（材料加工工程专业论文）聚乳酸多孔支架制备及表面改性研究.pdf

摘要摘要聚乳酸作为一种可生物降解的材料，在组织工程研究中得到了广泛的关注，然而，用聚乳酸制备的多孔支架在力学性能和亲水性方面的不足，制约了它在骨组织工程中的应用。本文以明胶和明胶h a 作为涂层材料，采用表面涂覆工艺对聚乳酸多孔支架进行表面改性处理，对涂层的组成、涂层制备工艺进行了研究，并对复合涂层的制备工艺进行了优化。用明胶直接在支架表面进行涂覆处理，当明胶浓度较高时，出现涂层与基体在界面处分离的现象。为了改善这一状况，采用了预涂层工艺，先在聚乳酸支架表面涂覆0 5 w t 的明胶，然后再涂其它涂层。研究结果表明，采用预涂层处理可明显提高涂层与基体的结合性能。采用浓度为0 5 的明胶溶液制备预涂层，利用戊二醛蒸汽交联3 h 后再用浓度为1 0 的明胶对支架进行第二次涂覆，支架的抗压强度由0 。11 0 m p a 提高到0 4 5 0 m p a 。采用明胶h a 复合涂层对支架进行了增强处理。球磨机转速4 0 0 r m i n ，球磨3 h 的条件下可得到h a 与明胶溶液均匀混合的明胶h a 悬浮液。当悬浮液中h a 含量为1 0 时，复合涂层支架的压缩强度最佳。明胶和明胶h a 涂覆处理，不仅能提高聚乳酸多孔支架的力学性能，还能有效地提高多孔支架的亲水性。关键词：聚乳酸( p l l a ) ，多孔支架，复合涂层，明胶，羟基磷灰石a b s t r a c tp o l yl - l a c t i ca c i d ( p l l a ) i sab i o d e g r a d a b l em a t e r i a la n dp a i db r o a da r t e n t i o ni nt i s s u ee n g l n e e n n g d u et ot h el o wm e c h a n i c a ls t r e n g t ha n dh y d r o p h i l i c i t y , t h eu s eo fp l l as c a 肺l di nb o n et i s s u ee n g i n e e r i n gw a sr e s t r i c t e d t h es u r f a c eo fp l l as c a f f o l dw a sc o a t e dw i mg e l a t i na n dg e l a t i n h ac o m p o s i t ef o rt h er e i n f o r c e m e n ta n ds u r f a c em o d i f i c a t i o n t h ec o m p o s l t l o no ft h ec o a t i n ga n dt h ec o a t i n gp r o c e s sw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h ep r o c e s st e c h n i q u ew a so p t i m i z e d t h ei n t e r f a c i a ld e b o n d i n gh a p p e n e da tt h ei n t e r f a c eo fp l l am a t r i xa n dc o a t i n gw i n lm e1 n c r e a s eo fc o n t e n to fg e l a t i nw h e nt h es c a f f o l dw a sc o a t e db yg e l a t i nd i r e c t l y t oi m p r o v et h em t e r t 2 t c i a lb o n d i n gp r o p e r t y , t h ep r e - c o a t i n gw a su s e d b e f o r et h es c a f f o l d 、惴c o a t e dn o r m a l l y , al a y e ro ns c a f f o l ds u r f a c ew a sf o r m e db yg e l a t i ns o l u t i o n0 5 1 1 1 er e s u i t ss h o 、v e dt h a tt h ei n t e r f a c eb i n d i n gb e t w e e nm a t r i xa n dp r e c o a t i n gw a si m p r o v e de v i d e n t l y ag e l a t i ns o l u t i o no fo 5 w a su s e dt of o r mp r e - c o a t i n ga n dc r o s s 1 i n k e df o r3 h ，t h e nt h es c a 肋l dw a sc o a t e dw i t hg e l a t i ns o l u t i o no f10 ，t