（运动人体科学专业论文）运动性疲劳大鼠心室肌蛋白质组差异性表达的研究.pdf

摘要 本研究采用蛋白质组学的理论与技术，建立安静和递增运动负 荷训练后大鼠心室肌蛋白质组的差异性表达图谱，初步筛选出对运 动应激具有重要意义的心室肌目标蛋白质，从蛋白质组学定量与定 性研究的角度探讨运动性心肌疲劳的发生规律。 以1 0 只雄性s d 大鼠为研究对象，随机分为对照组和运动实验 组，运动组经过7 周大强度递增运动负荷训练后( 最后一次力竭) 6 小时和对照组同时麻醉处死，提取心室肌组织的全蛋白样品。采 用双向凝胶电泳进行蛋白样品分离，经考马斯亮蓝g - 2 5 0 染色后， 采用p d - q u e s t 软件进行图像分析和数据采集。选择运动后“缺失” 和差异性表达量在5 倍以上的目标蛋白质点进行胶内原位酶解和质 谱鉴定。 实验结果表明，对照组和运动组样品蛋白质点的平均匹配率分 别为7 9 1 0 4 6 和7 7 1 8 2 3 ，平均相关系数为0 7 3 ，获得了 重复性较好双向考染图谱。对照组与运动组蛋白质点数目分别为 3 5 2 1 7 和3 3 8 _ + 1 7 个。运动后表达差异的点共有9 9 个，运动后消 失的点有5 个；上调和下调5 倍及5 倍以上的各有1 2 个；表达量 上调2 倍及以上的有5 2 个，下调2 倍及以上的有4 2 个。9 个目 标蛋白点共鉴定出7 个蛋白质：运动后“缺失”的蛋白质有心肌特 异性长链脂酰辅酶a 脱氢酶、线粒体电子传递链复合体i 最大的亚 基、葡萄糖调节蛋白7 5 、原肌球蛋白1a 链；运动后表达上调的蛋 白质有腈水解酶家族成员2 ；运动后表达下调的蛋白质有心肌d 一 肌球蛋白重链和一个分子量为2 1 k d a 的未知蛋白。 在长时间大强度的运动应激条件下，大鼠的心室肌中的蛋白质 组发生了显著的变化。运动后“缺失”和下调的蛋白质点与心肌收 缩的调控失衡和能量代谢的方式转变，以及细胞的应激反应有关， 表明递增运动负荷训练后，心肌疲劳的发生与心肌收缩力的下降、 能量供给困难和心肌细胞的损伤有关。值得重视的是，采用蛋白质 组学的方法，成功地筛选出心肌特异性长链脂酰辅酶a 脱氢酶和葡 萄糖调节蛋白7 5 等6 种在运动医学领域中尚未涉足的，具有运动 应激特点的，对研究运动心脏具有重要意义的目标蛋白质，为深入 研究运动性心肌疲劳提供了新的思路，奠定了前期工作基础。 关键词：蛋白质组；运动性疲劳；心室肌；递增运动负荷；双向凝 胶电泳；质谱 a b s t r a c t t h i ss t u d ye s t a b l i s h e dt h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s i v ei m a g e f il m so ft h ev e n t r i c u l a rm u s c l eo nt h ec o n t r o l g r o u pa n d e x e r c i s eg r o u pw h i c hh a st a k e nal o n g - t e r mp r o g r e s s i v el o a d v o l u m et r a i n i n gb ya d o p t i n gp r o t e o m i c ss k i l l s ，t os e e kt h e m e a n i n g f u lp r o t e i n so fv e n t r i c u l a rm u s c l ew h i c hr e s p o n s et o e x e r c i s e s t r e s s ，a n dt op r o b e i n t ot h el a wt h a ti n d u c e d m y o c a r d i a lf a t i g u ef r o mt h el e v e lo fq u a n t i t a t i v ea n d q u a li t a ti v ep r o t e o m e a sr e s e a r c hm o d e l ，t h em a l es dr a to fc o n t r o lg r o u pa n d e x e r c i s eg r o u pe x e c u t e da f t e ra n e s t h e t i z ea tt h es a m et i m e6 h o u r sr e s tl a t e ra f t e rs e v e nw e e kp r o g r e s s i v ei n c r e a s i n gl o a d v o l u m et r a i n i n go fh i g hi n t e n s i t y ，a n dt h et o t a lp r o t e i no f v e n t r i c u l a rm u s c l ew a se x t r a c t e d ，a n dt h e ns e p a r a t e db y2 d - p a g e ， t h eg e ls t a i n e db yc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg - 2 5 0 ，a n dt h e a n a l y s i so fi m a g ef i l m so fg e la n dd a t aa c q u i s i t i o nw a sd