毕业论文--一株真菌产生的细胞松弛素类代谢物的研究.docx

中文摘要真菌的品种繁多，结构多样，是自然界的重要资源,也是结构多样性天然产物的宝库。很多真菌都有药用价值，从真菌中开发得到的药物有很多。球毛壳菌是一类重要的真菌，从该属中发现的各种活性良好的化合物有很多。细胞松弛素类是其中很重要的一类化合物，具有十分显著的抗肿瘤、抗炎等生物活性。研究球毛壳菌所产生的细胞松弛素类代谢物具有十分重大的意义。本文以天然产物化学为基础进行研究，利用微生物发酵技术，有机溶剂萃取技术，柱层析分离纯化技术对毛壳菌的次生代谢产物进行提取、分离、纯化，最后经过质谱和核磁共振波谱，鉴定出了两种化合物的结构。经过数据分析和文献比对，最终确定了这两种都是已知的细胞松弛素类化合物，其名称分别是： Cytochalasin N 和 19,20-Epoxycytochalasin Q。关键词：球毛壳菌 细胞松弛素 分离纯化 结构鉴定IIIABSTRACTFungi with abundant species and diverse structure has been proved to be an important source of nature and a huge source of structurally diverse natural products. Many fungi have medicinal value, there are a lot of drugs have been developed from fungi. Chaetomium is a class of important fungi, moreover, a variety of bioactive secondary metabolites has been discovered from this genus. Among them, cytochalasins is a valuable family. Many of the compounds possess significant biological activities, such as antitumor, anti-inflammatory and other activities. So it is of great significance to study the cytochalasins produced by Chaetomium.In this paper, based on the natural product chemistry, the secondary metabolites of Chaetomium were extracted, separated and purified by microbial fermentation technology, organic solvent extraction technology, column chromatography and purification technology. And finally the structures of two compounds were identified by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. After data analysis and literature comparison, these two have been identified as two known cytochalasin compounds, their names are: Cytochalasin N and 19,20-Epoxycytochalasin Q.Key words: Chaetomium cytochalasin purification structure identification目录第1章：前言1第1节 细胞松弛素类代谢物的研究概况11.1球毛壳菌的研究概况11.2细胞松弛素类化合物的研究概况11.3球毛壳菌产生的球毛壳素的研究概况2第2节 分离纯化技术42.1凝胶柱层析42.2硅胶柱层析52.3反相柱层析52.4薄层层析（TLC）5第3节 物质结构鉴定的主要技术63.1 质 谱 （MS）63.2核磁共振波谱（NMR）63.3紫外-可见吸收光谱（UV-VIS）63.4红外光谱6第4节 研究的背景和意义74.1研究背景74.2研究意义7第5节 研究方法和路线8第2章：菌株筛选、液体发酵及产物富集9第1节 菌株筛选91.1 实验材料、试剂及仪器91.2 菌株活化、筛选9第2节 液体大批发酵112.1实验材料、试剂及仪器112.2大批发酵11第3节 发酵产物提取，萃取123.1实验材料、试剂及仪器123.2代谢产物的提取123.3石油醚和乙酸乙酯萃取12第3章：毛壳菌次生代谢产物的分离纯化141.1实验材料、试剂及仪器141.2乙酸乙酯部分的分离纯化14第4章：结构鉴定171.1实验材料、仪器171.2结构鉴定结果17第5章：实验结果及讨论191.1实验结果191.2讨论19致谢21参考文献22第1章：前言第1节 细胞松弛素类代谢物的研究概况1.1球毛壳菌的研究概况真菌是自然界一个很大的类群，是结构多样性天然产物的重要源泉。