fs m a l ls c a l ew a ss a t i s f i e dw i t h t h er e q u e s to fl a 唱es c a l ep r o d u c t i o na 舭rd e t e m l i n a t i o nt h ew h 0 1 ep r o d u c t i o n t h ef i n a la l e b e e rw a sm e tt ot h er e q u i r e m e n t k e yw o r d s ：a l eb e e r ；b r e w e r s y e a s t ；b r e w i n gt e c l l l l o l o g y ；g e n e r a t i o ns t a b i l i 够 i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获 得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 签名： 至e 童羔：日期：2 。7 年。9 月1 。日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：越导师签名： 鸯武 j 期：2 0 0 7 年0 9 月1 0 日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 前言 啤酒是世界公认的营养食品，是长盛不衰的国际饮料。我国啤酒工业发展l o o 多年 来，已经成为生物食品产业中现代化程度高、示范性强、经济贡献率高的主导性行业。 我国啤酒工业年产量连续五年高居世界第一位，2 0 0 6 年我国啤酒工业产量持续大幅攀 升，啤酒产量实现3 5 1 5 1 5 万千升，比上年初报数增加4 5 3 5 9 万千升，增长1 4 8 2 ， 在饮料酒总产量中占7 6 9 ；利润总额达到4 6 2 4 亿元；税金总额达到1 4 0 1 1 亿元，高 于白酒等其它酒种，是葡萄酒的8 7 倍，黄酒的2 5 倍。 欧美等国家生产的啤酒都是在传统啤酒的基础上发展起来的，具有不同的典型性， 如上面发酵的白啤酒和小麦啤酒、干啤酒、低醇和无醇啤酒、冰啤酒等。国内大部分的 啤酒企业都是生产下面发酵啤酒，啤酒产品主要以大麦芽为主料、大米或淀粉为辅料的 淡爽型啤酒，而只有度数和包装上的差异，缺少真正具有典型特征的新型啤酒，产品品 种和风味多样化的态势还很单一，啤酒市场上产品结构需进一步优化产品的趋同性成了 中国啤酒行业发展的致命伤。 随着中国啤酒工业的发展，国内也相继开发研制了干啤酒、低醇和无醇啤酒、冰啤 酒，但上面发酵啤酒在市场上还很少见，上面发酵啤酒是由大麦芽和发芽小麦由一种典 型的“w 色i s s b e e r ”酵母酿造而成，这种酵母能将阿魏酸转化成4 乙烯邻甲氧基苯酚，它 能使啤酒产生一种特殊的酚味【l 】，它的研发和生产可以丰富啤酒的品种，提升啤酒消费 档次，给消费者带来清爽，香味浓郁，口味独特的，别具一格的新型啤酒。因此在啤酒 产品多元化方面，我们要开发出新的产品，满足消费者所对啤酒产品的消费需求，引领 我国啤酒行业的发展趋势。 1 2 国内外研究现状 国际上利用上面发酵制造啤酒的国家主要有英国，比利时、加拿大、澳大利亚等。 g o s s e l i n 【2 】等人曾对下面发酵和上面发酵的发酵速度进行过研究，下面发酵啤酒在低 温下发酵，大概1 0 1 4 ，发酵速度慢，啤酒具有明显不同的口味。淡色啤酒由上面发 酵酵母酿造，在室温发酵，大约l8 2 0 ，发酵速度快，啤酒具有典型的水果香气。 n e v e n 【3 】等人曾就酯酶对上面发酵啤酒乙酸酯类的影响做过研究，上面啤酒最突出 的风味特点是酯香味大，啤酒贮藏过程中酯的损失很大，尤其是乙酸异戊酯。其水解过 程可分为化学水解和酵母的酯酶酶解。酶的活性依赖于酵母细胞的溶解。他们认为今后 研究的方向应该从酵母菌株生理活性上进行修饰，使菌株的酯酶缺乏，保持上面发酵啤 酒独特的酯香。 