（遗传学专业论文）人类hspc129基因的克隆及功能研究.pdf

p h o s p h o d l a t i o nr e g u l a t i o no f r n a p i ic t d k e y w o r d s ：c t d p h o s p h a t a s e ； d e p h o s p h a r y l a t i o n ；h s p c i 2 9 ；c t d s p l 2 b l a s t c t d c p d e b e s t m r r cp a n e l o r f s a g e p a g e p b s p c r r r - p c r 3 - u i r 5 u c r n a p g s t h r p 英文缩略词 b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l c - t e r m i n a ld o m a i n c t d p h o s p h a t a s ed o m a i n 鼬i d i u mb r o m i d e e x p r e s s e ds e q u e n c et a g m u l t i p l et i s s u ee d n a p a n e l o p e nr e a d i n gf r a m e s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n p o l y a e r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v e r s et r a n s c r i p tp c r 3 - u n t r a n s l a t e d 鼬g i 5 - u n t r a n s h t e ar e g i o n r n a p o l y m e r a s ei i g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 5 同源性检索工具 c 端结构域 c t d 磷酸化结构域 溴化乙锭 表达序列标签 多组织e d n a 板 开放阅读框 基因表达系列分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 逆转录p c r 3 非翻译区 5 非翻译区 r n a 聚合酶 谷胱甘肽s 转移酶 辣根过氧化物酶 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：越亟日期：塑宰：兰 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名： 萼坚 牛 摘要 在真核生物中r n a 聚合酶i i ( r n a p i i ) 是负责m r n a 和h n r n a 的转录合 成。r n a p u 多亚基复合酶体，它最大亚基r p b i 的羧基末端有一个独特结构域 c - t e r m i n a ld o m a i n ( c t d ) 。c t d 串联重复序列s e r - 2 和s e r - 5 位点的可逆磷酸化 修饰引起r p b l 构象和性质的变化，从而在r n a 转录的起始、延伸、m r n a 修 饰等过程中起着重要的调节作用。 目前已确定有多种哺乳动物c t d 激酶可在体外或体内磷酸化c t d ，但已知 的人类c t d 磷酸酶则只有f c p l 、s c p i 、u b c p i 。这三个磷酸酶都含有一个特 定的c t d 磷酸酶催化结构域c t dp h o s p h a t a s ed o m a i n ( c p d ) 。在人类胎脑e d n a 文库的序列分析工作中，我们发现了一个h s p c i 2 9 基因( 又名c t d s p l 2 ) ，其 编码的蛋白也含有和前面三个基因相似的c t d 磷酸酶催化结构域，然而其c t d 磷酸酶却并没有得到证实。在本文中我们对h s p c i 2 9 进行了生物信息学分析，原 核表达及纯化，c t d 磷酸酶活性检测。 b l a s t - n 分析表明该基因定位在人类染色体1 5 q l1 2 区域，含有1 3 个外显 子。该基因编码的蛋白含有4 6 6 氨基酸，分子量为5 3 1k d a ，等电点为6 3 9 。 b l a s t - x 分析表明该蛋白在多种生物中保持很高的同源性。h s p c i 2 9 在人类各 种组织中广泛表达，其中睾丸，脾，胸腺，前列腺中表达量较高，而卵巢，小肠， 直肠和外周血中表达量较低。原核表达的g s b h s p c l 2 9 1 m ( 去掉了包含跨膜 区的1 5 6 个n 端氨基酸) 具有明显的磷酸酶活性。体外p n p p 底物分析表明，该 蛋白活性最适温度在3 0 c 附近，最适p i - i 值5 o ，并且呈镁离子依赖性。这些特 性与f c p l ，s c p l ，u b l c p l 相同，提示它可能和这三个蛋白一样也具有c t d 磷酸酶活性。