o n e b yp d - q u e s t s o f t w a r e t h e o b j e c ti r ep r o t e i ns p o t sw h i c h d i s a p p e a r e da n dt h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i v ev o l u m ei n c r e a s e d m o r et h a n5 - f o l da f t e re x e r c i s ew e r es e l e c tf o rm a s ss p e c t r a a n a l y s i s i i i t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t ：t h ep e rm a t c hr a t eo f c o n t r o lg r o u pa n dt h ee x e r c i s eg r o u pr e s p e c t i v e l yi s7 9 1 0 4 6 a n d7 7 1 8 2 3 。t h ep e rc o e f f i c i e n tc o r r e l a t i o ni s 0 7 3w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a tt h ei m a g ef i l m sw i t hh i g h e r r e p r o d u c i b i l i t yw a sa t t a i n e d t h ep r o t e i ns p o t sa m o u n to f c o n t r o lg r o u pa n de x e r c i s eg r o u pr e s p e c t i v e l yw e r e3 5 2 1 7a n d 3 3 8 2 1 t h e r ea r e9 9p r o t e i ns p o t st h a td i f f e r e n t l ye x p r e s s e d i nw h i c hf i v ep r o t e i ns p o t sd i s a p p e a r e d ，1 2w e r er e s p e c t i v e l y u p g r a d e da n dd o w n g r a d e dm o r et h a n5 - f o l d ，5 2p r o t e i ns p o t s u p g r a d e da n d4 2d o w n g r a d e dm o r et h a n2 - f o l da f t e re x e r c i s e 7 p r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e di n9d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n s p o t s l o n g c h a i ns p e c i f i ca c y l c o ad e h y d r o g e n a s e 、n a d h u b i q u i n o n e0 x i d o r e d u c t a s e7 5 k ds u b u n i t 、s t r e s s 一7 0p r o t e i n 、 t r o p o m y o s i n 一1a l p h ac h a i nw e r ed i s a p p e a r e da f t e re x e r c i s e ， n i t r i l a s ef a m i l y ，m e m b e r2w a su p g r a d e d ，a n da2 1 k du n k n o w n p r o t e i na n dm y o s i n 一6w e r ed o w n g r a d e d t h ev e n t r i c u l a rm u s c l ep r o t e o m er e m a r k a b l yc h a n g e da f t e r e x e r c i s e t h ep r o t e i ns p o t sd i s a p p e a r e da n dd o w n g r a d e da f t e r e x e r c i s eh a v es t r o n gr e l a t i o n s h i pw i t hd i s t u r b a n c eo fm u s c l e c o n t r a c t i o nr e g u l a t i o na n dm e t a b o l i cs t y l et u r na n ds t r e s s r e a c t i o n t h i sd e m o n s t r a t e dt h a tt h eh a p p e n so ff a t i g u ei n d u c e d b yl o n g t e r mp r o g r e s s i v el o a dv o l u m et r a i n i n gw a sr e l a t e dw i t h t h ed e c r