d e n 百s 【4 】等人曾对比上面菌株勋c c 五甜d 彬y c 甜c e ，g y 括砌pm u c l3 8 4 7 5 和下面菌株 鼢c c 办a ，o m 弦2 sc 口厂厶6 9 ，舻煅西m u c l2 8 2 8 5 ，通过它们的电性、疏水性和表面化学组成解 释了它们的絮凝机理。酵母细胞凝聚性的机理现在还没有被完全认识，仍然是酿造界讨 论的话题。它是由众多因素决定的复杂过程。 江南大学工程硕士学位论文 在国内，上面发酵技术更广泛用于白啤酒和小麦啤酒酿造。我国对小麦啤酒的研制 起步较晚。国内小麦啤酒的定义为以小麦麦芽为主要原料( 占总原料量的4 0 以上) ，采 用上面发酵或下面发酵酿制的一种啤酒。 小麦没有皮壳，属裸麦，蛋白质含量较高，色度偏深，且常以高分子形式存在，又 是可溶性的，不能像大麦蛋白那样轻易分解和除去，在使用未发芽的小麦作原料时，在 粉碎、糖化和过滤的过程中存在一定的困难【5 1 ，这样会影响啤酒的胶体稳定性。没有皮 壳的特性导致在麦汁过滤时不能形成过滤层，而且小麦麦汁粘度高，还具有较细泥状物， 反而会堵塞过滤层，给麦汁过滤造成不利的影响。因此其成品酒的外观质量和保质期都 会受到不利影响【6 j 。据相关文献报道，小麦中的谷蛋白对爱尔啤酒混浊的形成有着直接 的原因。小麦谷蛋白被认为是混浊活性蛋白，当谷物蛋白含量较高时，所形成的不溶性 复合物由于颗粒太大而不能滞留于悬浮液中，这样就行成了大量沉淀物【刀oa s a i l o 3 】等人 发现小麦醇溶蛋白也和爱尔啤酒的混浊有着密切的关系，醇溶蛋白和多酚的浓度以及他 们的比例决定着形成混浊颗粒的大小【9 】和透光性【1 0 - 1 1 】。因此需要研究大麦芽和小麦芽的 比例对酿造的影响。1 9 8 7 年，烟台啤酒厂首先研制生产了以小麦麦芽为主要原料经上面 酵母发酵酿制的小麦啤酒，并制定了国内第一个“白啤酒 的企业标准；山东轻工业学 院的刘晔等 1 2 】，天津轻工学院的王兰等都对小麦啤酒的工艺进行过研究，但是都局限 于小试和中试，均没有大规模的投入生产。而且由于小麦本身的固有性质给小麦啤酒的 酿造工艺带来很高的要求。 1 3 上面发酵啤酒概述 1 3 1典型的上面发酵啤酒 典型的上面发酵啤酒有巴顿爱尔啤酒( b 嘛o np a l ea l e ) 、英国棕色爱尔啤酒( e n g i i s h b r o w na l e ) 、阿尔特啤酒( a l t b i e r ) 、科尔施啤酒( ko e l s c h ) 、柏林白啤酒( b e d i n e rw e i s s b i e r ) 和小麦啤酒( w e i z e n b i e r ) 。小麦啤酒又有含酵母和无酵母之分。 1 3 2 上面发酵啤酒的特点【1 4 】 ( 1 ) 、上面发酵系采用上面酵母，是在较高的温度( 1 5 2 0 ) 下进行的。酵母起发 快，接种量可以减少，形成的酵母新细胞较多。发酵终了，大部分酵母浮在液面，酵母 回收工作虽较下面发酵复杂，但酵母使用代数远较下面发酵为多，长久没有衰退现象。 ( 2 ) 、发酵结束后，酵母成紧密的一层浮在液面上，厚为3 4c m 。优良的酵母，其 酵母层具有褶皱状的外观。 ( 3 ) 、上面发酵一般不采用后发酵，主发酵度接近最终发酵度，去除酵母后充二氧化 碳使达饱和。若采用后发酵，下酒时酒液中保留部分残糖，继续发酵，产生的二氧化碳 饱和在酒中。 ( 4 ) 、上面发酵酿制的啤酒成熟快，设备周转快，啤酒有独特的风味，但保存期短。 1 3 3 国外传统上面发酵啤酒的主要工艺方式【1 5 】 ( 1 ) 、传统的敞口槽发酵 以柏林白啤酒为代表。冷却后的热麦汁接入上面酵母在敞口槽内进行发酵，温度 4 2 0 ，最高可达2 4 ，发酵4 5d 后，残糖可达3 5 5 o ，导入混合罐，添加麦 2 第一章绪论 汁或1 0 的高泡酒( 融u s e ) 混匀后装瓶，1 5 - 2 0 在瓶中完成后酵并生香味，酵母自行 沉淀，瓶内压力可达1 7p a ，冷却到7 1 0 贮存1 4 3 0d 即可销售。也有在主酵结束时 回收上面酵母，在混合罐内添加底面酵母及辅料后装瓶的。 ( 2 ) 、常压罐内发酵 麦汁经回旋沉淀槽、薄板冷却器，再经过浮选处理后接种上面酵母，导入锥形罐发 酵。发酵温度最高可达2 0 ，3 4d 用硅藻土过滤，酒液加入底面酵母在混合罐内混匀 装瓶，在瓶内完成后酵，并达到一定的压力。