（环境科学专业论文）固定化微生物对原油污染土壤的生物修复.pdf

u 11 11 11 11 1111 11 1 1iii y 18 2 9 9 5 8 固定化微生物对原油污染土壤的生物修复 学位论文完成日期：丝? 矽：厂 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： rflii，；，le2ll 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：嘲靛签字吼渺年6 月徊 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：刮 ：褐 签字日期：纠。年月7 7 日 固定化微生物对原油污染土壤的生物修复 固定化微生物对原油污染土壤的生物修复 摘要 在石油勘探与开采、储运与炼制过程中，不可避免地会有大量原油和原油制 品抛洒或泄漏于地面，造成大面积土壤的石油污染，对生态环境造成严重危害。 由于石油烃类物质具有较高的生物学毒性、在环境中的残留时间较长且危害大， 如何对受其污染的环境进行有效修复日益受到关注。微生物修复具有费用低、可 现场处理污染土壤或水体、能够最大限度地降低污染物浓度和环境负面影响等特 点，有关这方面的研究也越来越多。特别是在如何提高降解菌功效方面的研究已 经成为国际上的研究热点。因此，提高石油烃降解菌在土壤中的繁殖效率以及便 于菌剂的扩大化生产与保存、运输，采取将微生物进行固定化处理的办法具有重 要意义。 本文从黄河三角洲长期受石油污染的土壤中驯化富集得到对原油具有较好 降解效果的土著的石油烃降解混合菌系，在含有高浓度原油的液体介质中检验了 该菌系对原油的耐受能力与降解能力，通过分离纯化培养，得到三株优势菌种， 经鉴定分别为：棒状杆菌( m i c r o b a c t e r i u m f o l i o r u m ) 、食烷烃戈登氏菌( g o r d o n i a a l k a n i v o r a n s ) 和中慢生根瘤菌( m e s o r h i z o b i u m ) 。 采用四种天然多糖性载体材料将石油烃降解混合菌系制备成固定化颗粒，通 过对固定化颗粒的制备难易、机械强度、传质性等性能的测试，最终选取操作简 便且机械强度与传质性较高的海藻酸钠作为载体，并在海藻酸钠中添加硅藻土以 提高固定化颗粒的机械强度和传质性，通过测定固定化反应时间对固定化颗粒中 的微生物活性的影响，最终确定固定化颗粒的制备条件，即采用6 海藻酸钠2 硅藻土溶液( w v ) 作载体，与等体积的降解菌生理盐水悬浮液混合均匀，用酸式 滴定管逐滴滴入0 1 m 的c a c l 2 溶液中，固定化反应1 2 h ，并测得该方法具有较 高的固定化效率，为9 2 2 5 用扫描电镜对固定化颗粒的微观结构进行观察，颗粒内部呈蜂窝网状结构， 大部分的降解菌被包埋在孔隙内附着生长，颗粒孔隙度较为丰富，利于氧气、水 分和底物的传输，且能够为固定化细菌提供充分的生长空间，为其在载体内的生 长繁殖提供有利条件。 固定化微生物对原油污染土壤的生物修复 将海藻酸钠固定化颗粒和海藻酸钠+ 硅藻土的固定化颗粒以三种接种量添加 到原油污染土壤中进行原油降解实验，调节土壤的水分和n 、p 含量至理想水平， 分别以同等接种量的游离菌作对照。结果表明，固定化降解菌产生了较同等菌量 的游离菌明显高的降解优势，特别是在实验初期，接种固定化菌的各组土壤的 t p h 降解率在实验2 0 天时就已分别达到2 7 2 9 ，2 9 8 3 和2 7 5 6 ，分别比同 等接种量的游离菌高出1 2 4 3 ，1 0 1 0 和6 4 3 ，添加固定化菌的土壤中降解 菌的数量比添加游离菌的土壤高出1 2 0 1 5 3 个数量级。并且低接种量的固定化 菌( i l 组) 体现了比高接种量的游离菌( f h 组) 更强的降解优势，2 0 天时，前 者的降解率已比后者高出6 1 ：3 0 天后，各实验组降解菌的数量和微生物活性 趋于稳定，相应的原油降解率也趋于缓慢。另外，所用载体不会破坏土壤结构， 适用于长期大面积石油污染土壤的现场修复。通过对固定化颗粒的保存条件进行 初步试验，将固定化降解菌于4 0 c 下分别保存在无菌水及三种保护剂2 0 脱脂乳、 2 0 甘油与液体石蜡中，结果表明，无菌水是最好的保存介质，降解菌在至少3 周内都可保持较好的生物活性和颗粒性状。本实验的结果为固定化微生物在大规 模土壤的实际修复中的应用提供了新的理论依据。 