进一步分折试验表明，h s p c i 2 9 能够对c t d 的s e r - 2 和s e r - 5 位点 有效的去磷酸化，说明h s p c i 2 9 很可能在体内参与了r n a p i i 中c t d 可逆磷酸 酶过程。 关键词：c t d 磷酸酶；r n a 聚合酶i i ；转录；去磷酸化；h s p c i 2 9 ；c 1 d s p l 2 a b s t r a c t r n a p o l y m e r a s e i if r n a p i i ) i st h ep r i n c i p a le n z y m ef o rh n r n a sa n ds n r n a s s y n t h e s i s i ti sac o m p l e xe n z y u l ec o n t a i n i n g1 2p r o t e i ns u b u n i t s t h el a r g e s ts u b u n i t o fr n a p i ic o n t a i n sa u n i q u ec - t e m f i n a ld o m a i n ( c t d ) r e v e r s i b l ep h o s p h o r y l a f i o n , m a i n l ya c c u r r i n ga tt h es e r - 2a n ds e t - 5w i t h i nt e r d o mr e p e a t so fc t d ，c h a n g e s r p b l sc o n f o r m a t i o na n dp r o p e r t y t h e s ec h a n g e sp l a ya ne s s e n t i a lr o l ei nr e g u l a t i o n o f r n a t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n , e l o n g a t i o n , c a p p i n g , s p l i c i n ga n d 3 e n d p r o c e s s i n g b yn o w , m a n ym a m m a l i a nc t dk i n a s e s ，p h o s p h o r y l a t i n gc t di nv i t r oo ri nv i v o ， h a v eb e e nr e v e a l e d ，w h e r e a so n l yt h r e eh u m a nc t d p h o s p h a t a s e s ：f c p i ，s c p la n d u b l c p lh a v eb e e ni d e n t i f i t e dy e t a i lt h et h r e eh u m a nc t d p h o s p h a t a s ec o n t a i na s p e c i a lc t dp h o s p h a t a s ed o m a i n ( c p d ) d u r i n gt h el a r g es c a l eh u m a nf e t a le d n a l i b r a r ys e q u e n c ea n a l y s i si no u tl a b ，w ef i n dag e n e ，h s p c i 2 9 ( a l s or e f e rt oa s c t d s p l 2 ) ，e n c o d e sap r o t e i nc o n t a i n i n gc p dd o m a i ns i m i l a rt ot h a to fo t h e r p h o s p h a t a s e s h o w e v e ri t sb i o l o g i c a lf u n c t i o nh a dn o tb e e nc h a r a c t e r i z e dy e t h e r e ， w er e p o r tt h eb i o i n f o r m a t i o na n a l y s i s ，e x p r e s s i o n , p u r i f i c a t i o na n dc t d p h o s p h a t a s e a c t i v i t yt e s to f h s p c i 2 9 1 kr e s u l to f b l a s l - ns e a r c ha g a i l l s th u m a ng e n o m ed a t a b a s eo f g e n b a n ks h o w s t h a tt h eg e n el o c a t e so n5 q 3 3 