如果主酵结束后，导入冷却罐，加入底面 酵母后过滤装瓶的，所得的啤酒是不含酵母的小麦啤酒。 ( 3 ) 、加压罐内发酵 前酵和后酵分别在两个压力罐中进行，前酵温度1 6 左右，等降糖到5 封罐保 压2d ，降温到o 回收酵母，发酵液进入另一压力罐保温保压，3d 后装瓶。 ( 4 ) 、单罐发酵 与现在流行的底面发酵单罐法相似，属于较为现代化的小麦啤酒工艺，麦汁接种上 面酵母后，进行浮选除去冷凝固物，同时充氧繁殖酵母，导入同一个锥形罐内进行前酵 和后酵。 由于设备条件，实际应用以上方法过程中操作繁琐，在发酵后期转接时酵母温度相 对较低，因此会延长停滞期。而高泡期的发酵液温度较高，酵母较活跃，将其用于转接， 几乎不见停滞期，就可进入对数增长期，且转接过程简单。鉴于以上原因，本研究中用 全麦麦芽，使用上面酵母进行一罐法发酵生产上面发酵啤酒，酵母转接采用高泡液转接。 1 4 立题背景与研究意义 上面发酵虽然在发酵外观、技术操作和发酵设备方面与下面发酵有所不同，但二者 的发酵机理是一致的。如今两种发酵方式在互相靠近，界限越来越淡化，二者融合成新 型的发酵方式是今后发展的方向【1 4 1 。上面发酵在国内主要用于小麦啤酒和白啤酒的酿 造，但是小麦芽本身固有的性质在酿造过程中带来很多不利，但是上面酵母在发酵过程 中起发快，接种量少，使用代数多的特点，对现代啤酒酿造来说具有很大的优势，它可 以使啤酒成熟快，设备周转快。因此研究上面酵母的一罐法发酵工艺有着一定的必要性， 因为这样可以利用现有的设备条件，缩短发酵周期。而且上面a l e 啤酒也具有自己独特 的风味，可以为广大消费者增加一个新品种。 1 5 本论文主要研究内容 本文围绕菌株和原料两条主线，进行了小试( 1 0 0l ) 和规模化( 1 2 0t ) 一罐法的发酵试 验，旨在制定出一套可行的一罐法生产上面发酵全麦啤酒的生产工艺，并解决上面发酵 酵母转接等问题，并生产出醇厚型风格、质量可靠的上面发酵啤酒。具体研究内容： 1 、上面发酵啤酒菌株的选择与性能研究 啤酒发酵的灵魂是酵母，而发酵工艺相对比较一致，由此筛选具有高产酯香，发酵 性能优良而且具有良好啤酒口感的酵母是开发上面发酵啤酒的关键。 试验首先针对中国食品发酵研究院菌株保藏中心保存的3 0 株来自于美国，法国， 德国，英国，比利时，加拿大，丹麦等国家的上面酵母菌株进行了大量的实验室规模的 江南大学工程硕士学位论文 培养和选择。通过对酿造特性的评价( 主要评价指标包括：l 、降糖速度；2 、还原双乙 酰能力；3 、发酵度；4 、采用气相色谱检测风味物质，尤其是以乙酸乙酯为代表的酯类 物质含量的高低；5 、口感风味品评) ，从中优选了综合指标良好的上面酵母菌株。 2 、上面发酵啤酒酿造工艺的研发与优化 根据设备条件，菌种性能，通过调整对酵母发酵温度、酵母添加量，罐压，酵母转 接方式等发酵工艺参数，使最终产品酯香醇厚，酸度适中，理化指标达到国家优级啤酒 标准的要求，口感既具有上面啤酒的醇厚性，又能被国内消费者所接受。 3 、上面发酵啤酒规模化生产传代稳定性的研究 根据上面酵母回收及转接实验结果，进一步对高泡液转接传代的稳定性进行实验论 证。考察高泡液酵母转接传代后啤酒的风味稳定性和一致性问题，确定高泡液传代过程 中最佳转接时间，解决上面酵母转接传代稳定性的问题，为上面发酵啤酒进行大生产试 验做好充分的技术储备。 第二章上面发酵菌株的选择及性能研究 第二章上面发酵菌株的选择及性能研究 2 1 前言 酵母被喻为啤酒生产的“灵魂”，可见其在啤酒生产中的重要性，对发酵产品而言， 菌株往往对产品的组成、质量及风味起到决定作用。可以说酵母的特性在一定程度上就 决定了生产出的睥酒的性质。 上面发酵啤酒的发酵过程使用的是上面酵母( 顶面酵母) ；下面酵母又称底面酵母 或贮藏酵母。下面酵母是在不断变化的外界因素影响下，由上面酵母演变而来的。上面 发酵酵母的特点是侧面形成芽簇。上面酵母和下面酵母的区别还在于呼吸代谢、发酵和 增殖最适环境条件、上浮情况以及发酵现象等方面，上面酵母的最适培养温度为2 8 ， 发酵温度也很高，一般在1 8 2 0 ，而下面酵母的最适培养温度为2 5 。对棉子糖的 发酵能力不同。