（食品科学专业论文）玉米大豆复合肽的特定酶解及其ACE抑制活性研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是如需保密，解密时间2 0 1 0 年7 月6 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 立兰已 时间：2 0 0 7 年6 月1 2 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：地导师签名：勿瑟 签名魄夕年6 月阳 签名吼汐7 年月，z 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 。 目录 摘要i a b s t ra c t i i i 缩略语表 第一章绪论1 1 1 国内外玉米肽、大豆肽研究概况2 1 1 1 大豆肽研究概况2 1 1 2 玉米肽研究概况2 1 2a c e 抑制肽3 1 2 1 血管紧张素转化酶及其升压作用机制。3 1 2 2a c e 抑制肽的作用机制。4 1 2 3a c e 抑制肽的结构特点4 1 2 4a c e 抑制肽的制备方法4 1 2 5 食源性a c e 抑制肽5 1 3 本研究的目的及意义8 第二章玉米大豆复合肽制备及其体外a c e 抑制活性9 2 1 材料与方法1 0 2 1 1 材料1 0 2 1 2 方法1 0 2 2 结果分析与讨论1 3 2 2 1 浓缩玉米蛋白的制备1 3 2 2 2 玉米大豆复配蛋白酶解条件的确定1 4 2 2 3 碱性蛋白酶酶解物玉米肽、大豆肽及其复合肽a c e 抑制活性比 较1 7 2 3 结论1 8 第三章玉米大豆复合肽体内降血压活性1 9 3 1 材料与方法2 0 3 1 1 材料2 0 3 1 2 方法2 0 3 2 结果分析与讨论2 1 3 2 1 复合肽对自发性高血压大鼠( s h r ) 血压的影响2 1 3 3 结论2 5 玉米大豆复合肽的特定酶解及其a c e 抑制活性研究 第四章玉米大豆a c e 抑制肽的分离纯化及结构初探2 6 4 1 材料与方法。2 6 4 1 1 材料2 6 4 1 2 实验方法2 7 4 2 结果分析与讨论2 8 4 2 1 超滤处理对水解物a c e 抑制活性的影响2 8 4 2 2 用c u 葡聚糖凝胶配位色谱法分离玉米大豆复合肽2 9 4 2 3 配位色谱分离得到组分脱盐处理3 0 4 2 4a c e 抑制肽的结构分析3 1 4 3 结论3 4 第五章玉米大豆a c e 抑制肽功能性质研究3 5 5 1 材料与方法3 5 5 1 1 材料3 5 5 1 2 方法3 6 5 1 3 复合肽a c e 活性的测定。3 7 5 2 结果分析与讨论。3 7 5 2 1 复配蛋白与复合肽的功能性比较3 7 5 2 2 复合肽的热稳定性和冻藏稳定性4 1 5 3 结论4 2 第六章玉米大豆a c e 抑制肽的脱苦及其应用4 3 6 1 材料与方法4 4 6 1 1 主要材料4 4 6 1 2 主要仪器4 4 6 1 3 实验方法4 4 6 2 结果分析与讨论。4 6 6 2 1 风味酶脱苦法正交实验4 6 6 2 21 3 环糊精掩盖脱苦法4 8 6 2 3a c e 抑制复合肽的应用4 9 6 3 结论5 2 参考文献5 3 致谢6 1 附录( 硕士期间发表论文) 6 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 摘要 为了利用植物蛋白质资源和提高其营养价值，以生产玉米淀粉和豆油的下脚料 黄粉和豆粕中获得的玉米蛋白、大豆蛋白为原料，经酶法改性制备具有高附加 值的生物活性肽产品。本文采用正交试验研究了从黄粉中提取玉米蛋白，并与大豆 蛋白复配，采用中性蛋白酶( n u t r a s e ) 、碱性蛋白酶( a l c a l a s e ) 及强碱性蛋白酶酶 解，从中优选出制备血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制肽的条件；比较了玉米肽、大 豆肽、玉米大豆复合肽的a c e 抑制活性。进一步采用超滤、配位色谱法、r p h p l c 、 h p l c m s m s 、氨基酸分析仪等手段对复合肽进行了分离纯化、成分分析及结构初 探，初步探讨了a c e 抑制肽的结构与降血压效果的关系；通过体外试验考察了a c e 抑制肽对a c e 酶活的抑制作用；通过动物一次性给药实验和长期给药实验，考察了 a c e 抑制肽对自发性高血压大鼠( s h r ) 血压的影响，比较了复合肽和复配蛋白的 功能性质；对复合肽进行了脱盐和脱苦研究，比较了两种脱盐、脱苦方法对复合肽 a c e 抑制活性的影响；并将复合肽作为食品添加剂应用于生产绿豆糕。