3a n dc o n t a i n s1 3e x o n s i te n c o d e sa4 6 6a m i n oa c i d p r o t e i n , w h o s ep r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h ti s5 3 1k d aa n di s u e l e c t r i cp o i mi s6 3 9 b l a s t xs e a r c ha g a i n s tt h en o n - r e d u n d a n td a t a b a s ei ng e n b a n kr e v e a l st h a t o r t h o l o g so fh s p c i 2 9a r eh i g h l yc o n s e r v e di nm a n yd i f f e r e n to r g a n i s m s 1 kt i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s i o np a t t e ro fh s p c i 2 9r e s u l ts h o w st h a ti ti sw i d e l ye x p r e s s e di n d i f f e r e n tt i s s u e s ：r e l a t i v e l yh i g h e ri nt e s t i s ，s p l e e n , t h y m u s ，a n dp r o s t a t e ，w h i l el o w e r i no v a r y , s m a l li n t e s t i n e ，c o l o n , a n dp e r i p h e r a l - b l o o dl e u k o c y t e g s t - h s p c i 2 9 n 订 ( w i t hf i r s t15 6n - t e r m i n a la m i n oa c i d si n c l u d i n gt r a n s m e m b r a n es e q u e n c et r u n c a t e d ) e x p r e s s e di ne c o l ic e l ls h o w so b v i o u sp h o s p h a t a s ea c t i v i t yi nv i t r o p n p pa n a l y s i s s h o w st h a ti t so p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r ei sa b o u t3 0 ，t h eo p t i m a lp hi s 5 0a n d i t sa c t i v i t yi sm 矿d e p e n d e d t h e s ep r o p e r t i e sa r es i m i l a rt ot h a to f f c p l ，s c p ia n d u b l c p l 。w h i c hi m p l i e st h a th s p c i 2 9m a ya l s oh a v ec t dp h o s p h a t a s ea c t i v i t y f u r t h e rg s t - c t da n a l y s i sr e s u l t ss h o wt h a th s p c i 2 9d e p h o s p h a t a s es e r - 2a n ds e r - 5 i nc t do b v i o u s l y s ow ep r o p o s e dt h a th s p c i 2 9m a yp a r t i c i p a t ei nt h er e v e r s i b l e 4 p h o s p h o d l a t i o nr e g u l a t i o no f r n a p i ic t d k e y w o r d s ：c t d p h o s p h a t a s e ； d e p h o s p h a r y l a t i o n ；h s p c i 2 9 ；c t d s p l 2 b l a s t c t d c p d e b e s t m r r cp a n e l o r f s a g e p a g e p b s p c r r r - p c r 3 - u i r 5 u c r n a p g s t h r p 英文缩略词 b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l c - t e r m i n a ld o m a i n c t d p h o s p h a t a s ed o