h ec o m p r e s s i v es t r e n g t ho ft h es c a f f o l dw a si n c r e a s e df r o m0 110 m p at o0 4 5 0 m p a g e l a t i n h ac o m p o s i t ec o a t i n gw a su s e dt or e i n f o r c et h es c a 肋l d t l l eu i l i f 0 n 1 1s u s p e n s i o no fg e l a t i ns o l u t i o na n dh aw a sg a i n e dw i t ht h er o t a t i o nr a t eo fb a l l m i l lo f4 0 0 r m i na n db e i n gm i l l e df o r3 h t h eb e s tm e c h a n i c a lp r o p e r t yw a sr e a c h e dw h e nt h ec o n t e n to fh aw a s10 i nt h es u s p e n s i o n t h ec o a t i n gt r e a t m e n to fg e l a t i na n dg e l a t i n h ac o u l dn o to n l yi m p r o v et h em e c h a n j c a lp r o p e r t y , b u ta l s ot h eh y d r o p h i l i c i t yo fp l l as c a f f o l d se f f e c t i v e l y k e yw o r d s ：p o l yl - l a c t i ca c i d ( p l l a ) ，s c a f f o l d s ，c o m p o s i t ec o a t i n g ，g e l a t i n ，h y d r o x y a p a t i t e( h a )i i东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。研究生签名：莲盛至导师签名：日期：第一章绪论1 1 组织工程及骨组织工程第一章绪论1 1 1 组织工程组织工程是一个交叉学科，它综合了细胞生物学、工程科学、材料科学和外科学的知识，将活细胞和基质材料( 或叫支架) 结合起来，目的是制造出新功能组织l l j 。组织工程的研究包括以下4 个方面：种子细胞、生物材料、组织和器官的构建和组织工程临床应用等。组织工程的核心是：建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。目前，组织工程的研究内容已经包括人工骨、软骨、皮肤、肌腱、血管甚至人工胰、人工肝等，其中骨组织工程研究进展较快，利用骨修复材料对骨缺损进行修复已经取得了初步成功【2 剖。1 1 2 骨组织工程骨缺损是骨科临床常见的难题，我国每年因各类事故、疾病引起的骨缺损或骨损伤患者约3 0 0 万人，骨骼不健全人群高达1 0 0 0 万人。现有的骨缺损治疗方法有自体骨移植、同种异体骨移植、生物材料填充等，这些方法均存在一定缺陷，并不是理想的治疗模式。目前，应用骨组织工程理念修复骨缺损已成为骨修复材料领域的发展趋势。与其它方法相比，将组织工程化骨组织应用于骨缺损的修复重建有显著的优势：( 1 )采用自体组织细胞培养后移植，避免了异体组织移植中的免疫排斥反应；( 2 ) 不受供体来源的限制，避免了自体组织移植中供区的损伤、感染和术后并发症的发生；( 3 ) 人工生物材料的形状、大小可根据不同组织及实际需要设计，不受供体形状的限制。1 2 骨组织工程支架材料1 2 1 骨组织工程支架的作用与要求在骨组织工程研究中，细胞外基质支架十分重要，它不仅影响种子细胞的生物学特性和培养效率，而且决定移植后能否与受体很好地适应并结合在一起，从而发挥其修复骨缺损的作用。组织工程支架是组织工程的基础，在骨组织重建的过程中，骨支架主要起以下几方面的作用：( 1 ) 作为连接细胞和组织的框架，引导组织生长成特定形态；( 2 )作为信号分子的载体，将其运送到缺损部位，并作为缓释体使骨诱导因子缓慢发挥作用；( 3 ) 作为骨组织繁殖分化和新陈代谢的场所，为细胞生长运输营养，排除废物。由此可见，支架在骨组织工程中扮演着极为重要的角色，它不仅对细胞、组织起物理连接和支持的作用，而且还能够调节细胞的各种功能活动【7 j 。东南大学硕士学位论文用于组织工程的支架一般应具备以下要求【8 】：( 1 ) 具有良好的生物相容性和生物可降解性，即无明显的炎症反应、免疫性和细胞毒性，植入体内后降解和吸收的速度应与细胞组织生长的速度相匹配；( 2 ) 具有足够的力学强度，在病人正常的活动中不会坍塌；( 3 )高孔隙率和高比表面积，有文献指出【9 1 常规的细胞种植，一般都需要支架的孔隙率高于7 5 ；( 4 ) 表面化学性质有助于细胞的粘附、增殖和分化；1 2 2 多孔支架材料骨组织工程研究中应用的多孔支架材料主要包括无机陶瓷、金属材料、可降解性高分子材料和复合材料四大类。