结果如下： 1 以粗蛋白含量为5 6 9 7 玉米黄粉为原料，以碱醇液( 由0 1m 0 1 l n a o h 与9 5 乙醇配制) 为提取液，制备浓缩玉米蛋白的正交试验表明：其最佳提取条件为： 提取液碱醇比为4 5 5 5 ( v v ) ，料液比1 ：1 5 ，提取时间2 h ，温度5 5 ；在最佳 提取条件下，所得浓缩玉米蛋白中粗蛋白含量高达9 3 1 4 。 2 玉米大豆复合肽降血压活性研究 1 ) 酶解正交试验表明：中性蛋白酶、碱性蛋白酶和强碱性蛋白酶分别酶解玉米大 豆复配蛋白，对于a c e 抑制活性而言，以碱性蛋白酶酶解肽活性最高，a c e 抑 制率达8 2 5 5 ，其酶解最佳条件为：【e s i 为0 5 ，料液比为1 ：1 5 ，酶解时 间为4h 时；是极具开发价值的降血压肽。 2 ) 比较了玉米肽、大豆肽、玉米大豆复合肽的a c e 抑制活性，复合肽优于玉米肽， 玉米肽优于大豆肽。复合肽不仅对a c e 抑制率最高，达8 4 0 2 ，且营养价值 高，水解时间短，节省能源。 3 ) 一次性给药动物试验表明：灌胃复合肽及卡托普禾l j ( c a p t o p r i l ) l h 后，与对照组相 比，高( 1 0 0m g k g ) 、中( 5 0m g k g ) 剂量给肽组自发性高血压鼠( s h r ) 的平 均血压值极显著下降( p 0 0 1 ) ，低剂量( 2 5m g k g ) 给肽组s h r 的平均血压 值显著下降( p o 0 5 ) 。高剂量给肽组s h r 血压降幅最大，降低了1 7 9 5m m h g 柱；中剂量给肽组s h r 的降幅与卡托普利组( 1m g k g ) 接近，降低了1 0 0 m m n g 柱左右；之后各给药组s h r 血压值逐步回升，7 h 后基本恢复到灌胃前的水平。 4 ) 3 0 天长期给药动物实验表明：低( 1 0m g k g ) 、中( 2 5m g k g ) 、高剂量( 5 0m g k g ) 给肽组及给c a p t o p r i l 组( 1m g k g ) s h r ，随着时间延长降血压效果越来越明显， 从1 2 天后开始中、高剂量给肽组及给c a p t o p r i l 组s h r 的血压值降低已达显著 ， 玉米大豆复合肽的特定酶解及其a c e 抑制活性研究 或极显著水平，3 0 天时低、中、高剂量组s h r 的平均血压值分别下降了8 5 2 m m h g 柱、2 2 2 0m m h g 柱和2 4 5 8m m h g 柱，且高剂量复合肽的降血压效果优 于1m g k gc a p t o p r i l ，而复合肽对正常血压的w i s a k y o t o 鼠基本无影响，并且复 合肽剂量与s h r 的体重呈正相关关系，说明复合肽对s h r 不仅具有降血压作用， 而且还具有促进生长的作用。 3 复合肽的分离纯化、成分分析及结构初探 1 ) 经超滤所得玉米大豆复合肽其a c e 抑制活性大大提高，复合粗肽和复合肽中 p r o ，l e u ，p h e ，a l a 等氨基酸的百分比明显高于其原料蛋白，有助于a c e 抑制 活性提高。经c u 2 + - s e p h a d e xg 2 5 柱分离后得到两个级分一复合肽i 和复合 肽i i ，前者的a c e 抑制活性明显高于后者，是进行结构分析的目标级分。 2 ) 采用h p l c m s m s 和氨基酸分析，对含量较高级分中的一个肽进行了结构解析， 该化合物是氨基酸序列为l c u - a r g p r o 如p p r o 的五肽，其端基有助于a c e 抑制 活性提高。 4 碱性蛋白酶酶解玉米大豆复合肽的应用研究 1 ) 和玉米大豆复配蛋白相比，玉米大豆复合肽的溶解度大大提高，尤其是在等电 点，在不同p h 值下溶解度均在9 0 以上；起泡性和乳化性都得到很大提高； 黏度降低，流动性好。 2 ) 比较经大孔树脂和阴阳离子交换树脂处理的两种脱盐方法，活性肽经前者处理 后，氮回收率、a c e 抑制活性和脱盐率均高于后者处理的效果。因而，宜选用 大孔树脂脱盐。 3 ) 分别用风味酶和1 3 环状糊精两种方法对复合肽进行脱苦，并考察了风味酶脱苦 对a c e 抑制活性的影响，在恒温5 0 ，p h 值6 4 的条件下，向复合肽中加入 e 】【s 】为2 0 的风味酶，处理2h ，脱苦效果最好，a c e 抑制活性与未脱苦复合 肽接近，且酶法脱苦不会造成氮损失，具有实用价值；在p h 值7 0 的条件下， 当复合肽浓度为5 ，添加2 5 b 环糊精，可达到基本无苦味，同时不会造成 氮损失。 