青霉素的发现使现代医学得到了突破性的进展。而从红豆杉内生真菌中分离得到的紫杉醇，更是让人们认识到了真菌的重要性1。球毛壳菌属(Chaetomium Kunze)是真菌毛壳菌科Chaetomiaceae(子囊菌亚门 Ascomycota)家族中的一个大属，是一类很重要的微生物2,3。球毛壳菌的分布十分广泛，全世界范围内均有分布，大部分存在于土壤、植物残体中4。球毛壳菌被公认为是结构多样性活性天然产物的宝库。迄今为止，已经有两百多种化合物从该属中被分离出来，其中大部分是活性良好的新型化合物，如生物碱、色酮、甾体化合物、吡喃酮、氧杂蒽酮、蒽醌酮、萜类化合物等5-7。1.2细胞松弛素类化合物的研究概况生物碱（Alkaloids）是一类存在于自然界中的含氮的碱性有机化合物，有似碱的性质，所以过去又称为赝碱。 大多数生物碱有复杂的环状结构，具有十分显著的生物活性，是中草药的重要活性成分之一。细胞松弛素（Cytochalasans）是一类活性良好的生物碱，这个家族中有很多化合物有植物毒、抗菌和细胞毒活性8。此外，一些细胞松弛素抑制胆固醇合成9或干扰葡萄糖转运10和激素释放11。他们的名字的起源于希腊语kytos（细胞）和chalasis（放松，松弛），指出了细胞松弛素最重要的特性封闭肌动蛋白12。结果，胞质分裂被有效抑制，而有丝分裂保持不受影响，从而产生巨大的多核或更高浓度下产生的去核细胞。这些性质13被用于分子和细胞生物学研究，特别是在细胞成像方法，细胞骨架和细胞周期研究中14。在自然界中，细胞松弛素在真菌毒性和食物腐败中起关键作用，也可能参与维持植物-真菌的共生关系 15,16 。241.3球毛壳菌产生的球毛壳素的研究概况毛壳菌能够产生的抗生素有球毛壳素、球毛壳菌素、卵孢菌素和毛壳素等 17,18。球毛壳素类化合物是来自球毛壳菌次生代谢产物中的一类很重要的化合物，属于细胞松弛素类中的一大类，它们对细胞具有很强的生物活性19,20。Sekita 首次从球毛壳菌（Chaetomium globosum）中分离得到了两种具有生物毒活性的化合物chaetoglobosins A (1) 和 B (2)。在chaetoglobosin 家族中Chaetoglobosin A是被研究最多的化合物。程敬丽等从一株球毛壳菌的发酵产物中分离得到了Chaetoglobosins A，活性测试的结果显示 Chaetoglobosins A对立枯丝核菌和腐霉菌等有很强的抑制效果21。 Aggarwal等发现 Chaetoglobosins A对小麦黄斑叶枯病菌（Drechslera tritici）有很强的抑制效果。 Chaetoglobosins A是一种很有潜力的新型广谱杀菌剂22。Jiao 等从球毛壳菌的发酵液中分离得到了 9 种化合物，包括 3 个新化合物 chaetoglobosins Q (3)，R (4) 和 T (5), 6 个已知化合物，这些化合物均具有细胞毒活性23。Ding 等从白茅的健康茎杆内生菌 Chaetomium globosum IFB-E019 的固体发酵物中分离得到一个新的细胞毒性生物碱 chaetoglobosin U (6)24。Zhang 等用活性追踪的方法从内生菌 Chaetomium globosum 的固体发酵物中分离得到了 2 个新的生物碱 chaetoglobosins V (7) 和 W (8)25。Cui 等从海洋绿藻孔石莼中分离到的内生真菌 Chaetomium globosum QEN-14 的发酵物中分离和鉴定了 7 个新的 cytochalasan 衍生物 cytoglobosins A-G (9-15)，以及2 个同类化合物 isochaetoglobosin D (16) 和 chaetoglobosin Fex (17)26 。第2节 分离纯化技术2.1凝胶柱层析凝胶柱层析主要是利用其分子筛的作用，又被称为排阻层析。凝胶颗粒由胶体溶液凝结而成，颗粒中间有孔洞。