m a i n 鼬i d i u mb r o m i d e e x p r e s s e ds e q u e n c et a g m u l t i p l et i s s u ee d n a p a n e l o p e nr e a d i n gf r a m e s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n p o l y a e r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v e r s et r a n s c r i p tp c r 3 - u n t r a n s l a t e d 鼬g i 5 - u n t r a n s h t e ar e g i o n r n a p o l y m e r a s ei i g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 5 同源性检索工具 c 端结构域 c t d 磷酸化结构域 溴化乙锭 表达序列标签 多组织e d n a 板 开放阅读框 基因表达系列分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 逆转录p c r 3 非翻译区 5 非翻译区 r n a 聚合酶 谷胱甘肽s 转移酶 辣根过氧化物酶 1 1 前言 第一章综述 在真核生物中有四种r n a 聚合酶发挥着转录作用，分别称r n a 聚合酶i 、 、和m t r n a 聚合酶。其中r n a 聚合酶i 转录生成除5 sr r n a 外的各种 r r n a 。r n a 聚合酶转录的产物都是小分子量的r n a ，t r n a 、5 s r r n a 和 s n r n a 。m tr n a 聚合酶负责线粒体中的r n a 合成。而r n a 聚合酶i i ( r n a p i i ) 转录生成h n r n a 和m r n a ，是真核生物中最活跃的r n a 聚合酶。 转录作用过程可以分为三个阶段：起始、延长及终止。在起始阶段，r n a 聚合酶识别转录启始位点，结合到该位点将d n a 双链解螺旋，并聚合产生r n a 最初的几个碱基；延长阶段，r n a 聚合酶构型发生变化，离开转录启始位点区 域，向前继续转录，r n a 链延伸。终止阶段，r n a 聚合酶遇到转录终止因子， 从d n a 上脱落，转录终止。研究表明，r n a 聚合酶转录作用同时也与m r n a 的加工处理如5 加帽、3 加尾、r n a 剪接、核苷酸编辑、甲基化修饰等过程相 偶联，所以转录作用相关的调控也会影响到r n a 的修饰和成熟。 r n a p i i 是一个由1 2 个亚基组成的复合酶体( s c n t e n a c 丸1 9 8 5 ) 。其中最大的 亚基r p b l 含有1 9 7 0 个氨基酸，分子量约2 2 0 k d 。r p b l 的羧基末端有一个独特 的结构域，c t d 。该区域的可逆磷酸化在r n a pi l 转录调控中起着重要的作用。 研究表明，含有未磷酸化c t d 的r n a p i i 参与转录启始复合物的形成，而后c t d 被磷酸化，r n a pi i 转录复合酶体构型发生变化，开始转录延伸。而且c t d 的 磷酸化状态也会影响r n a 的5 加帽和3 加尾等转录后修饰。因此，c t d 磷酸化 状态和r n a 转录合成及其后期成熟密切相关，而对调节c t d 磷酸化状态的相 关酶研究将有助于我们进一步了解r n a 转录表达的分子调控机制。 c t d 由串联重复的7 氨基酸序列组成( t y r l s e r 2 p r 0 3 t h r 4 s e r s p r 0 6 s e r 7 ) ，这 个序列在物种间高度保守，只是重复的次数不同，在酵母中重复2 6 - 2 8 次，线虫 3 2 次，在果蝇中是4 5 次，哺乳动物中5 2 次。其磷酸化主要发生在重复序列中 s e r - 2 和s e r - 5 位点。在转录起始后期及延伸的早期( 启动子清除) c t ds e r - 5 被 磷酸，而转录复合物行进到远离启动子区域时s e r - 2 被磷酸。此外，c t d 能够与 许多蛋白相互作用( h i r o s e e ta l ，2 0 0 0 ：o r p h a n i d e se t a l ，2 0 0 2 ) ，在转录过程中， c t d 的磷酸化状态不仅影响r n a p i i 本身的构像，也通过其构像的改变招募不同 6 的蛋白因子进入转录复合体中。 7 目前已经发现有多种激酶能够对c 1 i ) 进行磷酸化，包括c d k l ，c d k 7 ， c d k 8 ，c d k 9 ，e r k i 2 等，其中c d k 7 ，c d k 8 和c d k 9 被认为是主要的c t d 激酶( p r e l i c h ，2 0 0 2 ) 。这几个激酶在酵母到哺乳动物中都非常保守，而且都属 于蛋白复合体中的一个亚基。