一、无机陶瓷材料无机陶瓷材料主要有羟基磷灰( h y d r o x y a p a t i t e ，h a ) 【1 0 1 、磷酸三钙( t r i c a l c i u mp h o s p h a t e ，t c p ) 1 1 1 、生物活性玻璃瓷( b i o a c t i v eg l a s sc e r a m i c s ，b g c ) 1 1 2 1 等。它们的优点是具有良好的生物活性，缺点是韧性差，难以进行二次加工。下面简要介绍应用最广的羟基磷灰石和磷酸三钙。l 、羟基磷灰石羟基磷灰石的化学式为c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ，它是骨组织中主要的无机成分，具有良好的生物相容性和生物活性，在骨组织修复和替换方面得到了广泛的研究和应用。致密的h a 陶瓷具有较高的强度，但植入体内后不能降解，与新骨仅在界面发生键合。多孔h a陶瓷植入体内后，新生组织不仅与界面结合良好，而且还可以长入孔隙内。随着h a 支架孔隙率的提高，新骨更容易长入，但在孔隙率提高的同时，多孔h a 陶瓷的强度显著降低，严重影响实际应用中的可操作性。肖素光等【l3 】利用不同浓度的p d l l a 溶液涂覆网状h a 生物陶瓷支架，形成一定厚度的高分子涂层，从而改善多孔生物陶瓷支架的韧性并提高其强度，赋予多孔h a 生物陶瓷植入初期适当的力学强度和韧性。2 、磷酸三钙磷酸三钙的钙磷比为1 5 ，与正常骨组织接近，是一种生物降解和生物吸收型活性陶瓷，具有良好的生物相容性和骨诱导能力。t c p 有两种晶型结构，低温型( p t c p ) 和高温型( a t c p ) ，组织工程中常用低温型1 3 - t c p 。1 3 - t c p 植入骨组织后与骨直接结合，两者间没有纤维组织长入，也无炎症或排斥反应，不产生局部或全身性毒性反应。多孔1 3 - t c p 作为骨生长的支架时，支架表面和孔隙内部同时发生溶解、降解i 吸收，参与宿主生命过程，并逐步为新生骨组织所置换。二、金属材料金属材料的代表是钛合金、金属钽和镁。其优点是机械性能良好，易于加工成型。如用钛合金粉末与钴铬钼合金通过粉末冶金方法制造多孔金属材料，用于制备人工关节，由于材料呈多孔状态，骨组织可以长入孔中，实现植入材料与机体组织的结合。多孔钽金属支架可用于关节置换、肿瘤切除后的重建、股骨头缺血性坏死的治疗和脊柱融2第一章绪论合等方面。采用粉末冶金方法所制备的多孔镁，具有孔径和孔隙率可调、机械性能好等优点【1 4 1 。三、可降解性高分子材料可降解高分子材料包括天然可降解高分子材料和人工合成可降解高分子材料。天然可降解高分子材料主要包括胶原、明胶、甲壳糖、海藻酸等，应用较多的是胶原和明胶。人工合成可降解高分子材料主要包括聚乳酸( p o l y l a c t i ca c i d ，p l a ) 、聚乙醇酸( p o l y g l y c o l i ca c i d ，p g a ) 及其共聚物( p o l y l a c t i c - c o - g l y c o l i ca c i d ，p l g a ) 、聚原酸酯( p o l y o r t h o e s t e r ，p o e ) 、聚己内酯( p o l y c a p r o l a c t o n e ，p c l ) 、聚p 羟基丁酸酯( p o l y h y d r o x y r a t e ，p h b ) 等。应用最多的是以p l a ，p g a 以及p l g a 为代表的0 【聚酯，它们不仅具有良好的机械性能，而且可通过调节分子量及分子量的分布来适应不同场合的需要，这类聚合物在体内通过酯键水解而降解【1 5 - 1 7 】，经肾排泄或通过生物化学途径以c 0 2 和h 2 0 的形式排出体外，不会产生有害副作用，具有良好的生物相容性。下面重点介绍明胶和聚乳酸这两种可降解高分子材料。1 、明胶明胶( g e l a t i n ) 由1 8 种氨基酸组成，是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物。明胶不是均一的蛋白质，而是一种热可溶性的混合物。商业明胶常分a 型和b 型两类。a 型明胶主要以动物皮为原料，用酸水解的方法制得；b 型明胶主要是以动物皮、骨、腱为原料，用碱水解的方法制得。明胶表观呈微黄色，无味，无挥发性，有良好的成膜性，干燥后的明胶涂层呈透明状，具有一定的强度，并且有良好的亲水性。明胶作为生物材料应用，具有无抗原性、生物相容性好、可参与组织愈合过程等优点【1 8 】。尹玉姬等【l9 j 以水为致孔剂采用冷冻干燥法制备了h 壳聚糖明胶网络复合支架和p 磷酸三钙( 1 3 - t c p ) 壳聚糖明胶复合支架，研究结果表明，此类支架的生物相容性良好，可以作为骨修复或骨取代材料。况光仪等【2 0 】通过临床研究，利用可降解骨基质明胶( b m g ) 修复喉框架缺损，研究结果表明，应用可降解b m g 可以修复喉缺损，重建喉功能，是目前最为理想的新喉再造的生物活性材料和手术选择。