4 ) 当复合肽添加量为2 5 ，绿豆粉与白砂糖的配比为3 ：l 时，能生产出品质良 好的降血压绿豆糕，并且其降血压活性可以长期保持稳定。 关键词：玉米大豆复合肽；碱性蛋白酶；自发性高血压鼠；血管紧张素转化酶抑制活性； 结构；应用 n 华中农业大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 s t u d yo ne n z y m o l y s i sp r e p a r a t i o na n da c ei n h i b i t i n g 一 ， 一 一一一 a c t i v i t yo f c o r na n ds o y b e a n p e p t i d e s a b s t r a c t i no r d e rt ou t i l i z et h ep l a n tp r o t e i na n di m p r o v ei t sn u t r i t i o nv a l u e ，t h ec o r na n ds o y b e a n p r o t e i n sw e r ee x t r a c t e df r o mb y p r o d u c t sp r o d u c i n gt o ms t a r c ha n ds o y b e a no i l t h e h i g h - v a l u eb i o a c t i v ep e p t i d e so fc o ma n ds o y b e a nw e r ep r e p a r e db yt h ee n z y m o l y s i s t h e o r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n tw a sd e s i g n e dt od i s c o v e ro p t i m u mc o n d i t i o n so fc o r np r o t e i n e x t r a c t e df r o mc o r ng l u t e nm e a l ( c g m ) ，a n dt h e nm i x e di tw i t hs o y b c a np r o t e i nt od i s c o v e r t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fp r e p a r i n gt h ec o i na n ds o y b e a np e p t i d e s ( c s p ) w i t h a n g i o t e n s i o n i c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i n h i b i t i n ga c t i v i t yh y d r o l y z e db yn e u t r a s e ， a l c a l a s ea n da l k a l i n ep r o t e i n a s e t h ea c e i n h i b i t i n ga c t i v i t i e so fp e p t i d e sh y d r o l y z e d f r o mc o r np r o t e i n ，s o y b e a np r o t e i na n dt h e i rm i x t u r ew e r ec o m p a r e d t h ec r u d ec o r na n d s o y b e a np e p t i d e s ( c c s p ) w e r eg r a d u a l l ys e p a r a t e db yu l t r a f i l t r a t i o n ，l i g a n d c h r o m a t o g r a p h y , r p - h p l c t h ec o m p o n e n t sw e r ed e t e r m i n e db ya m i n oa c i da n a l y z e r t h e n ，t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fap e p t i d ew a sa n a l y z e db yh p l c - m s m s