关键词：固定化；土壤；石油污染；微生物修复；土著降解菌 固定化微生物对原油污染土壤的生物修复 bi o r e m e d i a t i o no f c r u d eo i lc o n t a m i n a t e ds o i lw i t h l m m o b l l l z e dm l c r o o r g a n l s m a b s t r a c t i no i l e x p l o r a t i o na n de x p l o i t a t i o n ，d u r i n gt h es t o r a g ea n dt r a n s p o r t a t i o na n d r e f i n i n gp r o c e s s e s ，i n e v i t a b l yt h e r ew i l lb eal o to fc r u d eo i la n d o i lp r o d u c t ss p i l l e d o rl e a k e do n t ot h eg r o u n d ，c a u s i n gal a r g ea r e ao fo i lc o n t a m i n a t e ds o i l ，s o i la n d e c o l o g i c a le n v i r o n m e n to nar a n g eo fh a z a r d s a sp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n sh a v e h i g hb i o l o g i c a lt o x i c i t y ，r e s i d u ei nt h ee n v i r o n m e n tf o rl o n gp e r i o d sa n dc a u s eg r e a t h a r m ，h o wt or e h a b i l i t a t et h ec o n t a m i n a t e de n v i r o n m e n tb e c o m e si n c r e a s i n g l y c o n c e m e db yt h ec o m m u n i t y b i o r e m e d i a t i o n ，b ea b l et ob eu s e df o ri n - s i t u t r e a t m e n t 研t i ll o w - c o s t ，a n dm i n i m i z et h e n e g a t i v e e f f e c t so fp o l l u t a n t c o n c e n t r a t i o n sa n de n v i r o n m e n t a la n do t h e ra d v a n t a g e s ，i sv e r ys u i t a b l ef o ro u r p r e s e n tp r a c t i c a ln e e d s t oe n h a n c et h eb r e e d i n ge f f i c i e n c y o fh y d r o c a r b o n d e g r a d i n gb a c t e r i ai nt h es o i la n dt o f a c i l i t a t et h ee n l a r g e m e n to fp r o d u c t i o n , p r e s e r v a t i o n ，a n dt r a n s p o r t a t i o no ft h ec u l t u r e s ，i tw i l lm a k eg r e a ts e n s et om a k e t h e mi n t oi m m o b i l i z e df o r m e f f i c i e n tb i o d e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s mc o n s o r t i u mo fc r u d eo i lo ft h ey e l l o w r i v e rd e l t aw e r ea c c l i m a t e da n de n r i c h e df r o mo i lc o n t a m i n a t e ds o i l t h e i r t o l e r a n c ea n db i o d e g r a d a b i l i t yw a st e s t e db yl i q u i dc u l t u r em e d i u mw h i c hc o n t a i n s h i g hc o n c e n t r a t i o n so fc r u d eo i l t h r e ed o m i n a n ts p e c i e sw e r eo b t a i n e dt h r o u g h i s o l a t i o na n dp u r i f y i n gc