上面酵母能将棉子糖分解为蜜二糖和果糖，只发酵1 3 果糖部分；下面酵 母则能全部发酵棉子糖( 1 6 】。上面酵母表面蛋白质组分高，疏水性强【1 7 】。上面酵母、下面 酵母带电性不同，遵循不同的絮凝机制【4 】，上面酵母的凝聚性很弱或不凝聚，而下面酵 母的凝聚性很强。二者所形成的产品在糖类、酯类的组成，尤其是芳香类物质组成方面 有着显著的差别【j 。 上面发酵啤酒的最典型的特点就是酯香突出，因此选择具有高产酯香，发酵性能优 良而且具有良好啤酒口感的酵母是开发上面发酵啤酒的关键。因此就产乙酸乙酯的能力 高，降糖速度快、双乙酰还原速度快、发酵度高、和产高级醇低的指标，对中国食品发 酵研究所工业微生物菌株保藏中心的3 0 支上面菌株进行了三角瓶发酵试验，最终选出 一支综合指标好的菌株。 为了进一步对实验菌株做个全面的了解，我们对实验菌株进行了酵母细胞形态和巨 大菌落形状的观察、酵母细胞的大小测量、糖类发酵试验、死灭温度、絮凝性和耐酒精 的生理生化特性试验。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验菌株 中国食品发酵研究院菌株保藏中心保存的3 0 支来自于美国、法国、德国、英国、 比利时、加拿大、丹麦等国家的上面酵母菌株。 2 2 2 主要试剂 邻苯二胺天津科密欧化学试剂开发中心 正丁醇 a c r o so g a n i c s o 1 美兰染色剂 北京益利试剂有限公司 2 2 3 主要仪器、设备 a 西l e n t 6 8 9 0 气相色谱仪美国a 酉l e n t 公司 a n t o np a a rd m a 4 5 0 0 型啤酒检测仪奥地利a m t o np a a r 公司 o l y m p u sc x 一4 1 型显微镜 日本奥林巴斯公司 江南大学工程硕士学位论文 低温生化培养箱 双乙酰蒸馏装置 5 0 0l n l 三角瓶( 配有配套的发酵拴) 沙多利斯纯水器 2 2 4 分析方法 日本三洋公司 北京玻璃仪器厂 北京玻璃仪器厂 德国沙多利斯公司 a 、酵母计数、出芽率和死亡率的检测 从麦汁培养液中吸取1m l 菌悬液，用蒸馏水稀释2 0 倍。充分混匀后，取稀释液用血 球计数板在4 0 0 倍显微镜下数出酵母数。同时，观察酵母细胞形态。如遇到芽体大小超 过细胞本身5 0 时，不作芽体计数而作酵母细胞计数。 在载玻片上滴一滴美兰染色剂，再在美兰上滴一滴菌液，充分混匀，盖好盖玻片。在 4 0 0 倍显微镜下选取1 0 个视野，计数已变蓝的细胞与未变蓝的细胞，计算酵母的死亡率。 b 、发酵度的测定 实验室三角瓶发酵采用c 0 2 失重法，用电子分析天平目称量，以发酵液失重的c 0 2 总失重克数表示发酵速率。发酵采用每天测量发酵液的外观浓度，以外观浓度的变化表 示发酵速率。发酵结束后用a n t o np a a rd m a 4 5 0 0 型啤酒检测仪进行检测发酵度，发酵 液测定前要对样品进行除气处理。 c 、双乙酰的测定 参照国标g b t4 9 2 8 2 0 0 l 啤酒分析方法中笫1 3 项啤酒双乙酰分析方法进行测定。 d 、风味物质的检测 ( 1 、仪器 h p6 8 9 0 毛细管气相色谱仪( 美国安捷伦公司) ，f i d 检测器，h p7 6 9 4 e 顶空自动进 样器，h p 气相色谱化学工作站。 ( 2 ) 、色谱条件 毛细管色谱柱( d b w 舣e t r3 0m 0 5 3m mi d ，膜厚1 op m ) ；柱温：起始温度3 5 ， 以l o m i n 程序升温至1 5 0 再以2 0 r i l i n 升温到1 8 0 ，继续恒温5m i i l ；进样 口温度：1 5 0 ；检测器温度：2 0 0 ；载气为高纯氮气，流速为5m m n i n ；氢气3 0 m l n l i n ；空气4 0 0m l m i n ；采用分流进样，分流比为l ：l 。 ( 3 ) 、样品制备 啤酒于5 冷藏，量取5m l 酒液于2 0m l 项空瓶中，添加2 0 叽正丁醇溶液0 1 0m l ， 加密封垫及铝盖密封，振荡混匀以供顶空气相色谱测定。 