t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ee f f e c to fi n h i b i t i n gh y p e r t e n s i o na n dt h es t r u c t u r eo fc s p h a d a l s ob e e nd i s c u s s e d a c ei n h i b i t i n ga c t i v i t i e sf r o mt h ea c e i n h i b i t i n gp e p t i d e s ( a c e i p ) w e r ed e t e r m i n e di nv i t r ot e s t ，a n da c e i p i n f l u e n c eo ns p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s ( s h r ) b yo n c el a v a g ea n dl o n g - t e r ml a v a g ew a sr e s e a r c h e di nv i v oa n i m a lt e s t f u n c t i o n c h a r a c t e r so ft h ec s pw e r ec o m p a r e dt ot h a to ft h em i x t u r ep r o t e i n s t oi m p r o v et h e f l a v o ro ft h ec s p , m e t h o d so fd e s a l ta n dd e b i t t e rw e r es t u d i e d s i m u l t a n e o u s l y , t w ow a y s o fd e s a l ta n dd e b i t t e re f f e c to nt h ea c ei n h i b i t i n ga c t i v i t yw a sc o m p a r e d m o r e o v e r , t h e c s pa sf o o da d d i t i v ew a sa p p l i e di nt h em u n g b c a nc a k e s p r o d u c t i o n t h em a i nr e s u l t s w e r es h o w na sf o l l o w s ： 1 t h er e s u l t so fo r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o no f e x t r a c t i n gp r o t e i nf r o mc g m w i t h5 6 9 7 c r u d ep r o t e i nw e r ea sf o l l o w s ：t h er a t i oo f 0 1 m o l l n a o ha n d9 5 e t h a n o l = 4 5 ：5 5 ( v v ) ，r a t i oo fm a t e r i a la n dw a t e r = l ：1 5 ， e x t r a t i n gt i m e = 2h ，t e m p e r a t u r e - - 5 5 f i n a l l y , t h ec o n t e n to fc r u d ep r o t e i nr e a c h e d 9 3 1 4 2 t h ea c e i n h i b i t i n ga c t i v i t i e so ft h ec s p n 1 玉米大豆复合肽的特定酶解及其a c e 抑制活性研究 1 ) t h er e s u l t so fo r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n t a m o n g t h ec s p h y d r o l y z e db yn e u t r a s e ，a l c a l a s ea n da l k a l i n ep r o t e i n a s e ，t h eh i g h e s t i n h i b i t i n ga c t i v i t i e sp e p t i d ew a st h eo n eh y d r o l y z e db ya l c a l a s ea n di