u l t u r e ，a n dw e r ei d e n t i f i e d 嬲m i c r o b a c t e r i u mf o l i o r u m ， g o r d o n i aa l k a n i v o r a n sa n dm e s o r h i z o b i u m f o u rk i n d so fn a t u r a lp o l y s a c c h a r i d ew e r ec h o s e nf o rc a r r i e rm a t e r i a l st om a k e t h ec o n s o r t i u mi n t oi m m o b i l i z e db e a d s t h eh a n d l i n gd i f f i c u l t y ，m e c h a n i c a l s t r e n g t h ，a n dm a s st r a n s f e ra b i l i t i e so fb e a dw e r ee x a m i n e d ，a n ds o d i u ma l g i n a t e w a ss e l e c t e da sc a r r i e r ，f o ri t ss i m p l eh a n d l i n g ，s t r o n gm e c h a n i c a ls t r e n g t ha n d m a s st r a n s f e ra b i l i t y a n dt h e nd i a t o m i t ep a r t i c l e sw e r ea d d e dt os o d i u ma l g i n a t et o e n h a n c et h em e c h a n i c a ls t r e n g t ha n dm a s st r a n s f e ro ft h ei m m o b i l i z e db e a d s ，a n d t h ei m p a c to fi m m o b i l i z a t i o nt i m eo nm i c r o o r g a n i s m sa c t i v i t yw a st e s t e da sw e l l i i i 固定化微生物对原油污染十壤的生物修复 f i n a l l yt h ep r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so ft h ei m m o b i l i z e db e a d sw e r es e ta sf o l l o w s ： c a r d e rs o l u t i o nc o n s i s t so f6 s o d i u ma l g i n a t e 一2 d i a t o m i t e ( w v ) ，m i x e dw i t hf l l l e q u a lv o l u m eo fd e g r a d i n gb a c t e r i as a l i n es u s p e n s i o n , a n dt h e nb ed r o p p e di n t o o 1m c a c l 2s o l u t i o nw i t ha c i db u r e ta n di n c u b a t e df o r12 h t h ei m m o b i l i z a t i o n e f f i c i e n c yo ft h i sm e t h o di s9 2 2 5 s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ym i c r o s t r u c t u r e so ft h ei m m o b i l i z e db e a d sw e r e o b s e r v e d ，s h o w i n gac e l l u l a rn e t w o r ks t r u c t u r ew i t h i nt h ep a r t i c l e s m o s to ft h e b a c t e r i aw e r ee m b e d d e di nt h ep o r e so ra d h e r e do nt h ew a l l so ft h ep o r e s p a r t i c l e p o r o s i t y i n s i d eb e a di sa b u n d a n t ，w h i c hi sb e n e f i c i a l f o r o x y g e n ，w