c d k 7 是t f i i h ( o r p h a n i d e se ta l ，1 9 9 6 ) ，它负责 在形成第一个磷酸二酯键后对c t d 的s e t - 5 进行磷酸化( a k o u l i t c h e ve t a l ，1 9 9 5 ) 。 k i n 2 8 是c d k 7 在酵母中的同源蛋白，它对c t d 的磷酸化有利于招募加帽酶， 并调控启动子清除( r o d r i g u e z e ta l ，2 0 0 0 ：o r p h a r l i d e se ta l ，2 0 0 2 ) 。c d k 8 在转 录延伸之前发挥其功能( m a l d o n a d oe ta l ，1 9 9 6 ；c h oe ta l ，1 9 9 9 ) 。c d k 9 是p - t e f b ( p o s i t i v et r a n s c r i p t i o ne l o n g a t i o nf a e o rb ) 的一个亚基( z h u e ta l ，1 9 9 7 ) ，p t e f b 对c t d 的磷酸化位点是s e t - 2 ( s h i me ta l ，2 0 0 2 ；n ie ta l ，2 0 0 4 ) ，其功能是促 进转录的延伸。p - t e f b 的另一个亚基c y c l i nt 能够通过组氨酸富集区识别c t d ， 最近的研究报道线虫中的p i e - i 转录抑制因子通过阻碍c y c l i nt 与r n a p i ic t d 结合而抑制转录的延伸( z h a n ge t a l ，2 0 0 3 ) 。此外，p - t e f b 也受到核内小r n a 7 s k 的调控，与7 s k 的结合会抑制p - t e f b 的激酶活性( n g u y e ne ta l ，2 0 0 l ； y a n g e ta l ，2 0 0 1 ) 。 而目前发现的c t d 磷酸酶还比较少，特别是哺乳动物c t d 磷酸酶，目前已 知的只有三种：f c p l ( t f i i f a s s o c i a t e dc t d p h u s p h a t a s e1 ) ，s c p i ，u b l c p l 。 f c p i 是第一个被鉴定的哺乳动物c t d 磷酸酶。人的f c p l 由9 6 1 个氨基酸组成， 含有b r c t ( b r e a s tc a n c e l lct e r m i n u s ) 结构域，该结构域具有c t d 磷酸酶催化 活性并促进f c p l 和相关底物的结合。从h e l a 细胞中纯化的f c p i 能够促进体外 转录，并且参与r n a p i i 的转录循环( c h oc ta l ，1 9 9 9 ；m a n d a le ta l ，2 0 0 2 ) 。酵 母中的研究显示f c p l 能够在体内对r n a p i i 去磷酸化，并且在遗传学上有相互 作用( k o b o re ta l ，1 9 9 9 ) 。哺乳动物中f c p l 对c t d 两个s e t 位点具有相似的 去磷酸化活性强度。 s c p l 含有一个与f c p l 相同的c t d 磷酸酶结构域，能够对s e t - 2 和s e t - 5 位点进行去磷酸化。与f c p l 不同的是，s c p l 优先对c t ds e t - 5 作用( y e oe ta l ， 2 0 0 3 ) 。s c p l 能够影响转录，t f i i f 也能够促进它的活性，这与f c p l 相似。最 近发现的u b l c p l ( z h e n ge ta l ，2 0 0 5 ) 具有与f c p i 和s c p l 相似的磷酸酶结构 域，且能够在体外催化c t d 的去磷酸化。和s c p i 一样，u b l c p l 催化活性偏好 于s e t - 5 位点。对与s e r - 2 位点，其催化活性很低。不同的是u b l c p i 还含有一 个泛素样蛋白结构域，该结构域的存在可能将u b l c p l 引入泛素相关的蛋白周 8 期调控中。但关于s c p i ，u b l c p l 在转录中的调控机理有待深入研究。 1 2 真核r n a 聚合酶概述 1 9 6 9 年，三种主要的真核r n a 聚合酶首次被分离出来。后期研究发现他们对 m n 2 + ，m 矿和a - 鹅膏菌素浓度的耐受性存在明显差异，可能存在不同的细胞内 定位，行使不同的生物学功能( r o e d e r e ta l ，1 9 6 9 ) 。进一步研究证明这三种r n a 聚合酶在生物体中识别不同的转录启动子从而转录不同类型的r n a 。r n a 聚合 酶i 转录除5 s r r n a 外的各种r r n a ：r n a 聚合酶i i ( r n a p i i ) 转录生成h n r n a 和m r n a ；r n a 聚合酶i i i 转录t r n a ，5 s r r n a 和s n r n a 。