e a s eo fm u s c l ec o n t r a c t i o nc a p a c i t y ，t h ed i f f i c u l t y i ne n e r g ys u p p l ya n d t h ed a m a g et ot h ec a r d i a cc e l l s i ti s n o t e w o r t h y t h a tt h e o b j e c t i v ep r o t e i n s w h i c hw e r e c h a r a c t e r i s t i co fe x e r c i s es t r e s sa n dh a v en o ts t u d i e di n s p o r t s m e d i c i n ea r e al i k e l o n g c h a i ns p e c i f i ca c y l - c o a d e h y d r o g e n a s e ，s t r e s s 一7 0p r o t e i na n ds oo nw e r es c r e e n e d t h i s p r o v i d es o m en e wt h o u g h ta n ds e t t l e dp r o p h a s eb a s ef o rf u r t h e r r e s e a r c h i n gf a t i g u ei n d u c e db ye x e r c i s e k e y w o r d ：p r o t e o m e ：e x e r c i s e i n d u c e df a t i g u e ：v e n t r i c u l a r m u s c l e ：p r o g r e s s i v el o a dv o l u m et r a i n i n g ；t w o d i m e n s i o ng e l e l e c t r o p h o r e s i s ： m a s ss p e c t r a v 运动性疲劳大鼠心室肌蛋白质组差异性表达的研究 缩略词表( 中英文对照) a c n 乙腈( a e e t o n i t r i l e ) a e r 丙烯酰胺( a e r y l a m i d e ) a p s 过硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l f a t e ) b i s 甲叉双丙烯酰胺i n ，n - m e t h y l e n e - b i s 一( a r y l a m i d e ) 】 b s a 牛血清白蛋白( b o v i n es e r u m a l b u m i n ) c h a p s 3 - ( 胆酰胺丙基) 一乙二胺】一丙磺酸 d d h 2 0双蒸水( d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r ) 2 - d e 双向电泳 d ，r r 二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) i a a典乙酰胺( i o d o a c e t a m i d e ) i e f 等电聚焦( i s o c l c c t r i cf o c u s i n g ) i p g 固相p h 梯度( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t ) m r p 1 分子量等电点( m o l e c u l a rw e i g h t i s o c l c c t d cp o i n t ) n p - 4 0 非离子去垢剂( n o n i d c tp 4 0 ) p a g e 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y i a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) p m s f 蛋白酶抑制剂( p h e n yl e m t h a n s u l f o n y lf l u o r i d e ) s d s十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) s s p 标准点编号( s t a n d a r ds p o tn u m b e r ) t e m e d 四甲基乙二胺( n ，n ，n , n ；- t e t r a m e t h y l e t h l e n e d i a m i n e ) t r i s 三羟基甲基氨基甲烷( t r i s 一( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ) m a l d i - t o f t o f - m s 基质辅助激光解析离飞行时间串联质谱( m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r t w o - s t a g ed e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e - o f - f l i g h t