a t e ra n d s u b s t r a t et r a n s f e r ，a n dc a np r o v i d es u f f i c i e n ts p a c ef o rt h ee m b e d d e dc e l l s g r o w t h t h e r ef o r ，f a v o r a b l ec o n d i t i o n sw e r e p r o v i d e df o rm i c r o o r g a n i s mc e l l s g r o w t ha n d m u l t i p l i c a t i o ni n s i d et h ec a r d e r t h ei m m o b i l i z e dh y d r o c a r b o nd e g r a d i n gb a c t e r i ai nt h r e ei n o c u l u m sw e r ea d d e d t ot h ec r u d eo i lc o n t a m i n a t e ds o i lf o rb i o d e g r a d a t i o ne x p e r i m e n t ，a n ds o i lm o i s t u r e a n dn ，pl e v e l sw e r ec o n t r o l l e dt ot h ed e s i r e dl e v e l t h es a m ea m o u n to ff r e e b a c t e r i aw e r ei n o c u l a t e dr e s p e c t i v e l ya sc o n t r 0 1 1 1 抡i m m o b i l i z e dc o n s o r t i u m a c h i e v e dm u c hh i g h e rr e p r o d u c t i v er a t et p hd e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yi ns o i l ， e s p e c i a l l yi nt h ei n i t i a lp e r i o do ft h ee x p e r i m e n t a f t e ri n o c u l a t e df o r2 0d a y s ，t h e i m m o b i l i z e dc o n s o r t i u mi n o c u l a t e dg r o u p sa c h i e v e dh i 【g ht p h d e g r a d a t i o nr a t eo f 2 7 2 9 ，2 9 8 3 a n d2 7 5 6 ，r e s p e c t i v e l y ，h i g h e rt h a nt h a to ff l e eb a c t e r i aa t 12 4 3 ，10 10 a n d6 4 3 r e s p e c t i v e l y a n dt h ep o p u l a t i o n so fb i o d e g r a d i n g b a c t e r i ai ns o i l si n o c u l a t e di m m o b i l i z e dc o n s o r t i u mw e r eh i g h e rt h a nt h a to ff r e e c o n s o r t i u ma t1 2 0 1 5 3m a g n i t u d e f i n a l l yt h es t o r a g ec o n d i t i o n sf o rt h ei m m o b i l i z e db e a d sw e r et e s t e d w h e nt h e b e a d sa r ek e p ti ns t e r i l i z e dw a t e ra t4 ，t h e yc a nm a i n t a i nb e t t e rb i o l o g i c a l a c t i v i t yf o ra tl e a s tt h e r ew e e k s n er e s u l t so ft h i ss t u d yp r o v i d e sn e wt h e o r e t i c a l b a s i sf o rt h ea p p l i c a t i o no fi m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m si nb i o r e m e d i