后来，又有研究表 明在线粒体中存在第四种r n a 聚合酶m tr n a 聚合酶，它负责线粒体中的 r n a 合成( k e l l y e ta 1 ，1 9 8 6 ；m a s t e r se ta 1 ，1 9 8 7 ) 。这四种聚合酶都是复合酶体， 其中r n a p i 含有1 3 个亚单位，r n a p i i 有1 2 个亚单位，r n a p l i i 有1 4 个， 而m t r n a p 只有两个亚单位( s e n t e n a c a 1 9 8 5 ) 。 在转录过程中，r n a 聚合酶结合到转录启动子上，并在多种转录因子的作用 下进行转录的启始和延伸。以r n a pi i 为例：t f i i d 含有一个t a t a b o xr e c o g n i z e 区域( t b p ) ，能帮助r n a p i i 酶识别并结合到启动予的t a t a 区；t f i i a 有助于 i t i i d 与t a t a 盒核心启动子结合，而t f i i b 的c 端与t f i i d 和d n a 的复合物 结合，n - 端与t f i 珂协同作用募集r n a 聚合酶i i ，再加上t f i i f , t f i i h 形成完整 的转录复合物。其中t f i i f 使r n a 聚合酶的结合区域扩大到3 4 到+ 1 7 区；t f i i h 则对r p b l 的c t d 区域进行磷酸化，促使转录在离开启动区后的延伸。此外还 有t f i i e 在体外促进该过程，i i s 和t f i i f 则通过抑制转录暂停而促进转录的延 伸。 1 3c t d 可逆磷酸化对转录的调节 1 3 1c t d 结构域的发现 早期的r n a pi i 结构研究发现其最大的亚基r p b l 存在异质性，即有i i a ，i i b 和i i o 三种形式的r p b l 存在，它们的分子量分别为2 1 4 ，0 0 0 ，1 8 0 ，0 0 0 ，2 4 0 ，0 0 0 。 后来证实a 是砌6 j 基因的原始产物，i i a 在体外被蛋白酶水解，缺失了一段 ( t y r - s e r - p r o - t h r - s e r - p r o s e t ) 重复序列的区域，从而形成i i b 。这段区域位于 r p b l 的c 末端，所以被命名为c - t e r m i n a ld o m a i n ( c t d ) 。i i a 在体内被磷酸 9 化后形成i i o ，而该磷酸化正发生在c 1 d 中的s e r 和1 1 1 r 位点上。 事实上，在体内只存在两种r p b l ，即a 和i i o 。他们的区别就在于c t d 区 域的磷酸化状态。而i i b 只是体外实验的产物。但是在后来的研究中磷酸化程度 介于a 和i i o 中的类型也有被发现，例如i l l ( r i c ee ta l ，1 9 9 4 ；j e n k i n se ta l ，2 0 0 1 ) ， l l m ( m a p 激酶依赖) ( b o n n e te ta l ，1 9 9 9 ；p a l a n c a d ee ta l ，2 0 0 1 ) 。 1 3 2 t f i i h 对c t d 的磷酸化 t f i i h 是最后一个结合到转录启始复合物上的转录因子。r e i n b e r g 等发现该 蛋白在有a t p 的环境中能将r n a p i i a 磷酸化，形成r n a p i i o 迸一步实验证 明，t f i i h 磷酸化的部位正是r p b l 的c t d 区域。 事实上r n a pi i a 中c t d 也存在着磷酸化，但是其磷酸化水平非常低，而 在r n a pi i o 中则是高度磷酸化。c t d 的磷酸化碱基主要是2 位和5 位的s e r ， 少数t h r 和t y r 也会被磷酸化( z h a n g e ta l ，1 9 9 1 ；b a s k a r a ne ta l ，1 9 9 3 ) 。在 哺乳动物的i i o 型磷酸化中，大约有5 0 个8 e r 残基被磷酸化，平均每个重复序列 中一个s e r 被磷酸化( p a y n ee ta l ，1 9 9 3 ) 。 1 3 3c t d 的可逆磷酸化 在转录的初始阶段未被磷酸化的聚合酶r n a pi i a 参与形成转录启始复合 物，但是它在转录的1 2 核苷酸阶段就停顿下来。此时t f i i h 被招募到转录复合 物中，一方面将c t d 磷酸化形成转录延伸复合物，另一方面将启动子附近的d n a 解螺旋，使转录复合物离开启动子区域，完成启动子清除步骤，使转录延伸下去。 当一轮转录完成以后，r n a pi i 脱落下来，被c t d 磷酸酶去磷酸化。因为 只有被脱去磷酸的r n a pi i 才能形成转录启始复合物，进入下一轮转录循环。 ( p h a m a n ih i ，2 0 0 6 ) 1 4c t d 激酶的相关研究 正是因为c t d 可逆磷酸化的存在及其和r n a 转录的密切相关性，关于它 的研究也必能加深我们对转录相关过程和调控的了解。