e 、凝聚性测定 a 、本斯值的测定：将试验的上面酵母菌接于麦芽汁发酵瓶中，2 5 培养7d ，称取5g 沉淀上面酵母泥于3 0m lo 0 5 l 的硫酸钙溶液中，洗涤、离心( 3 5 0 0r m i n ，1 5m i n ) 2 3 次，收集上面酵母细胞。取上面酵母泥，准确称重1 og ，放于锥底有刻度离心管中，然 后加入1 0m l 含硫酸钙、p h 值4 5 醋酸缓冲液( o 5 lg 水合硫酸钙+ 6 8 0g 醋酸钠+ 4 0 5g 冰醋酸，溶解后，定容1l ) ，摇匀，使其成悬浮状态。在2 0 水浴中静置2 0m i n ，再 将此悬液连续摇动5m i n ，使上面酵母重新悬浮，再静置，在2 0m i n 内每分钟记录一次 6 第二章上面发酵菌株的选择及性能研究 沉淀上面酵母菌的容积。一般，将1 0i i l i n 时上面酵母菌沉淀的容积为本斯值。通过此 值可估计上面酵母菌的凝聚性，沉淀容积为1 0m l 以上者为强凝聚性。实验前后要求 悬浮液的p h 值不变。 b 、凝聚值的测定【2 0 】：取上面酵母泥，准确称重1 og ，用o 0 1 的e d t a - n a 洗涤、离心 数次，沉淀注入5 0m l 的具塞比色管中，加入5 0m l 的含硫酸钙、p h 值4 5 醋酸缓冲 液( 0 5 1g 水合硫酸钙+ 6 8 0g 醋酸钠+ 4 0 5g 冰醋酸，溶解后，定容1l ) ，震荡摇匀后， 立即在6 7 0 n m 下测定o d l 值( 光密度) ，于2 0 水浴中静置3 0m i n 后距离液面lc m 处吸取液体测得o d 2 值：凝聚值f = ( o d l 0 d 2 ) o d l l o o 2 2 5 实验方法 a 3 0 株上面酵母菌株的产酯能力 将3 0 株上面酵母菌株( f s 1 f s 3 0 ) 进行三角瓶发酵试验。发酵8d 后，风味物质的 测定，并以乙酸乙酯作为评价的指标，初选出适合酿造上面发酵啤酒的酵母菌株。 具体实验过程如下； 斜面菌株接种- 环到1 0m l 麦汁的试管中( 2 5 ，2 4h ) 斗取lm l 到 装有1 0m l 麦汁的试管中( 2 3 ，2 4h ) 全部倒入装有1 5 0m l 的三角瓶中( 2 0 ， 2 4h ) 全部倒入装有6 0 0m l 的三角瓶中分装成两份，加上发酵栓，2 0 发酵8d 。 发酵过程中每天摇瓶称重，计算c 0 2 失重。 在实验过程中注意无菌操作，三角瓶发酵期间每天摇瓶两次，在发酵旺盛期间摇瓶 时不要太剧烈，以免发酵液溢出三角瓶。 b 研究优选的上面菌株的发酵性能 针对实验室优选出来的4 个菌株在实验室进行发酵实验，在发酵过程中，跟踪检测酵 母增殖、死亡率和出芽率的变化情况、外观糖度利用情况、双乙酰还原情况，了解优选 菌株的酿造性能，发酵结束后检测风味物质，并对酒液进行感官品评。进一步选出适合 酿造上面发酵啤酒的酵母菌株。具体实验方案如下： 斜面菌株接种一环到1 0m l 麦汁的试管中( 2 5 ，2 4h ) 寸取1m l 装 有1 0m l 麦汁的试管中( 2 3 ，2 4h ) 二_ 全部倒入装有1 5 0m l 的三角瓶中( 2 0 ， 2 4h ) _ 全部倒入装有2 0 0 0m l 的三角瓶中采用1 8 恒温发酵，待降糖完成后，在 无菌室装瓶、压盖继续于1 8 恒温发酵，待双乙酰还原后降温，每天打开一瓶检测外 观糖度、双乙酰含量、酵母数，死亡率和出芽率，发酵结束后检测发酵度和风味物质。 c 上面酵母菌株的生理生化特性的研究n 明 a 形态观察 将上面酵母细胞菌悬液做成涂片置于显微镜上，选用1 0 0 1 0 倍油镜观察细胞的形 态并拍下照片。 b 大小和体积的测定 将上面酵母培养液做成涂片，置于显微镜下用测微尺测量上面酵母细胞的长轴和短 轴占目镜测微尺的格数，然后按放大倍数换算出菌体的实际长度( 在同一个标本上测量 5 1 0 个酵母细胞，取其平均值) 。 7 江南大学工程硕士学位论文 c 巨大菌落的观察 将上面酵母接种到麦汁培养基表面的中央，植点要圆，接种后用无菌纸包好，外面 再包裹一层铝箔纸，在2 5 下保温培养4 周后观察并拍照。 