a t i o no fl a r g e a r e a so fc o n t a m i n a t e ds o i l k e yw o r d s ：i m m o b i l i z a t i o n ；s o i l ；o i lc o n t a m i n a t i o n ；b i o r e m e d i a t i o n ；i n d i g e n o u s d e g r a d i n gb a c t e r i a v 固定化微生物对原油污染十壤的生物修复 目录 l 引言1 1 1 土壤石油污染现状1 1 1 1 原油l 1 1 2 土壤原油污染的来源2 1 1 3 土壤原油污染的危害3 1 2 石油污染土壤的微生物修复4 1 2 1 微生物修复的基本原理和特点4 1 2 2 石油烃类化合物的微生物降解机理5 1 2 3 土壤中石油烃降解微生物的种群组成6 1 2 4 土壤原油污染生物修复的影响因素7 1 2 5 石油污染土壤的微生物修复技术9 1 3 固定化微生物技术在土壤修复研究中的应用1 2 1 3 1 吸附法及其在土壤修复研究中的应用1 3 1 3 2 包埋法及其在土壤修复研究中的应用1 5 1 4 本课题的研究意义、研究内容与技术路线1 7 1 4 1 研究意义l7 1 4 2 研究内容l8 1 4 3 技术路线18 1 4 4 创新点1 9 2 材料与方法2 0 2 1 供试土壤2 0 2 2 主要培养基2 0 2 3 石油烃降解菌的驯化富集、降解能力测定及优势菌种鉴定2 0 2 3 1 石油烃降解菌的驯化富集2 0 2 3 2 石油烃降解菌的原油降解能力测定2 l 2 3 3 优势菌种的分离鉴定2 l 2 4 石油烃降解菌的固定化2 l 固定化微生物对原油污染土壤的生物修复 2 4 1 菌悬液的制备2 1 2 4 2 固定化方法21 2 4 3 固定化颗粒的性能测定2 3 2 5 原油污染土壤的修复实验2 4 2 5 1 实验设置2 4 2 5 2 土壤中t p h 降解率的测定2 4 2 5 3 石油烃降解菌数量的测定。2 6 2 5 4 微生物活性的测定2 6 3 结果与分析2 8 3 1 石油烃降解菌的原油降解能力测定2 8 3 2 优势菌种鉴定结果2 9 3 3 固定化降解菌的制备3 0 3 3 1 固定化载体材料的选择3 0 3 3 2 固定化颗粒制备条件的优化3 2 3 3 3 固定化效率3 4 3 4 原油污染土壤的修复实验3 7 3 5 固定化颗粒的保存：4 l 4 结论4 3 5 问题与展望4 5 参考文献。4 6 同定化微生物对原油污染土壤的生物修复 1 引言 1 1 土壤石油污染现状 石油是现代经济的主要能源之一，随着石油产品需求量的增加，大量的原油 及其加工品在开采、冶炼、运输及储存等过程中进入土壤，世界范围内的土壤石 油污染日趋严重，在油田区尤为突出。据统计，全世界每年约有8 0 万吨石油进入 环境【i 】。据美国e p a ( 2 0 0 0 年) 资料表明：在美国有1 8 亿个地下储油罐，其中2 8 万个存在不同程度的泄漏。英国3 0 以上的加油站及几乎所有的化工厂、炼油厂 等均存在严重的油类污染；荷兰迄今为止记录的石油污染场地有十万处之多【2 1 ； 我国目前勘探、开发的油田和油气田共4 0 0 多个，当前石油年产量已超过1 1 0 k g ，每年新污染土壤1 x 1 0 8k g l 3 1 。在油田区，平均作业一口井残留在地面的落地 原油约l t ，我国石油企业每年产生落地原油约7 0 0 万吨，一般井场周围污染半径 在1 0 0 0 2 0 0 0 m 之间，井口周围5 m 范围内为最严重污染区，地面呈黑色，经雨水 冲刷污染范围还会不断扩大1 4 1 。以地处黄河三角洲的胜利油田为例，该油田区油 井附近土壤含油量为2 4 8 , 、- 2 5 3 0 0 m g k g - t - - _ ，平均1 5 7 8 2 6 7 m g k g 土【5 1 ，油泥年产生 量约为l1 0 k t ，由于没有成熟、经济的含油污泥处理技术和工艺，目前普遍的处 置方法就是在露天进行简单堆放和填埋，经过长年积累该联合站现有超过2 0 0 0 0 m 3 含油污泥1 6 l ，使得大面积植被遭到破坏，导致黄河三角洲湿地生态系统严重 退化。 1 1 1 原油 原油是天然有机物质经过地质变迁而形成的一种黑色或黑褐色的粘稠液体 或固体，天然存在于地下或海底，主要由链烷烃、环烷烃、芳香烃等烃类以及少 量硫化物、氮化物环烷酸类等非烃化合物组成，其中烃类占所有组分的 9 5 9 9 5 ，其化学成分和物理性状等随产地的不同而略有不同。有的原油样品 可含2 0 0 3 0 0 种烃类，不同组分的相对分子量相差很大，从1 6 ( 甲烷) 至1 0 0 0 左右，其物理状态可为气体、挥发性液体、高沸点液体及固体7 1 。 石油作为推动现代社会高速运转的主要能源已将近4 0 0 年。