梁东春等【2 1 】探讨了复合重组人骨形成蛋白2 ( r e c o m b i n a n th u m a nb o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n2 ，r h b m p - 2 ) 的壳聚糖一明胶支架的体外成骨作用，研究表明，复合有r h b mp 2 的壳聚糖明胶人工骨支架材料在体外具有良好的诱导成骨能力。这一系列的研究成果都充分说明了明胶及其复合物在骨修复领域有着良好的| j 景【2 引。2 、p l ap l a 属于0 【聚酯类，是目前研究较多，也是最为成功的人工合成高分子材料，具有良好的生物相容性、可降解性和可吸收性。p l a 由丙交酯开环聚合制备，降解后生成乳酸，最终以h 2 0 和c 0 2 的形式排出体外。p l a 已被美国f d a 批准用于临床，是迄今研究最广泛、应用最多的可降解性高分子材料2 3 2 5 1 。乳酸有两种旋光异构体，即左旋( l l a ) 和右旋( d l a ) 孚l 酸。其均聚物有3 种基本立体构型：p d l a 、p l l a 、p d l l a 。常用的是聚消旋乳酸( p d l l a ) 和聚左旋乳酸( p l l a ) ，东南大学硕士学位论文分别由乳酸或丙交酯的消旋体、左旋体制得。p l l a 是具有光学活性的有规立构聚合物，玻璃态转化温度风和熔融温度t m 分别为5 8 。c 和2 1 5 ( 2 ；p d l l a 则是不定形非晶态聚合物，风为5 8 。c ，无熔融温度。一般认为，p d l l a 降解吸收较p l l a 快，p d l l a 体内完全吸收需2 4 周1 8 月，p l l a 则需要3 2 周4 年1 2 6 - 2 7 1 。p l l a 力学强度较好，常用作医用缝合线和外科矫形材料，p d l l a 常用作药物控释载体。随着组织工程的兴起，p l l a 由于具有优良的生物相容性、生物降解性和生物吸收性被广泛用于制备基质材料，通过与其他高分子材料、无机材料、生物因子等的复合，其应用领域正在进1 步拓宽。四、复合材料单一材料往往存在不足，因此，近年来组织工程研究中常常将两种或两种以上具有互补特性的生物材料，按一定比例和方法组合，从而构造出满足组织工程要求的新型复合材料。研究、制备复合材料多孔支架已成为骨组织工程支架材料的重要发展方向。1 3 聚合物多孔支架性能的要求组织工程需要应用可降解高分子材料来制备三维多孔支架。这种支架的作用除了在新生组织完全形成之前提供足够的机械强度外，还包括使不同类型细胞可以在支架上保持正确的接触方式，以及提供特殊的生长和分化信号使细胞能够进行正确的基因表达和分化，从而形成具有特定功能的新生组织，并且参与支架与受体组织的整合过程。聚合物多孔支架在三个尺度范围可以控制组织的生长发育过程【2 8 】：( 1 ) 大尺度范围( i t l i n c m ) 决定支架总的形状和大小；( 2 ) 支架孔隙的形态结构和大d ( g m 级) 调节细胞的迁移与生长；( 3 ) 用于制造支架的材料的表面化学性质( n m 级) 调节与其相接触的细胞的粘附、铺展与基因表达过程。可见，支架植入体内后，支架的内部结构中重要的特征是孔隙的性质，包括孔隙大小、孔隙率和形状【2 9 1 ，在选择制各支架成型工艺或对支架进行改性时必须考虑这些因素。1 3 1 孔径孔径的大小已被证明是影响纤维血管组织内生的重要参数，但孔径多大合适，目前仍有争议，一般认为孔径小于1 0 0 9 m 不利于骨长入【3 0 】。d e n n i s 研究发现，孔径的大小对于新生骨组织长入陶瓷载体有着重要的影响，最适合的陶瓷孔径为2 0 0 - - - 4 0 0 9 m 。另一方面，如果支架材料上载有生长因子，则孔径的大小也会直接影响生长因子的释放速率，从而最终影响组织的生长。w a k e l 3 1 j 等研究发现，孔径增大后纤维血管组织内生速度加快。i s h a u g 3 2 】观察发现，p l g a 泡沫的孔径大小对成骨细胞的分化和功能没有明显影响。进一步研究表明，孔径大小( 至少1 5 0 - 7 1 0 9 m 范围内) 可能只影响组织内生，而不影响组织生长的全过程。1 3 2 孔隙率4第一章绪论作为组织工程用多孔支架，要求在维持一定外形的情况下，孔隙率应尽可能高，有利于细胞种植。1 3 3 孔的形状同种材料但表面结构不同的样品会表现出不同的诱发组织增生性【3 3 1 。表面结构为l o - 2 0 p m 圆孔的样品，允许组织和血管的长入，组织和聚合物紧密接触；表面结构为1 0 - , 2 0 0 p m 拉长孔的样品和表面无孔的样品，则表现出传统的硬壳层状的囊性增生。1 3 4 其它因素材料表面粗糙，存在微小的刻痕或其它微小结构时，细胞粘附性增强p 4 d 6 】。表面电荷4 8 1 等其它因素也不能忽略。1 4 聚合物多孔支架的制备方法常用的聚合物多孔支架的制备方法包括：气体发泡( g a sf o a m i n g ) 、相分离- 乳化( p h a s es e p a r a t i o n - e m u l s i o n ) 、溶剂浇铸粒子沥滤( s o l v e n tc a s t i n g ! p a r t i c u l a t el e a c h i n g ) 、快速成型( r a p i dp r o t o t y p i n g ，r p ) 等。