其洗脱的原理在于不同的化合物有不同的分子结构，分子量大小各异，小分子能够通过凝胶颗粒中间的孔洞，而大分子只能从凝胶颗粒中间的缝隙通过；所以同样的柱子，不同分子大小的化合物行走的路径却不同，小分子行走的路径更长，受到的阻力更大，而大分子受到的阻力小，再加上有洗脱剂的推力，就造成了大分子物质先被洗脱下来，而小分子物质后被洗脱下来，从而将分子量不同的化合物分离开。凝胶柱的洗脱剂，通常是一种，但是有两种不同极性溶剂梯度洗脱的话，可能能达到分子筛和反相共用的效果，会有更好的分离效果。但是要注意，洗脱剂的密度不能高，否则凝胶凝胶漂起来的话，就达不到分离的效果了。2.2硅胶柱层析硅胶柱层析的原理在于硅胶颗粒对不同极性的物质吸附效果不同，从而将不同极性的物质分离开。一般来说，硅胶比较容易吸附极性大的物质，而比较难吸附极性较小的物质。用两种或是两种以上的不同极性的溶剂配置的洗脱剂，按照极性从小到大的顺序进行梯度洗脱，从而达到将不同极性物质按照不同的洗脱时间洗脱下来，分离开的目的。硅胶柱的上样方法通常有两种：干法上样和湿法上样。干法上样相比湿法上样分离效果更好，但是同样因为之前的拌样，使得化合物和硅胶颗粒的吸附较强，从而会损失不少样品。如果样品的量比较少的情况通常不适合用这种方法。2.3反相柱层析反相是相对于“常相”来说的，反相的固定相是在硅胶颗粒表面键合一种高碳的疏水基团，固定相比流动相更疏水。硅胶层析是基于溶质分子和疏水配基间的疏水相互作用来进行分离。 流动相通常用到甲醇和水的组合或是乙腈和水的组合。反相层析通过梯度洗脱来达到分离纯化的目的：梯度通常从相对亲水（高水含量，低有机溶剂含量）到相对疏水（低水含量，高有机溶剂含量）进行。反相层析具有极高的分辨率，可以将只有微弱疏水差异的组分分离开来。2.4薄层层析（TLC）薄层色谱的应用贯穿于整个提取、分离、纯化的每一步。薄层色谱是将250目的硅胶（GF-254 ）均匀平铺在铝板或是玻璃板上形成的一种色谱。薄层色谱的原理同硅胶色谱没有什么分别，但是不同的是，一个是柱色谱，一个是薄层色谱，硅胶分离的样品从柱子中流出装在不同的小瓶中，而薄层色谱的样品停留在色谱板的不同位置。薄层色谱可以用来分离，也可以用来进行分离效果以及物质纯度的检测。做分离用途，通常需要很厚很大的板子，将化合物停留的部分抠下来溶解得到。通常，我们会使用到薄层色谱的分离效果以及物质纯度检测的功能，这时只需要消耗很少量的化合物。薄层显色有三种常用的方法：可见光（有颜色的化合物），紫外光（365nm，254nm），显色剂。第3节 物质结构鉴定的主要技术3.1 质 谱 （MS）质谱仪能用高能电子流等轰击样品分子，样品分子会失去电子从而变为带正电荷的分子离子，分子离子能进一步裂解，生成质量更小的碎片离子。这些不同离子具有不同的质量，质量不同的离子在磁场的作用下到达检测器的时间不同，其结果为质谱图。 原理公式：q/m=2v/B2r2。质谱是目前唯一能够确定分子量，给出分子式的方法，对于结构鉴定至关重要。质谱进样量少，灵敏度高。3.2核磁共振波谱（NMR）核磁共振波谱是研究物质结构最常用和最重要的方法之一。核磁共振波谱是指位于外磁场中的原子核吸收电磁波后从一个自旋能级跃迁到另一个自旋能级而产生的吸收波谱。我们能够通过波谱图上共振峰的位置，强度和精细结构来研究和判断分子的结构。3.3紫外-可见吸收光谱（UV-VIS）紫外-可见 吸收光谱的原理是利用某些物质分子吸收200-800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁产生了这种分子吸收光谱。紫外吸收光谱常用于共轭体系的定量分析，灵敏度很高。3.4红外光谱红外光谱法的原理在于化学键的振动能级不同，具有不同的频率。当一束红外光通过被测量的样品时，各个波长上的能量吸收会被记录下来。这可以由连续改变使用的单色波长来实现，也可以用傅立叶变换来一次测量所有的波长。这样的话，透射光谱或吸收光谱或被记录下来，显示出被样品红外吸收的波长，从而可以分析出样品中包含的化学键。我们可以通过红外光谱来鉴定分子中的特定官能团。第4节 研究的背景和意义4.1研究背景真菌结构多样，种类繁多，是自然界的重要资源。是结构多样性天然产物的宝库。很多真菌都有药用价值，从真菌中开发得到的药物有很多。球毛壳菌是一类重要的真菌，从该属中发现的各种活性良好的化合物有很多，细胞松弛素类是其中很重要的一类化合物，具有显著的抗肿瘤、抗炎等生物活性8。对球毛壳菌次生代谢产物的研究是近些年天然产物研究的热点。4.2研究意义对球毛壳菌次生代谢产物的研究具有很强的学术价值和应用价值。1、学术价值：（1）通过球毛壳菌化学成分的研究，有望发现新型细胞松弛素类化合物。