d 上面酵母对糖类的发酵试验 将无糖基础液，分装于含有杜氏管的试管中，o 1m p a 灭菌1 5m i n ；测试的糖类分 别用无菌水配成1 0 的溶液，煮沸1 5m h l ，待冷却后，用无菌移液管移取一定量的糖液 分装于杜氏管内的无糖基础液中，使最终培养液糖浓度达到2 ( 其中棉子糖加倍) ，溶液 必须高过杜氏管并保证杜氏管内无气泡；将新鲜的菌株接于发酵管中，2 5 2 8 培养， 每天观察结果。 e 上面酵母的死灭温度 死灭温度是指液态培养的微生物，在某温度下1 0m i n 即被杀死，此温度称为微生 物的死灭温度。取盛有5m l 的灭菌麦芽汁试管一组，每管用无菌吸管接入用麦芽汁培 养2 4h 后的上面酵母悬液o 1m l ，取已接种的试管3 支浸入5 0 水浴中保温，其中1 支试管中插入温度计，另两支不插，当插温度计的试管温度达到5 0 时，开始记录时 间，并保持1 0m i n ，立即拿出，放到冷水中冷却。然后用同样的方法测定其它温度 5 l 、5 2 、5 3 、5 4 、5 5 和5 6 将各组试管置2 5 培养箱中，培养一周 后观察是否有发酵现象。 f 上面酵母絮凝性试验 酵母的凝聚性是区别菌株的一种重要检测内容，因为凝聚性不同，酵母的沉降速度 就不同，发酵度也有所差异。 g 上面酵母耐酒精能力试验 取已灭菌试管数支，以无菌操作按表2 1 乙醇的配制浓度添加无菌麦芽汁培养基及 9 5 乙醇。摇匀，接种供试上面酵母菌株1 2 环，每一乙醇浓度平行2 支，另各留一 支空白管( 未接种) 作对照，2 5 培养随时观察发酵现象。若气泡产的时间越早，发酵量 越大，说明上面酵母的耐酒精能力越强。 表2 ：1 乙醇的配制浓度 a b l e2 1t h ep r e p a r a t i o no f e t h a n o l 2 3 结果与讨论 2 - 3 13 0 支上面酵母菌株的性能指标对比 酯香醇厚是上面发酵啤酒最独特的风格，因此选择菌株时产酯的能力高是最重要 的，因此我们在选择菌株的时候首先以产酯能力对3 0 支酵母菌株进行选择，图2 1 是 3 0 支菌株产乙酸乙酯的对比图。 第二章上面发酵菌株的选择及性能研究 hnn _ t oh 西odn_hoohn 畸h o 厶厶厶厶厶厶厶厶厶7 下777 下下777 罕叩甲甲叩甲甲甲甲甲叩 凶臣皿k 皿k 臣1 2 2 2 臣 2 蟹给1 2 蟹臣臣臣臣1 2 臣臣1 2 臣筮 2 菌种名称 图2 13 0 支菌株产乙酸乙酯的对比图 f i g 2 - 1t h ec o m p a r i s o no f 3 0s t r a i n sw i t he t h y la c e t a t ep r o d u c t i o n 从柱状对比图可以看出，3 0 支菌株产乙酸乙酯的能力是有些差异的。产乙酸乙酯的 能力较高的菌株有f s 1 7 产酯能力为3 2 6 2 9m g l ，f s 3 为2 9 1 0 9 m g l ，f s 1 为2 8 7 5 4 m g l ， f s 一1 4 为2 8 7 17m g l 。 适量的酯含量会给啤酒带来一定酯香味，并使酒体丰满、协调，如果过量会带来不 愉快的异香，同高级醇相比，酯的阈值比较低，为3 0m l ，当浓度发生微小的变化时 就会很可能带来风味物质上的变化，总高级醇含量反映酒体的协调性，过高会使人上头， 过低会使酒体寡淡，因此合适的醇酯比可以保持啤酒整体酒体的协调性，因此酯含量的 控制要辅以发酵性能指标和感官品评来确定适当的含量。 2 3 2 优选的上面菌株发酵的性能分析 a 外观糖度和双乙酰还原的性能分析 在4 支优选菌株( f s 1 、f s 3 、f s 1 4 和f s 1 7 ) 发酵过程中，跟踪检测外观糖度和双 乙酰的变化数值见表2 2 。 表2 24 支优选菌株的外观糖度和双乙酰的跟踪检测结果 t a b l e2 2t h er e s u l t so f 印p a r e n ts u g e rd e g r e ea n dd i a c e t y lo f 4o p t i m i z a t i o ns 舰i n s 从表2 2 可以看出，4 支菌株的降糖速度顺序为f s 3 f s 一1 7 f s 1 f s 1 4 ，f s 3 、 f s 一1 和f s 一1 7 都可以在3 d 内就可以降糖到4 。