t sa c ei n h i b i t i n g r a t i or e a c h e d8 2 5 5 t h eo p t i m u mc o n d i t i o ni st h er a t i oo fm a t e r i a la n dw a t e r = l ：1 5 ， 【e 】【s 】= 0 5 ，t h eh y d r o l y z i n gt i m e - 4 h t h i sk i n do fc s pw a sap r o m i s i n g a n t i h y p e r t e n s i o np e p t i d ew i t hh i g l ld e v e l o p m e n tv a l u e 2 ) c o m p a r i n gt h ea c ei n h i b i t i n ga c t i v i t yo fp e p t i d e sh y d r o l y z e df r o mc 0 1p r o t e i n ， s o y b e a np r o t e i n ，t h ec s pw a sn o to n l yw i t hh i 曲e s ta c ei n h i b i t i n ga c t i v i t y , b u ta l s o w i t hh i g h l yn u t r i t i o n a lv a l u e t h ep r o d u c t i o no fc s pn e e d e dt h el e a s te n e r g ya n d s h o r t e s te n z y m o l y s i st i m e 3 ) t h ea n i m a le x p e r i m e n t so fo n e - t i m ea d m i n i s t r a t i o nc s ps h o w e dt h a tt h ec s p - t r e a t e d s h r sa v e r a g eb l o o d p r e s s u r ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y0 0 0 1o rp o 0 5 ) c o m p a r e d t ot h ec o n t r o lg r o u pa f t e rl a v a g et h ec s pa n dc a p t o p d ll h t h eh i g hd o s a g e ( 1 0 0 m g k g ) c s p t r e a t e ds h r sa v e r a g eb l o o dp r e s s u r ed r o p e d1 7 9 5m m h g ，t h em i d d l e d o s a g e ( 5 0m g k g ) c s p t r e a t e ds h r sa v e r a g eb l o o dp r e s s u r ed r o p e d9 4 3m m h g ， w h i c hi sc l o s et ot h ec a p t o p r i l t r e a t e ds h r sa v e r a g eb l o o dp r e s s u r e a f t e rt h a ta l l g r o u p s a v e r a g eb l o o dp r e s s u r er o s eg r a d u a l l y , 7 hl a t e r ，i tr e c o v e r e dt h el e v e lb e f o r e l a v a g e 4 ) t h ea n i m a le x p e r i m e n t so fl o n gt e r ma d m i n i s t r a t i o nc s ps h o w e dt h a tt h el o n gt i m eo f a d m i n i s t r a t i o nm e d i c i n e ，t h em o r eo b v i o u st h eb l o o dp r e s s u r ef a l l a f t e r1 2d a y s ，t h e m i d d l e ( 2 5m g k g ) a n dt h eh i g h ( 5 0m g k g ) d o s a g eg r o u p sa n dc a p t o p r i l ( 1m g k g ) g r o u ps h r sb l o o dp r e s s u r er e d u c e ds i g n i f i c a n t l y ( p 碱醇比，确定最佳提取条件为：提取时间2h 、温度5 5 、碱醇比为4 5 5 5 。 