1 4 1 气体发泡( g a sf o a m i n g )气体发泡技术采用气体作为致孔剂，包括物理发泡法和化学发泡法。物理发泡法可避免在制备支架时使用有机溶剂。该法将聚合物( p g a 、p l a 或p l g a )压成片，浸泡在高压二氧化碳中直至饱和或者超临界状态，然后降至常压，气体的热力学不稳定性导致气体成核和长大，形成多孔支架，但孔多为闭孔结构。该法中影响孔隙率和孔结构的因素主要有聚合物结晶性和分子量、平衡时间、放气速率等。结晶性聚合物p l l a 和p g a 难以发泡，无定型聚合物p l g a 易发泡；聚合物分子量越高越难以发泡，孔隙率越低；在高压气体中平衡时间越长，孔隙率越高；放气速率对孔隙率影响较小。应用此法，需要结合聚合物的特点。除了上述的物理发泡法外，也可用化学发泡法来制备多孔支架，采用的化学发泡剂主要为碳酸盐类化合物。将聚合物溶液碳酸氢铵粒子混合物加入模具中，待溶剂部分挥发后直接浸入热水中发泡，最后经冷冻干燥可得到多孔支架【”枷】。该法得到的多孔支架孔隙率超过9 0 ，孔尺寸约在1 0 0 5 0 0 p m ，孔与孔之间连通性好并且避免了表面皮层的形成。1 4 2 相分离- 乳化( p h a s es e p a r a t i o n e m u l s i o n )在多组分均相系统中，特定的条件会使系统从稳态变为非稳态，从而趋向于分离成多相系统以降低系统自由能，这就是相分离。相分离过程最早用于制备多孔膜，可分为溶致相分离( s o l v e n ti n d u c e dp h a s es e p a r a t i o n ，s i p s ) 并f i 热致相分离( t h e r m a l l yi n d u c e dp h a s e东南大学顾j 学位论文s e p a r a t i o n ，t i p s ) 两种方法”。s i p s 法是通过将聚合物溶液( 聚合物为分散帽) 浇铸成型后在非溶剂的作川f 发_ ：相转移，去除溶剂和非溶剂而形成多孔膜。但是许多结晶性的高分予材料n 室温下没有合适的溶荆，s i p s 法的应用受到限制。而t i p s 法是通过温度改变束驱动柏分离，可以用它来制备热塑性、结晶性高分子材料多孔支架。如图l - l 所示t i p s 的过程是将聚合物在较高温度下溶解于适当的溶剂中形成均相溶液，然后在可控条件下冷却导致相分离，形成聚台物富集相和聚合物贫集相的双连续相。将溶剂以适当的方式脱除，则可得到丌孔的聚台物多孔支架。通过控制相分离的条件，可以控制所得聚合物多孔材料的密度、孔径大小和分布以及孔的形态等，因此相分离法是制备组织工程支架材料的重要方法之一。幽i - i聚合物- 溶剂一元相幽中分相原理示意幽对于组织工程支架，涉及相分离的方法包括液渡相分离、乳化冷冻干燥和崮一澈相分离。其中使用最早的足乳化冷冻干燥技术。w h a n g m 采用乳化一冷冻干燥制备了多孔支架，先将p l g a 溶于二氯甲烷( c h 2 c 1 2 ) 后，j u 入蒸馏水形成乳状液，将聚合物- 水混合物浇铸到模具中，簧于液氮中骤冷。然后将支架于5 5 下冷冻干燥，真空蒸发掉溶剂和水而获得孔隙率高达9 5 ，孔直径达l o o g m 的多孔支架。浚技术具有很多优点，也不需要特殊的洗涤沥滤步骤：但该技术所得到的多孔支架f l 尺寸较小，要应用于骨组织t 程证存在局限性。1 4 3 溶剂浇铸，粒子沥滤( s o l v e n tc a s t i n g p a r t i c u l a t el e a c h i n g )经典溶剂浇铸，粒予沥滤技术首先由m i k o s 等m 掣魄出，能够制备出高孔隙率、高比表面积和孔隙尺寸可控的组织工程用多孔支架。该技术使用不溶于有机溶剂的水溶性颗粒作为致孔剂如氯化钠、糖类晶体等，可用于制备p l l a 、p l g a 等可溶于有机溶剂的商分子聚合物多孔支架。其制各方法足【4 5 i ：将聚合物溶解在有机溶剂中，通过筛分获得需要尺寸的致孔剂颗粒然后将溶液浇铸到充满致孔剂的培养皿中。等溶剂挥发完，再将聚合物盐混合物在水中沥滤足够时问去掉致j l 剂从而得到不舍粒子的聚合物骨架。采用该技术制各的泡沫材料应用于不同类型细胞的培养，并术观察到材料对新组织的形成有任何习；良的蟛响。1 4 4 快速成型( r a p i dp r o t o t y p i n g , r p )圈义州卜圈蕊可，0第一章绪论快速成型技术是一种基于离散堆积原理的数字化成型技术，能够根据产品的要求，在计算机上设计出三维模型，而不需要特殊的模具、工具或人工干涉。r p 诞生以来已经形成了数十种快速成型工艺，目前比较成熟的工艺包括三维印届l j ( t h r e ed i m e n s i o n a lp r i n g t i n g ，3 d p ) 、分层实体制造( l a m i n a t e do b j e c tm a n u f a c t u r i n g ，l o m ) 、激光选区烧结( s e l e c t i v el a s e rs i n t e r i n g ，s l s ) 、立体平版印刷术( s t e r e o l i t h o g r a p h y , s l a ) 等，这几种工艺在组织工程支架制备中均有研究。