细胞松弛素（cytochalasans）是一类具有显著生物学功能的真菌多聚氧基酸杂合次级代谢产物，其来源十分广泛，其中球毛壳菌是其重要来源之一。迄今为止，从球毛壳菌中分离得到的化合物达两百多个，其中大部分是结构新颖的活性次生代谢物质，其中球毛壳素类生物碱（chaetoglobosins）是细胞松弛素类化合物的一类。通过对球毛壳菌次生代谢产物的研究，有望发现新型的细胞松弛素类化合物。（2）通过对细胞松弛素类化合物的活性进行研究，有望发现新型的良好的生物活性。cytochalasans 是一类具真菌生物碱，具有多种包括抗肿瘤、抗炎、抗病毒等显著的生物活性8。与细胞内微丝结合后可以将微丝切断，并结合在微丝末端阻抑肌动蛋白在该部位的聚合，但对微丝的解聚没有明显影响，因而用细胞松弛素处理的细胞可以破坏微丝的网格结构，并阻止细胞的运动，是影响微丝组装的特异性药物12。通过对细胞松弛素类化合物的生物活性的研究，有望发现其潜在的新的生物活性。2、应用价值：（1）细胞松弛素类化合物用于新型绿色杀菌剂的研制细胞松弛素是一类生物活性良好的化合物，通过研究其对各种植物病原真菌的抑制作用，有利于发现新型的有良好的杀菌效果的化合物，有利于新型农药杀菌剂的研发。（2）细胞松弛素类化合物用于新型绿色杀虫剂的研究通过研究细胞松弛素类化合物对各种农业害虫的生物活性，有利于发现新型的活性良好的化合物，有利于农药杀虫剂的研制。（3）细胞松弛素类化合物用于研究新型的抗肿瘤药物通过研究细胞松弛素的细胞毒活性，以及抗肿瘤的活性，有可能发现新型的特效的抗肿瘤药物，推动医药行业的发展。第5节 研究方法和路线首先，进行菌株筛选，选择产生化合物较多的优秀菌株，然后用液体培养基进行大批发酵，得到的发酵产物进行提取和有机溶剂萃取，之后将这些提取物通过柱层析进行分离纯化，得到单体化合物，最后结合质谱和核磁共振波谱进行结构鉴定。研究路线：第2章：菌株筛选、液体发酵及产物富集第1节 菌株筛选1.1 实验材料、试剂及仪器1、实验材料：供试菌株：实验所用的36株银杏内生球毛壳菌采集于山东临沂的银杏植株，由秦建春老师鉴定，在吉林大学植物科学学院天然产物及生物合成实验室中保存。培养基：PDA培养基球毛壳发酵专用液体培养基：可溶性淀粉 5g，葡萄糖 15g，蛋白胨 7g，酵母提取物 5g，NaCl 0.1g，MgSO4 0.05g，K2HPO4 0.05g，自来水 1L（各种培养基成分称量之后加入自来水边加热边搅拌，使其全部溶解即可）27。2、实验仪器：电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、容量瓶、培养皿、超净工作台、37恒温培养箱1.2 菌株活化、筛选1、将保藏的菌株恢复到活化的状态。将在试管中冷藏的36种球毛壳菌在室温下解冻，并在超净工作台下，用接种环挑取少量的菌落在事先配好并灭好菌的PDA培养基上划线接种，在恒温培养箱中,28的条件下培养一周，定期观察球毛壳菌的生长状况。2、在小三角瓶中进一步扩大培养将这36种球毛壳菌的长势比较好的菌落挑选出来，在500ml的三角瓶中接种，选用毛壳菌专用液体培养基来进行培养，在28，140rpm的条件下，在恒温震荡培养箱中培养一周。3、菌株筛选待菌丝长满之后，用纱布将36种球毛壳菌的菌丝和菌液通过过滤分离，取滤液，用乙酸乙酯萃取得到提取物，将提取物用甲醇稀释到一定程度，将其用薄层色谱层析（展开剂：二氯甲烷：甲醇=15:1），并于紫外365 nm、254 nm 观察其各组分化合物的情况。根据紫外灯下的显色情况来筛选优势菌株，通常，紫外364nm下蓝绿色荧光的亮度大、量多即为优势菌株。最终，选择了23号菌株为本次的实验菌株，即毛壳菌MX-0005。紫外显色情况以及活化情况如图2.1和2.2所示。图2.1 1-36株球毛壳菌发酵液乙酸乙酯提取部分化学成份薄层色谱分析（紫外365nm）图2.2 球毛壳菌MX-0005的活化情况第2节 液体大批发酵2.1实验材料、试剂及仪器1、实验材料供试菌株：活化好的球毛壳菌MX-0005培养基：毛壳菌专用液体培养基2、实验仪器：电磁炉、玻璃棒、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、5L玻璃发酵瓶2.2大批发酵1、配置并分装培养基将球毛壳菌专用液体培养基配置好，分装在5L的玻璃发酵瓶中，每瓶1.5L，共80瓶，120L发酵液。用封口膜将发酵瓶封好并用高压蒸汽灭菌锅分批进行灭菌。2、接种并培养在超净工作台的无菌环境中，将事先准备好的活化的菌种接种到每个发酵瓶中，将发酵瓶封好。将接种的发酵瓶放置在28的环境中，静置，使其自行生长，发酵3个月。期间，不断观察并将已经被污染的去除。最终得到了78瓶生长完好的毛壳菌的发酵产物。