t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ) p m f 肽指纹图谱( p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t ) 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容 外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成 果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：驯印a ，稗月与 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 、 作者签名：洲固 导师签名： 1 、保密口，在一年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 岛弛彭 日期：j 口0 年月岁 日 日期：秽一年月弓日 运动性疲劳人鼠心室肌篮e j 质组差异性表达的研究 1 前言 运动心脏研究取得的大量成果使之成为1 9 9 8 年国际心脏学年 会的重点专题，专家们预言运动心脏将成为2 l 世纪国际心脏学研 究的重点。自1 8 8 9 年h e n s c h e n 开始注意到训练对心脏的形态影 响至今，对运动心脏的研究大致经历了以下3 个阶段：即从一般心 脏形态改变、心脏功能变化的研究，到对心肌超微结构水平和内分 泌等方面的研究，目前已深入到对心脏分子水平的研究。蛋白质作 为生命活动的直接执行者，是生物体中最重要的组成成分与功能执 行者。心肌蛋白质是心脏结构和功能的基础。心脏结构和功能的变 化，必然会导致心肌蛋白质的表达量和质发生变化。心室肌是心脏 泵血的主要动力，在营养物质和氧气的运输过程中起着十分重要的 作用，是体能和运动能力的重要基础。 以往的研究表明，运动性疲劳状态下，心肌组织中的各种蛋白 质，如i c a m 。旺1 、丝裂素活化蛋白激酶”3 、c k 及其同工酶“1 、心钠素 ”、膜磷脂酶a ：、硫氧还蛋白还原酶、h + 转运a t p 酶吲、n a d h c o o 还原酶阳1 等都会发生明显变化。s o l a 等通过对大鼠进行大强度跑台 实验，发现运动后肝脏、骨骼肌、心脏中h s p 7 2 m r n a 大量积累“”。 但运动性疲劳的发生是一个十分复杂的过程。它涉及到全身各个组 织、器官和系统，用单一的因素( 如能源衰竭学说、乳酸学说、代 谢产物堆积学说) 不能够全面的解释运动性疲劳的发生。在此研究 基础上，我国学者冯炜权提出了运动性疲劳发生的神经一内分泌一免 疫和代谢调节网络调节机制，认为运动性疲劳是在机体的各个组 织、器官、系统的共同作用下发生的“。对运动性疲劳研究的重点 也由过去的对物质和能量代谢紊乱的表面现象深入到分子生物学 机制。虽然这种理论为大多数人所接受，但由于实验技术的限制， 还不能直接而全面的了解各个组织、器官和系统在运动性疲劳发生 过程中所发生的变化和所起的作用。 蛋白质组学是从整体的角度来研究一个细胞、一个组织或一种 生物的基因组所表达的全部蛋白质的- i 1 新兴学科。目前，以双向 凝胶电泳和质谱鉴定技术为基本支柱技术的蛋自质组学研究成为 了生命科学的热点，特别是重要的生理和病理过程中的蛋白质组学 研究更是重中之重。但在运动医学领域，相关的研究还比较少。有 关运动应激对机体各个组织、器官的蛋白质组表达的影响，有学者 对此做了些研究。如y u a nq 等( 2 0 0 4 年7 月) 用蛋白质组学的 研究方法研究遗传性肥胖小鼠和野生型小鼠运动后血清蛋白质组 的差异性表达“。张松江等应用差异蛋白质组学的研究方法研究大 强度力竭运动大鼠骨骼肌蛋白质表达特征，发现运动后“新增”的 蛋白有乙二醛酶；运动后“缺失”的蛋白质有脂酰辅酶a 脱氢酶、 3 磷酸甘油醛脱氢酶、h 一转运a t p 酶；运动后表达上调的蛋白质是 分子量为3 0 9 6 9 k d 的未知蛋白；运动后表达下调的蛋白质有肌球蛋 白轻链3 和磷酸变位酶1 “。沙继斌等初步研究了急性力竭性运动 对大鼠淋巴细胞蛋白质组的影响“。r o g e r s 等应用差异蛋白质组技 运动性坡劳人鼠心室肌蛋白质纽差异性表达的研究 术对8 只安静状态和8 只运动训练大鼠左心室肌蛋白进行了研究， 发现在候选斑点中，安静组和运动训练组蛋白质组有显著性差异的 是一组2 0 k d a 的热休克蛋白和3q 一羟基类固醇脱氢酶“”。b o l u y t 等发现，与安静对照组相比，经过6 周的递增运动负荷的耐力运动 后诱导的肥大心肌中，有2 6 个蛋白质点的表达量发生了改变，有 1 2 个点是新增的“。 长期以来，在运动医学领域中对各种蛋白质的研究，主要是引入 医学与生物学等研究领域中的已知蛋白质，在此基础上进行运动干预 以研究其变化与特征，这种研究状态，不利于发现在运动应激条件下 区别于病理等其他应激的、具有典型特征的蛋白质。采用目前在生命 科学领域中前沿的蛋白质组学理论与技术，能解决这一研究难题，筛 选出对运动应激具有重要意义的目标蛋白质。 本研究拟以s d 大鼠为研究对象，建立长时间递增运动负荷训练 心肌疲劳大鼠模型。通过对对照组和运动实验组的蛋白质表达图谱进 行比较分析，以期发现差异的表达点，对差异表达点进行初步鉴定， 以探讨运动性疲劳发生、发展的规律，并为在体育科学领域中进行蛋 白质研究提供新的思路与实验依据。 运动性疲劳大鼠心室肌蛋白质纽差异性表达的研究 2 材料与方法 2 1 实验对象与分组 1 0 只雄性s p r a g u e - d a w l e y 大鼠购于湖南农业大学实验动物部， 3 月龄，体重为2 5 0 + l o g ，i i 级实验动物。