全世界大规模丌 采石油始于2 0 世纪初，1 9 0 0 年全世界石油消费量约2 0 0 0 万吨，1 0 0 年来这一数 固定化微生物对原油污染土壤的生物修复 量已增长百余倍，目前世界每年的石油总产量为3 0 多亿吨【。自从1 8 5 9 年美国 在世界上成功地钻出第一口油井以来，石油便开始挤身世界重要能源的行列。进 入二十世纪后，在中东发现了举世无双的“石油宝库”，再加上石油加工技术的发 展和石油产品新用途的开发，石油的地位愈来愈重要，被称为现代工业的“血液”， 现代社会中的“黑色金子”i 引。 1 1 2 土壤原油污染的来源 石油工业迅速发展的同时造成了诸多的环境问题，在石油的开采、冶炼、使 用和运输过程中，由于井喷事故、泄漏及检修等原因所致的石油烃类的溢出和排 放，以及含油废水的排放、污水灌溉，各种石油制品的挥发、不完全燃烧物飘落 等，特别是石油开采过程产生的落地原油，已成为土壤原油污染的重要来源。石 油污染物主要通过以下五种途径进入土壤： 1 1 2 1 原油泄漏和溢油事故 在我国的石油开采生产过程中，还存在一些不合理的作业方式，在采油井洗 井和检修时，会有大量的原油洒落在油井周围，在原油开采过程中甚至会发生井 喷事故，此外，石油及其产品在运输、使用、贮存过程中的渗漏和溢油现象时有 发生，这些事故往往造成大量石油烃类物质直接进入土壤，造成数量多、浓度高、 危害大的局部污染，使得土壤中的石油浓度大大超过土壤颗粒能够吸附的量，过 多的石油存在于土壤空隙中，使小范围内的生态系统遭到完全破坏。目l j i ，我国 勘探、开发的油田和油气田共4 0 0 多个，分布在全国2 5 个省市和自治区，油田的 主要工作范围近2 0 万i o n 2 ，覆盖地区面积达3 2 万k m 2 ，其中约4 8 0 万h m 2 土地的石 油含量可能超过安全值【9 】。 1 1 2 2 含油矿渣、污泥、垃圾的堆置 石油在开采和冶炼时产生大量的含油废弃物，主要包括含油岩屑、含油泥浆 等。这些含油废弃物往往堆积在厂矿周围，在堆放的过程中经过雨水的冲刷、淋 洗，向周围土壤中浸入相当数量的油，致使土壤中石油烃类含量比非堆放区高出 数倍。含油污泥主要来自油田的接转站、联合站的油罐、沉降罐、污水罐、隔油 池的底泥。另外，炼油厂含油污水处理设施也会产生大量的油泥。据初步统计， 我国石油化学行业中，平均每年产生8 0 万t 罐底泥、池底泥，其中，胜利油田每 2 同定化微生物对原油污染十壤的生物修复 年产生含油污泥在1 0 万t 以上，大港油田每年产生含油污泥约1 5 万t ，河南油田每 年产生5 万t 【10 1 。 1 1 2 3 污水灌溉 使用含油污水灌溉农田是土壤受石油污染的主要原因之一。许多工业废水含 有石油烃类物质，尤其是石油开采、冶炼、加工和以石油为原料的化工部门所排 放的废水，长期使用这类污水灌溉农阳必然导致土壤石油污染。 1 1 2 4 大气污染及汽车尾气的排放 石油炼化企业和工厂在生产过程中，会有石油中的可挥发性成分进入大气， 这些成分可与大气中的颗粒物结合成降尘进入土壤。有研究表明，大气降尘污染 区的土壤矿物油含量比对照区高出1 2 倍。此外，各种使用汽油、柴油的车辆在 行进中排出的尾气也含有大量未燃烧的石油成分，这些成分也会以沉降物的形式 进入土壤。因此，公路两侧土壤中往往含有较多的石油污染物。 1 1 2 5 药剂污染， 油类经常作为各种杀虫剂、防腐剂和除草剂的溶剂或乳化剂等，当使用这些 农药时，油类就随之进入土壤，增加了土壤中的石油烃含量。 1 1 3 土壤原油污染的危害 石油烃进入土壤后，虽经土壤系统自身的一系列生态净化作用其含量会有所 减少，但是如果大量的石油烃类物质进入土壤，将会由于其特殊的物理化学性质 及其难以去除、残留时间长的特点，而对土壤和生态环境造成一系列的危害，给 污染地区的生态环境、农作物以及人类的健康带来负面影响，具体可归纳为以下 四个方面： 1 1 3 1 原油污染对土壤性质的破坏 油田周围大面积的土壤一般都受到严重的污染，原油对土壤的污染多集中在 2 0c m 左右的表层12 1 。大量石油类物质进入土壤，会堵塞土壤孔隙，改变土壤 有机质的组成和结构，引起土壤有机质的碳氮比( c n ) 和碳磷比( c p ) 的变 化，将会对土壤原有微生物和土壤的酶活产生抑制作用，引起土壤微生物群落、 区系的变化，破坏土壤微生态环境。当土壤矿物油的浓度小于1 0 时，土壤中的 放线菌和总细菌数不受影响，但真菌数量明显减少，固氮菌活性降低，土壤糖类 同定化微生物对原油污染土壤的生物修复 的矿化率降低1 5 1 。原油密度比较小，粘着力强且乳化能力低，因而在土壤中容易 与土粒粘连，堵塞土壤孔隙，影响土壤的透气性和渗水性】。 