清华大学熊卓等【4 7 1 采用了一种新的p l l a 多孔框架结构的制备工艺即精密挤出成形工艺，这种工艺是基于先进制造领域的快速成形的基本原理所开发的，该工艺在植入体制造和2 0 0 5 0 0 t m 孔隙结构成型方面比其他成型工艺有优势，但该技术应用于组织工程未成熟，有待开发。1 5 聚乳酸多孔支架材料的表面改性虽然许多研究者采用不同方法制备了聚乳酸多孔支架，并对其性能进行了多方面的研究，但仍存在许多不足。首先，聚乳酸材料在对细胞亲和力方面表现很弱，妨碍了细胞的贴附；其次，聚乳酸多孔支架有较高的孔隙率，无论哪种方法制备的多孔支架强度都较低，力学性能方面的不足极大地限制了支架在临床骨修复中的应用。因此，在制备具有一定孔隙结构的聚乳酸多孔支架的基础上，许多研究者开始致力于以改善聚乳酸多孔支架力学性能和表面生物性能为目的的改性研究，以期得到性能更加优良的聚乳酸多孔支架材料。迄今为止，国内外材料科学家已经对多种聚乳酸多孑l 支架改性方法进行了探索。1 5 1 化学改性化学改性法通过共聚、接枝等方法来改变聚乳酸的组成，通过与其它单体共聚可以改变材料的结晶性、亲水性、柔韧性及其在生物体内的降解速度等，从而使聚乳酸支架获得具有良好细胞亲和性的表面。( 1 ) 嵌段共聚改性：在聚乳酸的共聚物中，已研究过的大多属于聚酯聚酯共聚物。而聚醚高分子具有优良的生物相容性、血液相容性、亲水性和柔软性。疏水的聚乳酸链段中引入亲水的聚醚链段，可提高材料在生物体内的相容性，制得可控生物降解速率的聚酯聚醚材料。目前已成功地合成了聚乳酸聚乙二醇嵌段共聚物，以及聚乳酸聚四亚甲基醚二醇嵌段共聚物，其中软段的聚醚高分子为结晶型聚合物。为了改变共聚材料软段的组成结构，调节材料亲水疏水链段比例，熊成东等【4 9 】选用无定型的聚丙二醇( m n = 2 0 0 0 ) 为共聚单体，以无水s n c l 2 为催化剂，合成了聚乳酸聚丙二醇嵌段共聚物，并对其性能进行了表征。以丁二酸酐直接偶联低分子量的聚丙交酯聚乙二醇三嵌段共聚物制备多嵌段共聚物( p l e ) 是另一种共聚改性方法。测试结果表明p l e 对水的接触角均低于p l l a 均聚物；p l l a 均聚物的吸水率几乎为0 ，而多嵌段p l e 共聚物的吸水率随着p e g 含量的增加而增加。多嵌段p l e 共聚物亲水性的增强改善了p l l a 支架的细7东南大学硕士学位论文胞亲和性1 5 0 j 。( 2 ) 接枝共聚改性：目前，已有不少关于改善p l a 亲水性及使其功能化的研究报道，但大多以丙交酯与亲水性的低聚物或单体如聚乙二醇( p e g ) 、甲基丙烯酸羟乙酯( h e m a ) 、氨基酸和多糖类等的共聚来实现改性目的，有关直接以p l a 接枝改性来改善其亲水性的研究报道很少。聚乙烯基吡咯烷酮( p v p ) 亲水性、血液相容性和生理相容性均较好，罗丙红【5 i 】等人为改善( d ，l 乳酸) ( p d l l a ) 的亲水性，以过氧化二苯甲酰为引发剂，四氢呋喃为溶剂，进行了p l l a 接枝乙烯基吡咯烷酮( v p ) 的试验。i r 和1 hn m r测试结果表明：p d l l a 可与v p 实现接枝反应，摩尔接枝率为1 0 1 6 ，与p d l l a相比，接枝产物的特性黏度下降，但吸水率增加、接触角变小，亲水性有所改善。k i s s e l等【5 2 1 用聚电解质、二乙基氨乙基环糊精氯化物和环糊精的硫酸钠盐在辛酸亚锡的作用下引发l a 或l a + g a 本体聚合制得一系列短刷状接枝共聚物，产物中聚电解质主链可增加体系的亲水性。k i s s e l 等还制备了一系列含侧基聚合物接枝p l g a 的共聚物，这些产物在结构上是主链亲水而侧链憎水的体系。1 5 2 等离子体表面处理低温等离子体改性法是利用等离子技术使材料表面引入不同基团，从而使材料具有细胞识别位。通过等离子体处理后，能够在高分子材料表面固定生物活性分子，达到作为生物医用材料的目的。等离子体表面改性技术的特点是：它对材料表面的作用深度仅数百埃，不会影响基体材料的性质；能够处理各种形状的表面；有较强的杀菌作用。因此低温等离子体技术是生物医用材料较理想的表面处理技术。研究表明，高分子材料在经氨、氧、水等离子体处理后能在高分子材料表面引入n h 2 , - c o o h ，o h 等基团。s i p e h i a 通过氨等离子体在培替氏培养皿表面及聚四氟乙烯表面接枝上- n h 2 ，c o o h ，o h ，促进了细胞在材料表面的粘附与生长。如经过氨等离子体处理后的p d l l a 膜的表面亲水性得到了改善。从表面自由能的分析可知，表面极性基团的含量大大高于改性前。含氨基团如n h 2 等的引入，不仅可提高材料表面的亲水性，而且氨基在生理p h 环境下由于质子化作用而带上正电荷，有利于带负电荷的细胞吸附，此外，含氨基团可与血浆中的细胞粘附蛋白如纤维粘连蛋白等通过氢键结合，从而从多方面促进细胞在材料表面的粘附和生长。