在最佳提取条件下提取蛋白质，其粗蛋白含量为9 3 1 4 。如果采用多次浸提法，提 玉米大豆复合肽的特定酶解及其a c e 抑制活性研究 取率应该会有所提高，但成本也会相应提高，故本文采用一次浸提法。提取时间增 加，提取率反而降低，这可能是因为时间增长，乙醇挥发增多及蛋白质变性引起溶 解度下降所致。 2 2 2 玉米大豆复配蛋白酶解条件的确定 2 2 2 1 中性蛋白酶酶解玉米大豆复配蛋白正交试验 表2 - 2 中性蛋白酶酶解正交试验结果 t a b l e 2 - 2t h er e s u l to fc o r na n ds o y b e a np r o t e i nh y d r o l y z e db yn e u t r a s e i no r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n t 由表2 2 可知，对水解度而言，各影响因素的主次排序为：【e s 】 酶解时间 料液比，最优水平组合为：【e l i s 为o 5 ，酶解时间为4 h ，料液比为1 ：2 5 。而对 于a c e 抑制率而言，最优水平组合及各影响因素的主次排序与水解度并不完全一 致。其最优水平组合为：【e 】【s 】为o 5 ，料液比为1 ：1 5 ，酶解时间为5 h 时，所 得酶解肽a c e 抑制率最高。用中性蛋白酶水解其a c e 抑制率不太高，最高仅为 6 9 0 3 ；水解度也不高，最高仅为1 5 7 9 ，这是因为在中性条件下玉米蛋白的溶解 1 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 度低所致；水解度与a c e 抑制活性并不是正相关关系。 2 2 2 2 碱性蛋白酶酶解玉米大豆复配蛋白正交试验 表2 - 3 碱性蛋白酶酶解正交试验结果 t a b l e2 - 3t h er e s u l to fc o r na n ds o y b e a np r o t e i nh y d r o l y z e db ya l c a l a s e i no r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n t 由表2 3 可知，对水解度而言，各影响因素的主次排序为：酶解时间 【e s 】 料液比，最优水平组合为：【e 】【s 】为0 7 ，酶解时间为4 h ，料液比为1 ：1 5 。而对 于a c e 抑制率而言，各影响因素的主次排序为：酶解时间 【e s 】 料液比，最优 水平组合为【e 】【s 】为0 5 ，酶解时间为4 h ，料液比为1 ：1 5 。与用中性蛋白酶水解 相比用碱性蛋白酶水解，其a c e 抑制率最高在8 2 5 5 以上，是良好的有开发价值 的降血压肽；其水解度最高达1 6 9 7 ，但水解度与a c e 抑制活性也不是正相关关 系。 玉米大豆复合肽的特定酶解及其a c e 抑制活性研究 2 2 2 3 强碱性蛋白酶酶解玉米大豆复配蛋白正交试验 表2 4 强碱性蛋白酶酶解正交试验结果 t a b l e2 - 4t h er e s u l to fc o r na n ds o y b e a n p r o t e i nh y d r o l y z e db ya l k a l i n ep r o t e i n a s e i no r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n t 由表2 4 可知：使用强碱性蛋白酶酶解复配蛋白时，水解度在1 1 1 9 之间， 酶解肽的a c e 抑制率在3 8 6 3 之间。酶解条件对a c e 抑制活性的影响依次为： 酶解时间 酶浓度 底物浓度，当酶解时间为8h ，底物浓度为1 6 9 5 0m l 酶浓度为9 u m l 的条件下，所得酶解肽具有最高a c e 抑制活性。 从以上三种蛋白酶的正交实验结果来看，中性蛋白酶和强碱性蛋白酶的最佳酶 解条件所得酶解肽的a c e 抑制活性，均低于碱性蛋白酶的最佳酶解条件所得酶解 肽。