发酵情况如图2.3所示。图2.3 78瓶球毛壳菌的发酵情况第3节 发酵产物提取，萃取3.1实验材料、试剂及仪器1、实验材料：发酵好的球毛壳菌2、实验试剂：石油醚，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，浓硫酸3、实验仪器：FW-400A倾斜式高速万能粉碎机、真空干燥箱 DZF-6050 型、电热恒温水浴锅、D101大孔吸附树脂、旋转蒸发仪、SHZ-95A型循环水式多用真空泵、分液漏斗、三脚架、移液枪、ML15-4型可调式电热板、通风橱、层析反相色谱GF254-薄板3.2代谢产物的提取1、发酵液的初期处理用纱布过滤的方式将菌丝和菌液分离开来。将菌丝放于50的恒温干燥箱中，使菌丝中的水分充分挥发，待其完全干燥之后置于粉碎机中完全粉碎。将粉碎好的菌丝体用甲醇浸泡，放于50的恒温水浴锅中，保温24小时。整个浸泡过程重复5次，使菌丝中的化合物能够充分溶解在甲醇溶液中。2、大孔吸附树脂初步提取将过滤好的菌液倒入大孔吸附树脂柱中，使菌液中的化合物能够被大孔吸附树脂充分吸附。待菌液全部倒入之后，用水洗脱，除去化合物中的水溶性成分。如此，直至流出的水变得澄清无味，基本完全去除水溶性成分。之后，再用乙醇溶液进行洗脱，将吸附在大孔吸附树脂上的的小极性化合物洗脱下来，同样，直至流出来的乙醇溶液颜色变得很淡，基本不含化合物为止。将用大孔吸附树脂初步提取的菌液和菌丝的甲醇浸泡液分别用旋转蒸发仪浓缩，同时回收甲醇和乙醇溶液，循环利用。最终得到膏状的提取物。将两种提取物用少量溶剂溶解之后充分混合。3.3石油醚和乙酸乙酯萃取提取物与石油醚的比例大体上为3：1。先将分液漏斗盖好（注意透气孔），拿起来，逆时针旋转摇晃十次左右，倒置一次，使提取物和石油醚充分混合均匀。如此重复三次。将分液漏斗放于三脚架上，静置，待溶液分层，将石油醚部分装瓶。乙酸乙酯萃取方法同上。将石油醚部分和乙酸乙酯部分分别浓缩，并标号为M-1和M-2，用薄层色谱层析观察化合物的情况，如图2.4所示。图2.4 石油醚和乙酸乙酯萃取物的薄层色谱分析第3章：毛壳菌次生代谢产物的分离纯化1.1实验材料、试剂及仪器1、实验材料：毛壳菌MX-0005发酵液萃取物2、实验试剂：石油醚、二氯甲烷、甲醇、乙醇、浓硫酸、乙酸乙酯3、实验仪器：反相色谱柱、薄层色谱板、Sephadex LH-20凝胶柱、便携式紫外检测灯、ZF-6型三用紫外分析仪、硅胶柱（80-120目，型号：粗孔（zcx-H）；200-300目，型号：粗孔（zcx.）、移液枪、ML15-4型可调式电热板、通风橱、旋转蒸发仪、SHZ-95A型循环水式多用真空泵。1.2乙酸乙酯部分的分离纯化主要对萃取得到的乙酸乙酯部分（M-2）进行分离，采用常规柱层析来分离。用旋转蒸发仪将乙酸乙酯部分的萃取物蒸干之后，用少量丙酮溶解，然后在通风橱里将样品与80-120目的硅胶拌在一起，硅胶和样品的体积比为4:1。将样品体积4-5倍量的200-300目的硅胶倒入要使用的硅胶柱中，用真空泵抽真空，倒入样品，抽真空，然后加入与样品量相同量的80-120目的硅胶作为保护层，在最上面加入一团棉花（缓冲作用）。用甲醇和二氯甲烷配置的梯度洗脱剂（极性由小到大）进行洗脱，最终得到几个部分的样品，分别编号为A、B、C、D，其中B部分的化合物量最大，种类也最多，着重对B部分进行分离。将B部分的化合物合在一起，浓缩蒸干，用凝胶柱进行层析，纯甲醇作为洗脱剂，接好的样品用薄层色谱层析（展开剂：二氯甲烷：甲醇=15:1）得到如下结果，将这些样品分为4个部分，分别为B1、B2、B3、B4。结果如图3.1所示。图3.1 B部分化合物凝胶柱层析的薄层分析结果B1部分化合物比较少且杂，没有分离的价值；B4部分显示有少量化合物，且种类比较少，可做进一步分离； B2和B3部分的化合物比较多，种类也比较多，还需要多次分离。B2部分的分离将B2部分的化合物合在一起，蒸干，再用凝胶柱分离一次，分成4个部分：B2.1、B2.2、B2.3、B2.4。B2.1部分的化合物量少，种类杂，没有多少分离的价值，故放弃对其分离。B2.2部分在紫外（365nm）检测下，有一种呈现紫色荧光的化合物，比较有分离的价值，但是经过多次凝胶柱，反相柱层析之后，并未将紫色荧光的物质同其他杂质分开，采用重结晶的方法，也并没有多大的效果，后来发现紫色荧光的物质量也不大，故放弃对其的分离。B2.3 部分在紫外（365nm）检测下，有一种呈现黄色荧光的化合物，量也比较大，经过多次凝胶，反相，以及硅胶层析之后，得到了含有少量杂质的化合物，编号为CM-1，但是由于前期的操作问题，以及硅胶层析对化合物的过多消耗，使得这种化合物最终得到的量比较少，没有办法鉴定出该化合物的结构。