对鼠3 t 3 成纤维细胞在材料上的培养试验表明，用氨等离子体改性的p d l l a 对细胞在材料上的粘附与生长有明显地促进作用【5 3 1 。c h u 等【5 4 】采用氨等离子体技术修饰p l l a ，然后再进行人的内皮细胞( h u v e c ) 和兔子的微脉管内皮细胞( r b m v e c ) 培养。结果显示，经氨等离子体技术修饰的p l l a 在h u v e c 和r b m v e c 增殖效果要优于未修饰的p l l a l j 。1 5 3 表面涂覆表面涂覆是最简单的生物材料表面改性技术。在化学惰性的聚合物表面涂覆一层具第一章绪论有良好生物相容性的材料，可大大提高其生物相容性。表面涂层的关键是要采取一定措施提高涂层的稳定性。e l a m 等【5 6 】为了将纤维素稳定涂层于聚四氟乙烯医用导管材料表面，制备了乙基羟乙基纤维素( e t h y lh y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e ，e h e c ) ，这种疏水化的多糖分子中的疏水基团可与疏水性的聚合物表面发生较强的相互作用。而且e h e c 在高于3 6时会转变为不溶于水的聚合物，使e h e c 涂层更加稳定。e h e c 中的亲水部分可有效地阻止血浆中蛋白质在材料表面的吸附，延缓凝血现象的发生。实验表明，表面涂层e h e c后的聚四氟乙烯医用导管的凝血时间明显延长。1 6 论文的选题和研究内容1 6 1 论文的选题本课题组孙浩【5 7 1 、段瑜亮等已经以聚乳酸为支架材料、冰粒子为致孔剂，通过正压渗流- 冷冻干燥复合工艺制备出了高孔隙率、孔隙大小可调的骨组织工程支架，但是所制备的聚乳酸多孔支架存在表面不利于细胞吸附、机械强度不高的缺点，限制了其用途，本课题针对这些缺点展开研究。在上述多种支架表面改性方法中，表面涂覆工艺具有工艺过程简单、容易控制、涂层介质选择范围大的优点，所制得的改性支架能够在保持高孔隙率、孔隙大小的同时使支架的力学性能和亲水性得到提高。然而该方法也存在涂层与基体界面结合的问题。本论文将采用多层涂覆的方法来解决涂层与基体界面的结合问题。1 6 2 研究内容本论文对聚乳酸多孔支架的力学性能、亲水性、涂层与基体界面结合及h a 在涂层分布进行研究，论文包括以下几方面工作：( 1 ) 聚乳酸多孔支架和涂层制备。主要研究支架制备、涂层处理前后支架的形貌和力学性能以及涂层处理后支架的组成；( 2 ) 涂层制备工艺的优化。主要研究预涂层、戊二醛交联、明胶浓度、涂覆次数、干燥工艺等对多孔支架性能的影响，并且对涂层制备工艺进行优化；( 3 ) 复合涂层制备。主要研究h a 颗粒大小、h a 含量及涂覆次数等对支架性能的影响。9第二章实验材料、制备与测试方法第二章实验材料、制备与测试方法本章主要介绍在论文研究中所使用的材料、实验设备、p l l a 多孔支架制备及表面涂覆方法、支架经过表面涂覆后性能的测试方法。2 1 实验材料和设备2 1 1 实验材料聚乳酸( p l l a ) ：山东省医疗器械研究所，平均分子量1 0 万；氯仿( c h c l 3 ) ：上海久亿化学试剂有限公司( 分析纯) ；明胶( g e l a t i n ) ：上海申鹤化学品有限公司( 分析纯) ；戊二醛( c 5 h 8 0 2 ) ：上海国药集团试剂有限公司；羟基磷灰石( h a ) - 实验室自制。2 1 2 实验设备冷冻干燥设备：实验室自制；正压渗流成型装置：实验室自制；离心制样机：实验室自制；行星式球磨机( q m 1s p ) ：南京大学仪器厂；真空干燥箱( d z f 6 0 9 0 ) ：上海实验仪器有限公司；b c d 2 5 7 d v c 家用冰箱：青岛海尔集团；不锈钢标准筛：南京荣华科学器材公司( 6 0 目、4 0 目、3 5 目、3 0 目和2 4 目) ；t g 3 2 8 a 分析天平：上海精密科技仪器有限公司。2 1 3 测试设备x 1 1 5 型体视显微镜：南京江南光电( 集团) 股份有限公司；s i r i o n 场发射扫描电子显微镜：荷兰f e i 公司；n i c o l e t 7 5 0 傅立叶红外光谱仪：美国n i c o l e t 公司；c m t 5 1 0 5 万能实验机：深圳市新三思计量技术有限公司。2 2p l l a 多孔支架涂层的制备方法l o东南大学硕士学位论文离心处理i冷冻干燥l表面改性支架图2 1p l l a 多孔支架表面涂层制备工艺流程图p l l a 多孔支架表面涂层的制备工艺流程如图2 1 所示，主要步骤为：1 ) 应用正压渗流冷冻干燥复合工艺【5 9 j ，采用冰粒子作为致孔剂，制备孔隙结构良好的组织工程用p l l a 多孔支架；2 ) 对支架进行前处理，其目的是增加涂层与支架的结合强度( 即加大附着力) 。课题组前期研究工作中已经应用碱水解工艺唧】对聚乳酸支架进行改性处理，实验结果表明碱水解处理可以提高支架的亲水性。而且，碱水解可以粗化基体表面，从而增大涂层与基体接触面积，增加涂层材料与基体表面的嵌合作用，以加强涂层与基体的附着力；在碱水解的过程中聚乳酸分子链中的酯基断链形成c o o ，使表面带有一定的负电荷，有利于涂层与基体的结合。