1 1 3 2 原油污染对农作物的危害 石油烃中富含的反应基能与土壤中的无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷 酸作用，从而使土壤有效氮、磷含量减少，影响作物对养分的吸收；石油还会粘 着在植物的根表面形成粘膜，阻碍根系的呼吸与吸收，引起根系腐烂，影响作物 根系的生长，甚至造成作物的死亡，使作物减产1 5 1 ；重金属、芳香族化合物等有 毒有害物质在农作物中产生残留、富集效应，并通过食物链的累积放大作用危及 人类健康f 1 引。 1 1 3 3 原油中有毒物质对人和动物的危害 石油污染物中的某些脂溶性物质能侵蚀中枢神经系统，一些挥发性组分在紫 外线照射下与氧作用形成有毒性气体，危害人和动物的呼吸系统【1 3 】。其中芳香 烃类物质对人及动物的毒性较大，尤其是以双环和三环为代表的多环芳烃毒性更 大，具有致癌性、致突变性和致畸性。在石油污染场地以及一些加工炼制的石油 产品中最常见的芳香类污染物质为苯、甲基苯、乙基苯和二甲基苯四种，合称为 b t e x ，它们常被当作芳香烃类污染物的代表物质。多环芳烃类物质可通过呼吸、 皮肤接触、饮食摄入方式进入人或动物体内，影响肝、肾等器官的正常功能，甚 至引起癌变。作物和粮食对石油污染物的吸收残留效应使这些有毒物质可以通过 食物链间接影响人体健康。 1 1 3 4 土壤原油污染对大气和水体的影响 土壤中的石油组分向空气中挥发、扩散和转移，使空气质量下降。原油中不 易被土壤吸附的污染物成分会向土壤下层渗漏从而污染地下水，或被地面降水携 带进入地表水体，构成对人类生存环境多个层面上的不良胁迫【b 】。 土壤是人类赖以生存的主要自然资源之一，又是人类生态环境的重要部分； 也是物质生物地球化学循环的储库，对环境具有敏感性。土壤石油污染的隐蔽性 大，潜伏期长，涉及面广，治理困难，危害同益凸现，已成为不容忽视的环境问 题。 1 2 石油污染土壤的微生物修复 1 2 1 微生物修复的基本原理和特点 4 同定化微生物对原油污染十壤的生物修复 石油污染土壤的修复，可以采用物理方法、化学方法和生物方法，其中生物 修复技术被认为是最有生命力的土壤清洁技术、是实现生态效应恢复的最有效措 施，而其中的微生物修复技术更是生物修复的核心技术。微生物修复是利用土壤 中的土著微生物或向污染土壤中投入经驯化的高效微生物，在适宜条件下通过菌 的代谢活动将存在于土壤中的石油烃污染物降解为无害的无机物质( c 0 2 和 h 2 0 ) ，修复受污染的土壤。降解过程可以由改变土壤的理化条件( 包括土壤的 营养条件、p h 、湿度、温度等) 来完成，也可通过接种特殊驯化与构建的工程 微生物提高降解速率【l4 1 。 与物理化学方法相比，微生物修复技术主要优点有：成本低，如污染土壤的 生化治理费用于热处理及物理化学方法；不破坏植物生长所需的土壤环境；污染 物氧化完全，没有二次污染：处理效果好，对低分子量的污染物去除率非常高； 可原位处理，避免了集输过程中的二次污染，节约了处理费用且操作简便。 1 2 2 石油烃类化合物的微生物降解机理 石油烃类化合物可分为四类，饱和烃、芳香烃类化合物、沥青质( 苯酚类、 脂肪酸类、酮类、酯类、扑啉类) 和胶质( 吡啶类、喹啉类、卡巴胂类、亚砜类 和酰胺类) ，具有一定的微生物降解性。微生物降解原油的理论由美国微生物学 家z o b e l l 首先提出，该理论认为自然界有许多微生物能够以烃类作为生长的唯一 碳源和能源，而且其利用石油烃的能力主要依赖于烃类混合物中各化合物的性质 【i5 1 。石油烃的微生物降解主要包括3 个过程：第一个过程是石油烃在水中的溶解 及在微生物表面的吸附：第二个过程是石油烃在微生物细胞膜的运输；第三个过 程是t p h 在微生物细胞内的降解【l6 1 。降解烃类的微生物吸附在土粒上，它们和烃 液滴的相互作用是在土壤孔隙里的油水界面上进行的，有的烃能直接溶于细胞膜 的亲脂区而进入膜内；另一些则是微生物在油滴界面先生成表面活性剂使之溶解 后吸收，气态烃要溶于水后才能被吸收1 1 7 】。石油烃类物质进入降解微生物的细 胞膜后，在细胞内有关降解酶的催化下通过酶促反应进行降解，通过三种同化作 用被降解：好氧呼吸、厌氧呼吸和发酵作用。微生物降解石油类物质主要通过好 氧生物的降解作用产生细胞体和c 0 2 来完成。石油类物质的降解并不能简单看作 某一同化作用，而是一个非常复杂的过程。简单来说，这一过程可用下面的公式 表示： 固定化微生物对原油污染土壤的生物修复 石油烃+ 生物+ 0 2 + 氮源_ c 0 2 + h 2 0 + 副产物+ 细胞体 对各成分的微生物降解性进行比较，认为饱和烃的降解速率最高，其次是低 分子量的芳香族烃类化合物，高分子量的芳香烃类化合物、胶质和沥青质则极难 降解；不同烃类化合物的降解速率模式为：直链烷烃 支链烷烃 低分子量芳香 烃 多环烷烃【3 ，1 8 , 1 9 1 。c l a u d e 等例用微生物处理石油烃污染的土壤，实验2 7 0d 后，7 5 的原油被降解，其中属饱和烃的正构烷烃和支链烷烃在1 6 d 内几乎全部 降解；7 8 的环烷烃被降解；芳香烃有7 1 被同化；占原油总重量1 0 的沥青质 完全保留了下来。