B2.4部分经过硅胶柱，凝胶柱和反相柱的反复多次层析，最终得到了一种纯度较高（3种展开剂展板均只有一个斑点）的化合物，编号为CM-2。经过波谱解析鉴定出了这种化合物的结构以及分子量信息。B3部分的分离将B3部分用凝胶柱进行层析(甲醇做洗脱剂)，分成5个部分：B3.1、B3.2、B3.3、B3.4、B3.5B3.1和B3.5中化合物的量比较少，杂质较多，故放弃对其的分离。B3.2部分有一种紫外254nm下呈现黑斑的化合物，是分离的目标化合物，经过几次凝胶柱除杂，以及反相色谱柱层析，还是存在含有少量杂质，好在杂质的存在并未对最终的结构鉴定产生影响，还是得到了这种化合物的质谱和核磁共振谱图，以及分子量的信息，这个化合物编号为CM-3.经过比对，最终得到了该化合物的结构信息。B3.3该部分的化合物经过几次凝胶和反相层析之后，发现并没有量比较大的化合物，杂质还比较多，所以放弃分离。B3.4在经过了几次色谱柱层析之后，表现出良好的结晶的趋势，因此，将这部分的化合物通过重结晶的方法进行分离，通过不断地重结晶，除杂，最终得到了一种纯度较高的化合物，编号为CM-4,但是经过称量，该化合物的实际重量却很少，没有办法在进行进一步的结构鉴定。B4部分的分离B4部分的化合物量较少，种类也相对较少，经过一次反相柱层析之后，分成了3个部分，分别编号为B4.1、B4.2和B4.3。目标产物集中在B4.2，所以重点分离这一部分，其他两个部分没有目标产物，且杂质较多，所以放弃分离。B4.2这部分经过几次凝胶柱和方向柱的反复层析之后，化合物的量已经很少了，可是还存在不少杂质，所以最终放弃了这个目标产物的分离。图3.2 乙酸乙酯部分分离流程图第4章：结构鉴定1.1实验材料、仪器1、实验材料：分离纯化的单品化合物2、实验试剂：丙酮2、实验仪器：质谱仪；核磁共振仪1.2结构鉴定结果CM-2化合物的结构鉴定该化合物m/z 523 M + H +，结合氢谱和碳谱等波谱数据，确定其分子式为C30H37NO7，经过数据库和文献28比对，该化合物的波谱数据和文献中基本上保持一致，故最终确定该化合物为Cytochalasin N。其结构如图所示。图4.1 CM-2化合物Cytochalasin N的结构图 CM-3化合物的结构鉴定该化合物m/z 523 M + H +，结合氢谱和碳谱等波谱数据，确定其分子式为C30H37NO7，经过数据库和文献29比对，该化合物的波谱数据和文献中基本上保持一致，故最终确定该化合物为19,20-Epoxycytochalasin Q。其结构如图所示。图4.2 CM-3化合物19,20-Epoxycytochalasin Q的结构图第5章：实验结果及讨论1.1实验结果通过这一段时间的学习和实验，以天然产物化学的理论为基础，利用各种常规色谱柱分离纯化，最终从毛壳菌MX-0005中分离得到了几种单体化合物，其中有两种经过结构鉴定，得出了化合物的结构信息，其名称分别为cytochalasin N和19,20-Epoxycytochalasin Q。1.2讨论球毛壳菌是一类很有研究价值的真菌，经过人工发酵培育，得到了很多结构新颖并且拥有良好活性的次生代谢产物8。本文中所用的球毛壳菌是来自银杏树叶的植物内生真菌。有研究发现，几乎所有被研究过的植物中都有其特定的内生真菌，而内生真菌和其宿主植物存在着及其微妙的关系；“内共生理论”认为植物的内生真菌能够产生跟这种植物相同或者相似的代谢产物30。紫杉醇是一种抗癌特效药，但是红豆杉的生长周期却特别长，使得这种药物始终不能被广泛应用；但是，在1993年，曾经有科学家从红豆杉的树皮中发现了一种内生真菌，也能够产生紫杉醇，并且同样具有免疫和细胞毒活性31。这就为我们开拓了思路，也同样让我们认识到了药用植物内生真菌的巨大作用：在保护药用植物资源的同时，为新药研制提供了另外一条可能更便捷更高效的途径32。我们的球毛壳菌来自银杏树叶，而银杏是一种很有药用价值的植物，从银杏树叶中得到的内生真菌很有可能发现很多生物活性良好的化合物。所以这次的研究很有价值。此次的实验主要是由菌株筛选、活化，液体大批发酵，常规柱层析分离纯化以及最后的质谱和核磁共振波谱结构鉴定构成。在实验的过程当中，我们遇到了不少的问题。主要有：1、接种的时候杀菌不到位，使得发酵过程中出现了不少污染，浪费了不少，也使得发酵产物缺少，影响后续的分离纯化。2、实验过程中，由于操作不当，有多次浪费样品的现象，影响分离纯化，使得最后样品量过少，做不了结构鉴定。3、在色谱柱层析的过程中，柱子和洗脱剂选用的问题也不少，使得实验的效率不高。4、分离化合物的过程比较盲目，效率比较低，建议通过活性跟踪分离的方法来分离，目的性更强，效率也更高。