c t d 的可逆磷酸化主要 依赖的是生物体内对c t d 进行磷酸化的激酶和去磷酸化的磷酸酶。因此，c t d 1 0 激酶和磷酸酶的功能研究显得尤其重要。目前，相当多的研究都集中于c t d 激 酶。 1 4 1t f l m t f i i h 是一个复合酶体，含有九个亚单位，能被分成两个复合体。其中四个 亚单位组成蛋白激酶复合体，负责c t d 的磷酸化。另五个亚基组成d n a 螺旋 酶复合体，负责将启动子附近的d n a 双链解旋。c d k 7 ( c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e ) 是1 1 p i i h 的一个亚单位( f e a v e r e t a l ，1 9 9 1 ：l u e t a l ，1 9 9 2 ：s e r i z a w a e t a l ，1 9 9 2 ) ， 参与蛋白激酶复合体的组成。在转录过程中c d k 7 和细胞周期蛋白( c y c l i n ) 结 合活化，使t f i i h 产生c t d 激酶活性，该过程受到细胞周期调节。在哺乳动物 中其被命名为c d k 7 c y c l i n - h ，而在芽殖酵母( s c e r e v i s i a e ) 中被称为鼬1 1 2 8 - c e l l ( 酬d i se ta l ，1 9 9 6 ) 。在酵母中飚1 1 2 8 对于生存是必须的( s i m o nc ta l ，1 9 8 6 ) 。 非允许温度下培养的 f 脚突变体中r n a p c 1 d 的磷酸化都出现显著的下降 ( v a l a y 啦a l ，1 9 9 5 ) 。而对于在非允许温度下培养的m n 2 8 温度敏感型突变体做 全基因组m r n a 表达分析发现几乎所有的r n a p i i 依赖的转录都迅速地停止了 ( h o l s t e g ee t a l ，1 9 9 8 ) 。以上实验说明k i n 2 8 c d k 7 是c t d 激酶且在体内可以刺 激转录。 1 4 2s r b l o 与c d k 7 k i n 2 8 类似，s r b l o 激酶和c d k 8 细胞周期蛋白结合组成有活性的c t d 激酶( t h o m p s o n e ta l ，1 9 9 3 ：k o l e s k ee ta l ，1 9 9 4 ；t a s s a ne ta l ，1 9 9 5 ) 。在多细 胞动物( m e t a z o a n ) 中为c d k 8 和细胞周期蛋白c ( c y c l i nc ) ，在酵母中为s r b l 0 和s r b l l 。在从哺乳动物或酵母中制备r n a p i i 全酶的过程中，它们能够被共纯 化出来( c h a oc ta l ，1 9 9 6 ；m a l d u n a d oe ta l ，1 9 9 6 ；s u ne ta l ，1 9 9 8 ) ，而且， 体外实验已经证明s r b l o 可以磷酸化c t d ( l i a oc t a l ，1 9 9 5 ) 。然而在体内实验 中，两者的缺失对c t d 的磷酸化似乎没有影响( c o o p e r c t a l ，1 9 9 9 ：r o d r i g u e z e ta l ，2 0 0 0 ) 。有可能是其他c t d 激酶补偿了它的功能，或者它在体内对c t d 磷酸化作用比较弱。令人意外的是，c d k 8 c y c l i n c 可以对细胞周期蛋白h 进行 磷酸化，抑制t f i i h 的激酶活性，从而抑制转录活性( a k o u l i t c h e ve ta l ，2 0 0 0 ) 。 因此，虽然可以在体外证明c d k 8 s r b l o 的c t d 激酶活性；但是，在体内 c d l 【8 s r b l o 究竟是通过直接作用于c t d 还是通过其它底物间接地影响转录目前 还不清楚。 1 4 3p - 1 巳i m 在寻找果蝇中促进转录的蛋白因子时，发现了一种能够刺激转录延伸的因子， 被命名为p t e f b ( p o s i t i v et r a n s c r i p t i o ne l o n g a t i o nf a t o rb 。p t e f b ) ( m a r s h a l le t a l ，1 9 9 2 ) 。由于其对激酶抑制物d r b ( 5 ，6 - d i c h l o r o 1 1 3 一d - r i b o f i w a n o s y l b e n z i m i d a z o l e ，5 ，6 - - - 氯代1 - 9 - d 呋喃核糖苯并咪唑) 的敏感性， 推断其为蛋白激酶。经过纯化和深入的研究，发现p - t e f b 含有c d k 9 和c y c l i n t ， 并且可以对r n a p hc t d 进行磷酸化( m a r s h a l le ta l ，1 9 9 6 ) 。