因为蛋白质在中性条件下，溶解度不高，水解度偏低生成的肽段链太长，a c e 抑制活性不太高：而复配蛋白在碱性条件下有较好的溶解度，水解度的升高使得蛋 白能生成更多的短肽，酶解物的a c e 抑制活性升高，但是当水解度较高时，可能 1 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 导致一些游离氨基酸的生成，或a c e 抑制肽的进一步降解，故也不利于降血压肽 的生成，所以采用强碱性蛋白酶酶解的复合肽活性也不高。此外，三种蛋白酶的定 位酶切点位也有差异。本实验中，宜选择a l c a l a s e 蛋白酶生产a c e 抑制复合肽。 酶解肽的a c e 抑制活性与水解度不具有正相关关系，影响两者的主次因素不 同，并且由表2 3 、2 4 可以看出，二者在各因素的影响下的变化趋势也有很多不同 之处。水解度过高或过低得到的酶解肽的a c e 抑制活性均不高，当水解度较低时， 得到的肽链较长，而具有a c e 抑制活性的肽主要是一些3 7 肽，故a c e 抑制活性 不高；当水解度较高时，可能导致一些游离氨基酸的生成，或a c e 抑制肽的进一 步降解，故也不利于a c e 抑制肽的生成。只有在适当的水解度，才能生成具有适 宜链段和特定氨基酸结构及组成的a c e 抑制肽。因此，在生产中可通过控制水解 度获得具有较高a c e 抑制活性的复合肽产品。 2 2 3 碱性蛋白酶酶解物玉米肽、大豆肽及其复合肽a c e 抑制活性 比较 玉米肽大豆肽 复合肽 种类 图2 - 1 在复配蛋白最佳条件所得三种酶解肽的a c e 抑制活性比较 f i g 2 - 1c o m p a r et h ei n h i b i t i n ga c t i v i t yo na c eo ft h r e ep r o t e i n su n d e rt h eo p t i m u m e n z y m o l y s i sc o n d i t i o n so ft h em i x t u r ep e p t i d e s 在复配蛋白最佳酶解条件下制备玉米肽，大豆肽及其复合肽，比较三者的a c e 抑制活性。结果如图2 - 1 所示。水解得到的三种酶解肽其a c e 抑制活性依次为：复 合肽 玉米肽 大豆肽。复合肽的a c e 抑制活性明显高于其它两种单一蛋白肽。 结合文献中有关碱性蛋白酶酶解玉米蛋白( m i y o s h ise ta l ，1 9 9 1 ) 、大豆蛋白 ( 吴建平和丁霄霖，1 9 9 8 b ) 得到的高活性降血压肽的报道，进一步比较三种蛋白 质在各自最佳酶解条件下制得酶解肽的a c e 抑制活性。由图2 2 知三种酶解肽a c e 抑制活性大小依次为：复合肽 玉米肽 大豆肽。虽然复合肽的a c e 抑制活性仅略 1 7 加加0 玉米大豆复合肽的特定酶解及其a c e 抑制活性研究 高于玉米肽，但其不仅具有良好的营养价值，且节省能源，因为酶解玉米蛋白的时 间太长( 1 8h ) ，而酶解复配蛋白的时间仅需4h 。 玉米肽大豆肽复合肽 种类 图2 - 2 三种蛋自在各自最佳酶解条件下所得酶解肽的a c e 抑制活性比较 f i g 2 2c o m p a r e t h ei n h i b i t i n ga c t i v i t ya c eo ft h r e ep r o t e i n su n d e rt h eo p t i m u m e n z y m o l y s i sc o n d i t i o n so ft h e i ro w nr e s p e c t i v e l y 2 3 结论 2 3 1 从黄粉中提取蛋白质的最佳条件为：提取液( 由0 1m o l i n a o h 与9 5 乙醇 配制) 的碱醇比为4 5 5 5 ( v v ) ，料液比1 ：1 5 ，提取时间2 h ，温度5 5 ；提取 物中粗蛋白含量由原料中的5 6 9 7 提高到了9 3 1 4 。 2 3 2 分别利用n u t r a s e 中性蛋白酶、a l c a l a s e 碱性蛋白酶和强碱性蛋白酶酶解玉米 大豆复配蛋白制得玉米大豆复合肽，其最高a c e 抑制率分别可达6 9 0 5 、 8 2 5 5 和6 3 6 9 以上。 2 3 3 复合肽的水解度与a c e 抑制活性并非正相关关系，适当的水解度，才能生成 具有适宜链段和特定氨基酸组成结构的较高a c e 抑制活性的肽，因此，在生 产中可通过控制水解度获得较高a c e 抑制活性的复合肽产品。 2 3 4 比较大豆肽、玉米肽、复合肽的a c e 的抑制活性，复合肽优于玉米肽，玉米 肽优于大豆肽，其抑制率分别为8 4 0 2 ，8 2 5 9 ，6 3 0 5 。复合肽不仅a c e 抑制率最高，且营养价值高，水解时间短，节省能源。