值得庆幸的是，终于还是有几种单体化合物被分离出来了，也有两种通过了结构鉴定，得到了结构相关的信息。当然，其他几种没有鉴定出来的，或是因为样品量太少，或是因为化合物纯度不够造成的，也很遗憾。但是这次实验毕竟是我第一次接触此类实验，很多操作不当也是难免，做的好的地方值得发扬，不好的自然也要吸取相应的教训。结果虽然不尽如人意，但是在实验的过程中，我学到了很多：1、学习了不少做天然产物化学研究的相关实验技术，包括：各种色谱柱的使用，以及其他各种实验仪器的使用，真菌发酵的相关操作，细菌真菌的培养等。2、通过这次的实验过程，我接触了实验室，了解到了科研的艰辛和快乐。3、从实验室师兄、师姐和老师的身上，学到了科研工作者的艰苦奋斗、坚持不懈、苦中作乐的工作精神。由于时间有限和实验经验的不足，实验成果有很大的局限性。但是本次实验的研究很有价值，我相信，在后来者的持续努力下，一定会有更好的研究成果。 致谢大学四年匆匆而逝，待我们终于意识到的时候，却发现自己连时间的尾巴都没抓住。四年的时光，我们最好的年华，青春年少，意气风发。欢乐多，遗憾亦不少。四年的时间，最不可缺的就是一颗感恩的心。感谢我的父母和亲人，没有他们的支持，就没有我无忧无虑的校园生活。感谢学校和植物科学学院给我提供的良好的学习和生活环境。感谢我的任课老师的悉心指导，不仅教给了我们知识，还有很多做人做事的道理。 其中，尤其要感谢一下我的论文指导老师秦建春老师，秦老师悉心指教让我学到了很多，不管是在实验的理论方面还是实验操作上面的问题，老师都会给出详细的指导，诲人不倦。也很感谢实验室的各位师兄师姐，在实验的过程中给了我很大的帮助。当然，还要感谢我最亲爱的同学们，感谢大家的支持和陪伴，才有了我大学四年的精彩的生活。参考文献1 Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yewJ. SCIENCE-NEW YORK THEN WASHINGTON-, 1993, 260: 214-216.2 Sutton D A, Fothergill A W, Rinaldi M G. Guide to clinically significant fungiM. Williams & Wilkins, 1998. 3 Udagawa S, Toyazaki N, Yaguchi T. A new species of Chaetomium from house dustJ. Mycoscience, 1997, 38(4): 399-402. 4 McMullin D R, Sumarah M W, Miller J D. Chaetoglobosins and azaphilones produced by Canadian strains of Chaetomium globosum isolated from the indoor environmentJ. Mycotoxin research, 2013, 29(1): 47-54.5 Blunt J W, Copp B R, Munro M H, et al. Marine natural productsJ. Natural product reports, 2011, 28(2): 196-268.6 Gunatilaka A A L. Natural Products from Plant-Associated Microorganisms: Distribution, Structural Diversity, Bioactivity, and Implications of Their OccurrenceJ. Journal of Natural Products, 2006, 69(3): 509-526. 7 Scherlach K, Boettger D, Remme N, et al. The chemistry and biology of cytochalasansJ. Natural product reports, 2010, 27(6): 869-886. 