基于以上考虑，本实验采用碱水解作为前处理工艺。3 ) 将经过前处理的p l l a 多孔支架浸泡于配制好的明胶或明胶h a 混合溶液中，在温度为4 5 的真空室中涂覆2 小时后取出；4 ) 将涂覆后的多孔支架放置于离心涂覆机中进行离心处理，离心转速为6 0 0 转分钟，1 分钟后取出样品，将样品顺时针旋转9 0 0 ，再次离心处理，如此反复三次，以保证涂层在支架表面涂覆均匀；5 ) 将样品放于冷冻干燥设备中，在1 0 温度下冷冻干燥多孔支架。2 3 多孔支架性能测试方法2 3 1 三维结构观察p l l a 及涂层均为非导体，在低电流条件下喷金用扫描电镜观察支架形貌和涂层界面形貌。第二章实验材料、制备与测试方法2 3 2 支架孔隙率测定多孔支架的孔隙率采用密度法【6 l 】测定，公式如下：s ：1 一竖：1 一旦( 2 1 )y w 吣l ey m h d e p。、。式中：p 聚合物原始密度( 1 2 6 9 c m 3 ) ；膨一多孔支架的质量；v w h 。如多孔支架的总体积；o 慨广- 聚合物的体积。涂覆后支架的孔隙率通过测量涂覆前后支架的重量后计算得出。首先测量支架的体积，然后通过密度法测量未经涂覆支架的孔隙率。最后测量出支架在涂覆前后的质量，它们的差值就是明胶在支架上涂覆的量。根据明胶的密度可以计算出它在支架表面涂覆的体积，然后再计算该体积占处理前支架材料体积的百分比，从而算出涂覆后减少的孔隙率。涂覆后的孔隙率由下式计算：艿l = s o a s ：s o i m i _ - m o( 2 2 )y o p g式中：一涂覆上明胶的体积；一支架的体积；m l 涂覆后支架的重量；聊r 涂覆前支架的重量；p 广明胶的密度( 1 2 5 9 c m 3 ) ；万r 一涂覆后支架的孔隙率；2 3 3 支架力学性能测试采用压缩强度表征p l l a 多孔支架和表面改性后多孔支架的力学性能。将试样制备成5 5 1 0 m m 3 的长方体，按照g b t1 0 4 1 1 9 9 2 的标准检测聚乳酸类多孔支架的压缩强度。加载速度为5 m m m i n 。如试样在变形小于2 5 之前断裂，断裂强度即为压缩强度；如试样在变形超过2 5 后没有断裂，则变形2 5 时的强度即为压缩强度。2 3 4 支架亲水性测试采用吸水率来评价表面改性对聚乳酸多孔支架亲水性的影响，具体步骤是：在室温下，将明胶处理前后的多孔支架放于蒸馏水中浸渍，在不同时刻取出样品，用滤纸吸干表面的水，分别称重，按下述公式计算吸水率6 2 1 。允=兰：型二竺：塑1 0 0 彬，却1 2( 2 3 )东南大学硕士学位论文式中：月样品的吸水率；峨奶一样品吸水前的重量；w 。一样品吸水后的重量。第= 章诛层制备i 艺研究第三章涂层制备工艺研究水章应用】f 压渗流玲冻二1 二燥复合工艺。采用冰粒子作为致孔剂制备出了孔隙结构良好的组织工程用p l l a 多孔支架。针对聚乳酸多孔支架材料力学性能和亲水性较差的情况，采用表面涂覆工艺制备了明胶和明胶刑a 涂层并研究了明胶浓度、戊二醛交联时剧和h a 含量对浆乳酸多孔支架的力学性能、孔隙特征、孔隙率和亲水性的影响。3 i 明胶浓度对聚乳酸多孔支架表面涂层的影响3 1 1 明胶浓度对孔隙特征的影响图3 一l 是不同浓度明胶溶液涂覆前后聚乳酸多j l 支架的孔隙结构。如图3 1 ( a ) 和( b )所示，山正压渗流- 冷冻干燥复台工艺制各的p l l a 多孔支架的孔壁上存在大量由氯仿升华所形成的微孔微i l 的存在增加了支架表面粗糙度和大孔之间的连通性。在明胶涂覆支架过程中，明胶溶液会将尺寸较小的微孔堵塞，由图3 i ( c ) 和( e ) 可见，与未经涂覆的支架孔壁相比，经过不同浓度明胶溶液涂覆的支架中氯仿升华形成的微孔几乎完全被明胶覆盖，表面变得比较光滑。图3 1 ( d ) 和( 0 是涂覆支架后的断面形貌图，由图可见，涂覆后支架表面紧密贴覆明胶层，并且随着明胶浓度的增加，明胶层在支架表面的厚度也在逐渐增加。明胶溶液的黏度随着明胶溶液浓度的增加而增加，在相同离心速率条件下，溶液黏度越太，越难以离心除去，留在支架表面的明胶越多。东南太学顾上学位论文豳3 - i 不同浓度明胶涂覆后多孔支架的孔隙形貌( a ) ( b ；( c ) ( d ) 5 ；c e ) ( o l o 3 1 2 明胶浓度与支架孔隙率和增重的关系c o a c e n t r a l i o no f g e l a t i ns e l u t i o n w t 幽3 - 2 明腔浓度i 4 多孔支架孔隙率和增重的芙系#_；j；5e_掌、，-*-；第三章涂层制备工艺研究图3 2 是明胶溶液浓度与多孔支架的孔隙率和增重之间的关系。随着明胶溶液浓度的增大，明胶涂层在支架表面的壁厚逐渐增加( 图3 1 ( d ) 和( f ) ) ，支架中大孔的孔径逐渐减小，而且随着明胶浓度增大支架中出现堵孔现象，导致涂覆后支架的质量增加，孔隙率减小。3 1 3 明胶浓度与支架孔隙率和压缩强度的关系051 0c o n c e r n t r a t i o no fg e l a t i ns o l u t i o n w t 哆0图3 3 明胶浓度与多孔支架孔隙率和压缩强度的关系图3 3 是明胶浓度与多孔支架孑l