p 左右，f s 1 4 略慢一些，要4d 左右； 双乙酰是衡量啤酒成熟与否的决定性指标，4 支菌株以f s 一1 7 的还原双乙酰情况最好， 9 辐 ； 筋 加 坫 加 5 0 1)冁扣瑶fz整fz 缸南大学i 程硕士学位论文 都在4d 就可以降到00 8m g ，l 以下。双乙酰还原结束时间基本与降糖结束时间同步， 这进一步说明，上面酵母一般在主酵完成时就已经完成了发酵。4 支菌株在第4 d 基本 上就已经完成了极限发酵，4 d 以后发酵度基本保持不变。 b 菌株增殖的性能分析 在4 支优选菌株( f s - 3 、f s 1 4 和f s - 1 7 、f s 1 ) 发酵过程中，跟踪检测酵母增殖、死 亡率、出芽率的变化曲线图，以评价它们的酵母增殖性能，变化曲线见图2 心3 。 6 0 0 0 5 0 0 0 24 0 0 0 嘉3 0 0 0 # 2 0 0 0 1 0 0 0 图2 2 优选菌株酵母增殖变化曲线图2 0 优选菌株酵母死亡率变化曲线 f 唔2 0 t h e 洲eo f p r o p a g a l l o n o f 40 p l i e i o nf 2 3 t h e 洲eo f d c a i h 嘣eo f 4o p l i m i z m l o n s a m s5 昀m s 从图22 23 可以看出，4 支上面酵母均在第4d 达到高峰值，第5d 开始逐渐降低， 但从悬浮性来看，f s - 3 和f s ，1 7 的悬浮性更强一些，要1 5d 以后才降到两千万以下。4 支菌株死亡率的变化都很正常。死亡率都是随着发酵的进行先降低然后逐渐升高。 c 风味物质的分析与讨论 发酵结束后乙酸乙酯、高级醇和乙醛含量的对比情况见图2 4 也6 。 3 5 3 。 毫2 5 e d z 0 塞1 5 墓z o 目5 o川 图2 4l 酸0 酯含量的对比囤 f 1 92 - 4 t h e c o m p “i s o n o f e f h y la c e l a f ec o n l e 【n 图2 5 异戊醇含量的对比图 融2 t 5 t h ec o m p a no f m 8 q ia l c o h o lc o n t e n t 尹 0 i 5 0 5 0 i l i 一41l￥2 第二章上面发酵茁株的琏择及性能研兜 汀山 图2 6l 醛含量的对比图 啦2 6 t h c c o m p a r i s o no “d e h y d ec o m e m 从图2 4 26 可以看出，经过发酵以后，4 支优选菌株的产乙酸乙酯的能力以f s 1 7 稍高i 生成异戊醇的含量以f s 1 7 稍低，乙醛含量均在阈值( 1 0m g 以下。 d 感官品评 对于4 支菌株的发酵液进行感官品评( 共有1 0 位评委进行暗评，然后将结果汇总， 以评价4 支酵母发酵液的风味与口感) ，结果见表23 。 表2 34 支酵母发酵液的品评结果 t 曲l e2 _ 3 t h e t 拈k o f b 邢e n i m j o n i j q u o ro f 4 ”a 啦 酵母名称 综合评价 泡沫洁白细腻，酯香一般，苦味纯正，口感较好 泡沫洁白稍粗糙，谁郁酯香，系口力强，口感干净协调 泡沫细腻好，酯香较好，口感纯正，杀口力强 泡棘洁白丰富，酯香较突出，杀口力强，口感干净协调 从对4 支酵母菌株模拟发酵的酒液的品评结果可以看出，酵母菌株f s 一1 7 的口感综 合评价最好，鉴于它的综合性能指标也优于其它菌株，所以堆终选定f s 1 7 为上面发酵 实验用的菌株。 2 3 3 实验用上面酵母菌株的生理生化特性的研究结果 震 图2 8f s 1 7 苗株的巨大苗落 f 1 92 - 8g r a n tc 0 1 0 ”yo f f s1 7 江南大学工程硕士学位论文 f s 1 7 菌株的显微镜下的形态及巨大菌落形态分别见图2 7 和图2 8 所示。从图中 可以看出，实验用上面酵母菌株的细胞镜检结果为圆形，长短轴基本相等，多形成芽簇， 细胞壁均匀，折光性适中。在麦汁培养基上培养，酵母巨大菌落形态为圆形，成半透镜 状凸起。 b 其它特性 实验用上面酵母菌株在显微镜下用测微尺测量细胞的大小为6 1 0 5 9p m 。