8 Pendse G S, Mujumdar A. Recent advances in cytochalasansJ. Indian Drug Research Associates, Pune, India, 1986.9 Crivello J F, Jefcoate C R. Intracellular movement of cholesterol in rat adrenal cells. Kinetics and effects of inhibitorsJ. Journal of Biological Chemistry, 1980, 255(17): 8144-8151.10 Rampal A L, Pinkofsky H B, Jung C Y. Structure of cytochalasins and cytochalasin B binding sites in human erythrocyte membranesJ. Biochemistry, 1980, 19(4): 679-683.11 Williams J A, Wolff J. Cytochalasin B inhibits thyroid secretionJ. Biochemical and biophysical research communications, 1971, 44(2): 422-425.12 Brown S S, Spudich J A. Mechanism of action of cytochalasin: evidence that it binds to actin filament endsJ. J Cell Biol, 1981, 88(3): 487-491.13 Carter S B. Effects of cytochalasins on mammalian cellsJ. Nature, 1967, 213: 261-264.14 Fournier R E, Pardee A B. Cell cycle studies of mononucleate and cytochalasin-B-nduced binucleate fibroblastsJ. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1975, 72(3): 869-873.15 Andersen B, Smedsgaard J, Frisvad J C. Penicillium expansum: consistent production of patulin, chaetoglobosins, and other secondary metabolites in culture and their natural occurrence in fruit productsJ. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(8): 2421-2428.16 Lin Z J, Zhang G J, Zhu T J, et al. Bioactive cytochalasins from Aspergillus flavipes, an endophytic fungus associated with the mangrove plant Acanthus ilicifoliusJ. Helvetica Chimica Acta, 2009, 92(8): 1538-1544.17 Ding G, Song Y C, Chen J R, et al. Chaetoglobosin U, a Cytochalasan Alkaloid from Endophytic Chaetomium g lobosum IFB-E019J. Journal of natural products, 2006, 69(2): 302-304. 18 Cullen D, Berbee F M, Andrews J H. Chaetomium globosum antagonizes the apple scab pathogen, Venturia inaequalis, under field conditionsJ. Canadian Journal of Botany, 1984, 62(9): 1814-1818. 19 Li H Q, Li X J, Wang Y L, et al. Antifungal metabolites from Chaetomium globosum, an endophytic fungus in Ginkgo bilobaJ. Biochemical Systematics and Ecology, 2011, 39(4): 876-879. 20 Wang Y, Xu L, Ren W, et al. Bioactive metabolites from Chaetomium globosum L18, an endophytic fungus in the medicinal plant Curcuma wenyu