（食品科学专业论文）高纯度白藜芦醇的提取纯化研究.pdf

s t u d yo ne x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o n o fh i g hp u r i t yr es r a t r o l at h e s i ss u b m i t t e dt o s h a a n x iu n i v e r s i t yo fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n tf o r t h ed e g r e eo f m a s t e ro fe n g i n e e r i n g t h e s i s ( o rd i s s e r t a t i o n ) s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl i us h u x i n g 一 m a y , 2 0 1 0 高纯度白藜芦醇的提取纯化研究 摘要 虎杖是我国的传统中药，其中含有丰富的白藜芦醇。白藜芦醇具有多种 生物学活性及药理作用。人们已经发现它可以抗癌、抗菌、抗氧化、预防心 脏病、降血脂和抗诱变等。目前，白藜芦醇已经凭借其所特有的抗肿瘤活性 及对心血管系统的作用，成为食品及医药行业研究的热点。本文对虎杖原料 分别采用酶制剂辅助提取法、超声波辅助提取法以及酶法和超声波结合提取 法的提取工艺进行了实验研究，并用柱层析法对白藜芦醇粗品纯化，重结晶 后得到高纯度白藜芦醇，探索出一项利于环保的绿色提取高纯度白藜芦醇的 技术。 1 以白藜芦醇为研究对象，采用薄层色谱法进行定性分析，采用高效液 相色谱进行定量测定。确定了h p l c 检测白藜芦醇含量的色谱条件： s y m m e t r yc 1 8 色谱柱( 2 5 0 4 6 m m ，5 i t m ) ，柱温为室温，流动相为乙睛： 水= 2 0 ：8 0 ，流速为1 0 m l m i n ，进样量1 0 i t l ，测定波长3 0 6 n m 。白藜芦醇 在0 6 i _ t g m l 2 0 i _ t e d m l 范围内呈良好的线性关系。 2 应用b o x b e h n k e n 中心组合进行4 因素3 水平的实验设计，确定了采 用酶法提取白藜芦醇的最佳工艺。纤维素酶提取工艺为：提取时间1 2 0 m i n ， 温度5 2 5 ，p h 为4 5 ，酶用量2m g g 虎杖。采用复合酶辅助提取虎杖中 白藜芦醇的最佳工艺条件为：提取时间1 2 0 m i n ，温度4 5 ，p h 为5 ，酶 用量为3m g g 虎杖。其中，复合酶提取效果优于纤维素酶提取效果，其平 均得率为4 2 3 3 。 3 确定了酶法提取与超声波辅助提取相结合的提取方法，其工艺条件 为：6 0 甲醇以料液比1 ：l o 超声提取3 0 m i n ，挥尽甲醇后加入复合酶量为 3 - 4 m g g 虎杖，提取时间1 2 0 m i n ，温度4 5 ，p h 值为5 。相比众多的提取 方式，包括纤维素酶辅助提取、复合酶辅助提取、超声波辅助提取以及酶法 与超声波的结合提取，从白藜芦醇的得率上来讲，酶法与超声波相结合的提 取方式效果最好，平均得率可达4 9 0 2 。 4 选择a b 8 型大孔吸附树脂，对白藜芦醇的粗提液进行了初步的纯化 和分离。确定的最佳上样条件为：以3 0 乙醇作为吸附剂，上样浓度为 3 - 4 m l ，上样速率为l m l m i n ，上样p h 为5 。确定的最佳解吸条件为：以 7 0 乙醇作为解吸剂，解吸速率l m l m i n ，解吸p h 为7 。 5 确定了在乙醇水结晶体系下白藜芦醇重结晶的工艺条件：以4 0 乙 醇作为结晶溶剂，在4 c 下析晶2 4 小时，重复2 次，得到的白藜芦醇晶体 经高效液相色谱检测，纯度为9 8 6 4 ，得率为o 1 3 3 。 关键词：虎杖，白藜芦醇，纤维素酶，复合酶，重结晶，提取 l i f e p r o l o n g i n g e f f e c t s r e s v e r a t r o lh a sb e e np a i dm u c hm o r ea t t e n t i o n b e c a u s eo fi t sp a r t i c u l a ra n dr e m a r k a b l ef u n c t i o n s t h ed r i e dr o o t so f p o l y g o n u mc u s p i d a t u ms i e b e tz u c cw e r eu s e di nt h i sp a p e ra st h er a w m a t e r i a l ，a n de x t r a c t i n gt e c h n i q u e sh a v eb e e ne x p e r i m e n t a l l ys t u d i e db y u s i n g t h em e t h o d so fe n z y m e a s s i s t e de x t r a c t i o n ，u l t r a s o n i c a s s i s t e d e x t r a c t i o na n dt h ec o m b i n a t i o no fb o t h p u r i f i c a t i o no fr e s v e r a t r o lb y