对糖 的发酵结果为葡萄糖( + ) 、d 果糖( + ) 、麦芽糖( + ) 、蔗糖( + ) 、密二糖( 一) 、纤维二糖( w ) 、 海藻糖( l ) 、麦芽三糖( l ) 、棉子糖( l ) 、松三糖( 一) 、a 一乳糖( - ) 、d 一半乳糖( - ) 、糊精( - ) 和可溶 性淀粉( ) 。死灭温度为5 3 5 4 。用本斯值法检测时不能明显看清沉淀的体积数，试管 底部都成混浊状态，用光密度改良法检测其凝聚值( f 值) 很低，f 值为2 9 1 。耐受的最 大酒精浓度为1 4 。 2 4 小结 通过对3 0 支上面发酵菌株的实验选择，确定f s 1 7 ( 比利时菌株) 为实验用上面酵母 菌株。该菌株具有产乙酸乙酯能力高、发酵速度快、还原双乙酰时间短、发酵度比较高 和产异戊醇低的优良特性。感官品评香气和口感较好，泡沫洁白丰富，酯香突出，酒体 协调感好。 1 2 第三章上面发酵啤酒生产工艺的选择与优化 第三章上面发酵啤酒生产工艺的选择及优化 3 1 前言 上面发酵啤酒的生产工艺包括糖化工艺和发酵工艺。主要考虑优化的参数有：酒花 配比、酵母菌株的最适添加量、最适发酵温度以及回收转接方式等。合理的糖化工艺对 制备麦汁质量起着至关重要的作用，而麦汁质量的好坏直接影响着酿造出的上面发酵啤 酒的质量。通过查阅文献，典型的上面发酵啤酒一般都采用浸出法、一次煮出糖化法或 二次煮出糖化法糖化麦汁【1 4 】。我们选用浸出法糖化工艺。香型酒花可以赋予啤酒特有的 香味，苦型酒花赋予啤酒爽口的苦味，适当的酒花配比，既可以降低生产成本，又可以 改善啤酒的风味和口感，提高啤酒的非生物稳定性。所以实验中设计了1 0 0 香花和5 0 香花加5 0 苦花的配比。 上面发酵啤酒采用上面酵母菌株，赋予其特殊的酯香。典型的风味物质主要来自代 谢产物，接种量只有达到一定数量时，才会有较高的起发强度，才会有突出的典型香气 【2 。提高接种量，还可以减缓低p h 、高渗透压及醇类含量高对发酵的不良影响【2 2 】。并 可以减少形状小的酵母在发酵液中的比例，有利于酵母的澄清【2 3 1 。虽然接种量低，有利 于高级醇和酯类物质的形成 2 4 1 ，但是醇酯比例要合适才可以保证总体上的口感协调，因 为高级醇含量过高会弱化其他风味物质【2 5 】，导致整体风味比较差。 上面菌株发酵与普通啤酒生产最大的区别就是高温发酵，因此如何在发酵时，使啤 酒保持其良好的品质和特殊的风格，温度是关键，天津轻工学院的程殿林等【2 6 】通过对不 同主酵温度实验( 1 8 、2 0 、2 2 、2 5 ) 的结果表明，随着温度的升高，降糖速 度加快，但酵母自溶增加，酸度上升。因此参照文献，试验中对酵母的不同添加量和不 同的主酵温度作了研究。 上面酵母因为悬浮性比较强的特点，传统回收酵母的操作方法在发酵结束后用撇沫 法【1 4 】回收，但是我们采用的大罐封闭发酵，利用此方法不具有可行性；山东轻工业学院 的董晓雷等采用加压发酵技术降温后将酵母沉于发酵罐底，从锥底回收【2 7 1 ，但激冷会对 酵母的活性产生影响，转接时会延长延迟期。 考虑到投入连续大生产以后会引发关于酵母回收及转接的问题，进行了酵母转接与 回收的实验。为了缩短酵母在转接过程起发的延迟期，在小试( 1 0 0l ) 研究了使用高泡液、 锥底酵母和泡盖酵母转接传代进行发酵的试验对比，确定上面酵母转接的最佳方式。 3 2 材料与方法 3 2 1 材料与菌株 加麦芽和澳麦芽均有燕京啤酒集团公司麦芽车间提供。 比利时上面酵母菌株由中国食品发酵研究院菌株保藏中心提供。 3 2 2 主要试剂 同2 2 2 。 3 2 3 主要仪器、设备 江南大学工程硕士学位论文 l o ol 啤酒生产小试设备 哈尔滨汉德酿造设备有限公司 3 2 4 分析方法 同2 2 4 。 3 2 5 实验方法 a 研究酿造过程中的关键技术 a 研究原料配比和酒花的添加比例 表3 1 工艺设计表 t a b l e3 - 1t e c h n o l o g i c a ld e s i 印 首先将上面酵母菌株进行活化、扩培，采用表3 1 的工艺设计表进行11o p 发酵， 麦汁满罐后自然升温至1 8 ( 士0 2