总的来说，烷烃、芳香烃中的c 1 0 一- - c 2 2 最易降解；c i c 6 一般挥发较快，在环境中主要以气体形式存在，而且短链烃由于其结构比较稳定， 只有少量的微生物对其有降解作用；c 2 2 以上的烃类水溶性很差，一般情况下为 固态，微生物对其降解作用非常有限。含有支链结构和芳香结构的烃类降解速率 比相同个数碳的直链烃要慢，这可能是由于支链上的叔碳或季碳影响了其生物降 解过程。研究还发现，降解环烷烃需要更多微生物的联合作用。同时，c i o 以下 的环烷烃对微生物膜表现出较强的毒性。在芳香烃部分中，2 环和3 环化合物较 容易被降解，而含有5 个或更多环的那些芳香烃难以被微生物降解；胶质和沥青 则极难被微生物所降解，这些物质大量残留在生物降解的最终产物中，形成降解 后的主要残留物质- 矿化物，【1 2 ，1 9 1 。但也有研究表明，利用特定细菌对石油类 物质的共代谢作用可以有效去除某些难降解有机物。b e r t r a n d 等1 2 l j 发现，难降解 的沥青和树脂可以通过共氧化作用进行降解。r o n t a n i 等【2 2 1 也发现了沥青质的共 氧化作用，同时报道了沥青质的生物降解依赖于烷烃( c 1 2 - - - c 1 8 ) 的存在。 1 2 3 土壤中石油烃降解微生物的种群组成 土壤中存在着大量依靠有机物生活的微生物，如细菌、真菌、放线菌等，具 有氧化分解有机物的巨大能力。在土壤受到石油污染后，一些微生物在污染物的 诱导下产生分解污染物的酶系，可将污染物降解转化。据报道，能降解石油中各 种烃类的微生物共约1 0 0 余属、2 0 0 多种，他们分属于细菌、放线菌、霉菌、酵 母菌以至藻类。土壤中最常见的石油降解细菌群数由高到低分别为：假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 、节核细菌属( a r t hr o b a c t e r ) 、产碱杆菌属( 4 i c a l i g e n e s ) 、 棒状杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 、黄质菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、无色菌属 似c h r o m o b a c t e r ) 、微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 、诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 和分 6 硎定化微生物对原油污染十壤的生物修复 支杆菌属( m y c o b a c t e r i u m ) 。最常见的石油降解真菌种群数由高到低为：木霉 属( t r i c h o d e r m a 夕、青霉属( p e n i c i l l i u m ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 和森m 属 ( m o r t i e r e l l a ) 2 3 1 。细菌和真菌是土壤石油生物降解的最基本的作用者，它们 的细胞均含有改变了的脂肪酸组分和较多的核糖体，井常将烃类累积在细胞质膜 上，它们也能合成较多的磷脂。一般认为，细菌分解原油比真菌、放线菌容易的 多，但也有研究表明，某些种类的真菌比细菌更能有效地降解原油1 2 4 1 。与真菌 不同的是，多数细菌依靠烃类混合物生长时，其生长情况要比依靠单个底物时为 好，虽然细菌优先利用直链的脂肪族缓和，但它们也能利用直链烃和芳香烃。 在土壤自然生态环境中，上述各种微生物降解石油类物质的过程是同步进行 的，并存在着竞争关系，要区别每一种细菌在降解过程中的单独作用是非常困难 的：而且从工程意义上讲，往往更注重从宏观角度探讨微生物群落的整体降解效 果。土壤中降解石油微生物的数量与污染物的存在有着密切关系，它们能够适应 环境，然后进行选择性富集并发生遗传改变，从而导致烃类降解细菌所占比例及 编码降解烃类基因的质粒数量增加。a t l a s 2 5 】曾报道，降解烃类的微生物一般只 占微生物群落总数的不到l ，而当有石油污染物存在时，降解菌的比例增加到 1 0 。大量研究发现，在含有原油的土壤中，某些种类的好氧菌类的数量明显增 加，但其他好氧菌数量却减少了；同时厌氧菌类则没有受到明显的影响。另外， 石油污染土壤经过一段时间后，生物物种会明显少于未受污染的土壤1 1 9 】。 目日i 随着研究的不断深入，发现完成对石油烃污染物的降解单株菌种是不可 能完成的，对复杂混合物石油烃的降解离不丌多种微生物的联合作用，因此大量 研究逐渐将研究对象从单株菌种转移到混合菌群。另外，在研究多种微生物共同 起作用时，不同种群问的相互作用也渐渐成为研究课题，如细菌与放线菌就可以 组成良好的组合，放线菌依靠自身伸长的菌丝更易于接近石油烃污染物，而此时 放