室温2 0 。c 2 4 ，光照 时间7 ：0 0 1 9 ：0 0 ，分笼饲养，每笼5 只，自由进食和饮水。适应 性喂养一周后，1 0 只大鼠按体重和运动能力配对随机分为两组，每 组5 只，一组为对照组，另一组为运动实验组。 2 2 运动实验动物建模方式 大鼠购入后进行适应性跑台训练，跑台坡度为0 。，速度 l o m m i n ，持续时间为l o m i n ，共训练3 天。运动实验组( n = 5 ) 采 用递增运动负荷跑台训练7 周，坡度为0 。，从训练第一周起，逐周 递增运动速度和运动时间，具体训练方案见表2 - 1 “7 1 表2 - 1 动物训练方案( m m i n lx m i n ) 硕上学位论文 2 3 仪器设备和试剂 2 3 1 仪器设备 电动跑台，玻璃注射器及注射针头，大剪刀，手术剪，眼科剪， 镊子，玻璃分针，滤纸，碾钵，不锈钢勺，e p 管，电子天平，自动 取液器( 5 0u l ，l o o u l ，2 0 0u l ，l m l ) ，冷冻离心机、7 2 2 分光光度 计，固相p h 梯度等电聚焦干胶条( i m m o b i l i s ed r ys t r i pp h 3 1 0 、 长度1 8 c m ，购自a m e r s h a m 公司) ，i p g p h o r 等电聚焦电泳系统( 购自 a m e r s h a np h a r m a c i a 公司) ，聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直平板电泳槽( 购 自b i o r a d 公司) ，脱色小摇床，循环水浴箱，图像扫描仪( 购自中 晶科技) 。 2 3 2 试剂 b r a d f o r d 试剂盒，尿素、n p 一4 0 、载体两性电解质( p a r m a l y t e 3 - 1 0 ) 、p m s f 、c h a p s 、s d s 、溴酚蓝、丙烯酰胺、b i s 均为a m e r s h a m p h a r m a c i a 公司；t e m e d 、胰蛋白酶、i a a 、d t t 、硫脲购自s i g m a 公 司；硫代硫酸钠购自f l u k a 公司；a p 、标准蛋白混合物( 兔磷酸化酶 b 9 7 4 0 0 ：牛血清白蛋白6 6 7 0 0 ，兔肌动蛋白4 3 0 0 0 ，牛碳酸酐酶3 1 0 0 0 ， 胰蛋白酶抑制剂2 0 3 0 0 ，鸡蛋清溶菌酶1 4 4 0 0 ) 购自b i o r a d 公司；考 马斯亮蓝g - 2 5 0 、b 一巯基乙醇、甘氨酸、乙腈、碳酸氢氨、铁氰化 钾、甲醇、硫酸铵、磷酸、乙酸来自国产。 2 4 样品制备 2 4 1 取材 大鼠最后一次运动至力竭，6 小时后和对照组同时做麻醉处理后， 运动r 丰玻劳人鼠心室肌蛋白质组差异性表达的研究 固定于手术板上，打开胸腔，暴露心脏，在主动脉升部进行插管，用 生理盐水对心脏进行灌流，待心脏颜色变淡后，迅速摘取心脏放入 4 生理盐水中进行冲洗，小心地剔除心包和心外膜，然后用滤纸小 心的吸干水分，用小剪刀剪取心尖部位的心室肌组织，置液氮中贮存 备用。 2 4 2 蛋白提取 从液氮中取出心室肌组织，用小剪刀剪碎后，放入碾钵中用液氮 碾成粉末状，准确称重后按质量与体积比1 ：4 ( r a g ：1 ) 加入组织 裂解液( 8 m o l lu r e a ，4 c h a p ，2 m o l lt h i o u r e a ，1 n p 一4 0 ，6 5 m m o l l d t t ，0 5 m m o lp m s f ，0 5 9 0 8 0 9 0 7 0 8 0 6 0 7 0 5 0 6 0 4 0 5 0 3 0 4 0 2 0 3 0 1 0 2 0 如表3 - 6 、3 - 7 所示，与对照组相比，运动后表达量上调2 5 倍 的蛋白质点有4 0 个，运动后下调2 5 倍的蛋白质点有3 0 个。其等 电点和分子量分布情况见表3 - 8 、3 - 9 。从表中可以看出，运动后表 达上调的蛋白点中，m r 范围主要集中在i o 5 0 k d ，p i 值主要集中与 5 8 。运动后表达下调的蛋白点中，有1 2 个蛋白质点在m r 为5 0 6 0 ，p i 值为5 6 这个范围。 2 2 l l 2 2 l 1 2 2 2 1 3 屹3 1 1 l 硕b 学位论文 图3 一l o 蛋白质差异性表达散点图 f i g3 - 1 0t h es c a t t e rg r a p ho fp r o t e i nd i f f e r e n te x p r e s s i o n 图3 1 0 为运动实验组和对照组蛋白质差异性表达的散点图。中 间的线表示对照组和运动组表达量相等的蛋白质点，中线以上为运动 组相对于对照组上调2 倍以上的蛋白质点，中线以下为运动组相对于 对照组下调2 倍以上的蛋白质点。 3 3 质谱鉴定结果 本研究选择运动后消失和运动后表达量差异在5 倍以上的9 个蛋 白点，用m a l d i t o f - t o f - t o f - m s 对这些蛋白质斑点进行检测，获得的 肽谱和肽段氨基酸结果在n c b i 数据库检索，最终鉴定出7 个蛋白质。 在鉴定的7 个蛋白质中，s t r e s s 一7 0 p r o t e i n ( 2 6 1 0 ) ，n a d h - u b i q u i n o n e o x i d o r e d u c t a s e7 5 k