研究还发现c d k 9 还是h i v - 1 ( 1 型人类免疫缺陷病毒) t a t 结合蛋白( t a t - a s s o c i a t e dp r o t e i n ) 的激 酶，可以刺激h i v - 1 的转录延长，事实上，t f h h 和p - t e f b 都与t a t 转录激活 ( t n m s a c t i v a f i o n ) 细胞有关( m a n c e b oe ta l ，1 9 9 7 ；z h ue ta l ，1 9 9 7 ) 。在果蝇的 热休克反应中，若h s p 7 0 的早期转录延伸受到阻碍，p - t e f b 可以被招募到转 录复合体并克服这种阻碍( l i se ta l ，2 0 0 0 ) 。p 聊b 是通过保护早期延长复合 物不受d r b 敏感诱导因子( d r bs e n s i t i v i t y - i n d u c i n gf a g t o r , d s i f ) 和n e l f ( n e g a t i v ee l o n g a t i o nf a c t o r ) 的影晌而起到刺激转录延长的作用的( p r i c e ，2 0 0 0 ) 。 p t e f b 可以磷酸化r n a p i ic t d 保守重复中的2 位s 盯，在转录过程中保持 r n a p i ic t d 的磷酸化水平，而在h i v - 1t a t 蛋白的存在下还可以磷酸化5 位s e r ( z h o ue t a l ，2 0 0 0 ) 。 1 4 4c t d k 1 c t d k - i ，即c d c 2 ，是第一个发现的c t d 激酶( l e ec ta l ，1 9 8 9 ) 。具活性 的c t d k - 1 包含三个皿基，分别由c t k l ，c t k 2 和c t k 3 编码( l e ee ta l ，1 9 9 1 ； s t e r n e re ta l ：1 9 9 5 ) 。在敲除了c t k i 的酵母菌株( c t k l 4 ) 中，c t d 的磷酸化水 平会受影响( 但不会完全丧失) ，说明c t d k - i 在体内可以磷酸化c t d ( l e ee ta l ， 1 9 9 1 ) 。一些证据表明，c t d k - l 参与转录延长：在体外，纯化的c t d k - 1 可以 刺激转录延长( l e ee ta l ，1 9 9 7 ) ；c t k l 厶菌株对6 氮尿嘧啶敏感( 这是转录延伸 因子突变体通常都具有的特点) 。与s r b l 0 类似，在3 0 条件下c t d k - i 对于生 存并不是必须的，全基因扫描分析显示只有一小部分的转录受到影响。 1 4 5b u r l b u r l ，即s g v l ，是酵母的一个c t d 激酶( 1 r i ee ta l ，1 9 9 1 ) 。与以上的c t d 激酶类似，b u r l 是一个c d k ，而b u r 2 是一个细胞周期蛋白，两者共同作用才有 c t d 激酶活性( y a oe ta l ，2 0 0 0 ；m u r r a ye ta l ，2 0 0 1 ) 。通过免疫共沉淀实验， 找到了两个b l l r l 的特异性底物：r p b l ( r n a p i i 的最大亚基) 和b u r l 自身。b u r l 也可以磷酸化c t d 。进化分析表明，b u r l 很可能是p - t e f b 在酵母中的同源蛋 白( l i u e t a l ，2 0 0 0 ) 。 还有许多其它的c t d 激酶也相继被报道，但它们在转录中的功能尚不清楚。 例如有丝分裂原活化的蛋白激酶( m i t o g e n - a e t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，m a p k ) ( d u b o i se ta l ，1 9 9 4 ；v e n e t i a n e re ta l ，1 9 9 5 ；b e l l i e re ta l ，1 9 9 7 ) ：d n a 依赖的蛋 白激酶( d n a - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e 。d n a p k ) ( d v i r e t a l ，1 9 9 3 ) 。 1 5c t d 磷酸酶的相关研究 在c t d 的可逆磷酸化过程中既存在将c t d 磷酸化的激酶，也存在催化逆向 反应，即将c t d 去磷酸化的磷酸酶。但是目前发现的c t d 磷酸酶只有少数的几 种，而且多数c t d 磷酸酶研究集中于f c p i 蛋白。 1 5 1f c p l f c p l ( t f i i fi n t c m c t i n gc t d p h o s p h a t a s e ) 是第一个发现的c a d 特异性磷酸 酶。1 9 9 4 年首次从海拉细胞( h e l ac e l l ) 纯化出了一种具有c t d 磷酸酶活