因此，玉米大豆复合肽 优于玉米肽、大豆肽。 1 8 加如约加o 华中农业大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 第三章玉米大豆复合肽体内降血压活性 对食源性活性肽的降血压功能的评价与确认一般需以高血压鼠为模型进行实 验。高血压模型包括实验性和自发性两大类型。实验性高血压模型是经过一定的手 术、化学物质诱发或其他的因素处理而产生，因与人类高血压疾病的临床表现不完 全一致，故通常仅用于筛选有效药物和研究高血压发病机理中某些特定因素的作 用。自发性高血压大鼠s h r 与人类高血压相似，遗传因素是发病主要因素，s h r 在高血压早期无明显的器质性变化、血液动力学改变、病程等与人类高血压较为相 似，是目前研究降血压肽最常用的动物模型( 郑建仙，1 9 9 9 ) 。 测量大鼠血压的方法有直接测压法和间接测压法。直接测压法是将心导管或聚 乙烯塑料管插入大鼠动脉中直接测定血压的变化；间接测压法采用无创伤的方法测 量大鼠血压，主要是尾袖法( 又称尾套管法) ，测压时将充气管状尾套管环绕鼠尾 根部，尾套管迅速充气使套管内压高于预计收缩压，大鼠脉搏消失，随后缓慢放气， 当套管内压低于收缩压时，脉搏出现，可测到收缩压值。尾袖法与直接测压法比较， 不需要专业人员也可以操作，方法简便快捷，是目前较为流行的测定方法( 杜冠华等， 2 0 0 1 ) 。 研究者将待测样品经口服或灌胃等方式给予s h r 鼠，通过测量摄入样品前后 大鼠血压的变化反映样品降血压作用的大小，同时研究降血压肽的时效关系和量效 关系。实验证明，食品源的许多活性肽都具有降血压作用，如，乳蛋白来源的降血 压肽对s h r 具有很强的降血压功能( r i c h a r djfe ta l ，2 0 0 4 ) 。s u c s u n a 和o s a j i m a 首先报道了沙丁鱼和带鱼的水解物中含有a c e 抑制肽，其分子量在1 0 0 0 2 0 0 0 范 围内( 姜瞻梅和霍贵成，2 0 0 3 a ) 。吴建平等( 吴建平和丁霄林1 9 9 8 a ) 在p h 为9 ，反 应温度为5 0 ，酶量为4 ，底物浓度为7 5 的条件下水解大豆蛋白制备a c e 抑 制肽，经动物实验表明( wu jpa n dd i n gx l ，2 0 0 1 ) ，每天以1 0 0m g k g 的剂量喂给 s h r ，一个月后血压降低了3 8m m h g 柱，而对正常鼠的血压没有影响。富含降血 压三肽口p 和v p p 的c a l p i n 酸乳饮料按5m i k g 体重的剂量喂给s h r 大鼠，8 h 后 血压下降2 3m m h g 柱，用尾袖法测量口p 和v p p 三肽的降压活性，其降压活性与 剂量呈线性关系。2 5m i k g 剂量的c a l p i n 酸乳饮料或口p 和v p p 三肽的混合物对 正常w i s t a k y o t o 大鼠的血压值没有影响( n a k a m u r ay e ta l ，1 9 9 5 ) 。 体外实验已证实了玉米大豆复配蛋白酶解物具有a c e 抑制活性，为进一步证 1 9 玉米大豆复合肽的特定酶解及其a c e 抑制活性研究 实玉米大豆蛋白酶解物的降血压活性，在本研究中，对s h r 进行了一次性给药实 验和长期给药动物实验，并以卡托普汞j ( c a p t o p r i l ) ( - - 种合成的a c e 抑制剂，具有类 多肽结构) 为药物对照，采用尾袖法测定s h r 的血压变化。 3 1 材料与方法 3 1 1 材料 3 1 1 1 实验材料 自发性高血压大鼠( s h r ) 体重2 0 0 1 0 5 6g ，雄性，6 周龄：北京维通利华实验动 物技术有限公司购得 w i s t a k y o t o 大鼠体重2 0 0 5 2 7g ，雄性，6 周龄：华中科技大学同济医学院提供 玉米大豆a c e 抑制肽：自制 卡托普禾l j ( c a p t o p r i l ) ：华北制药集团制剂有限公司提供 3 1 1 2 主要仪器 r b p 一1 型大鼠血压计( 北京中日友好临床医学研究所) u v - 2 6 5 f w 紫外可见分光光度计( 日本岛津公司) s c r 2 0 b c 型低温高速离心机( 日本日立公司) 3 1 2 方法 3 1 2 1 自发性高血压大白鼠( s h r ) 的饲养条件 s h r 饲养在华中科技大学同济医学院实验动物饲养中心，室温2 4 ，每日光 照时间1 2h ，饲喂标准饲料，自由进食和饮水。 3 1 2 2 自发性高血压大白鼠( s h r ) t i ne , ；9 l t 定 s h r 的血