c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yi sa l s o a d o p t e d h i g hp u r i t yo fr e s v e r a t r o li s g a i n e db yr e c r y s t a l l i z a t i o n ，t h u san e wg r e e nt e c h n o l o g yi sp r o m i s e dt ob e d e v e l o p e dt o e x t r a c ta n dp u r i f yr e s v e r a t r o lf r o mp o l y g o n u mc u s p i d a t u m s i e b e tz u c c 1r e s v e r a t r o li s q u a l i t a t i v e l ya n a l y z e db yu s i n g t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y , w h i l et h eq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fi t i sd o n eb yu s i n g h p l c t h ed e t e r m i n e dc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w i n g ：t h e a n a l y t i c a l c o l u m ni s s y m m e t r yc - 18 ( 2 5 0 4 6 m m ，5 t m ) ，c o l u m n t e m p e r a t u r ei st h es a m ea s t h a to ft h er o o mt e m p e r a t u r e u s i n g a c e t o n i t r i l e w a t e r ( 2 0 ：8 0 ) s y s t e ma st h em o b i l ep h a s e t h ef l o w r a t ei s 1 0 m l m i n ，t h ei n j e c t i o nv o l u m ei s1o p l ，a n dd e t e c t i o nw a v e l e n g t hi s 30 6 n m f u r t h e r m o r e r e s v e r a t r o lh a sg o o dl i n e rr e l a t i o n s h i pw i t hp e a ka r e a w i t h i nt h er a n g eo f0 6l 2 0 p g m l 2t h eo p t i m a lc o n d i t i o n st o e x t r a c tr e s v e r a t r o lb ye n z y m e a s s i s t e d e x t r a c t i o nh a sb e e nd e t e r m i n e dt h r o u g ht h es i n g l ef a c t o ra n dt h r e e 1 e v e l f o u r - f a c t o rb o x b e h n k e nd e s i g n t h ec o n d i t i o n so fc e l l u l o s e a s s i s t e d e x t r a c t i o ni n c l u d e ：c e l l u l o s ea m o u n t2 m g g ，t e m p e r a t u r e5 2 5 c ，e x t r a c t i n g t i m e12 0 m i n ，a n dp h4 5 ；a n dt h ec o n d i t i o n so fc o m p l e xe n z y m e a s s i s t e d i i i e x t r a c t i o na r e ：t h e c o m p l e xe n z y m ea m o u n t3 m g g ，t e m p e r a t u r e 4 5 ，e x t r a c t i n gt i m e12 0 m i n ，a n dp h5 t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ee f f e c to f u s i n gc o m p l e xe n z y m ei sb e t t e rt h a nt h a to ft h eo t h e r s ，w i t ht h ea v e r a g e y i e l do fr e s v e r a t r o lb e i n g4 2 3 3 3t h em e t h o r do fe x t r a c t i n gr e s v e r a t r o lh a sb e e ne s t a b l i s h e db yu s i n g b o t he n z y m e a s s i s t e da n du l t r a s o n i c a s s i s t e de x t r a c t i o n t h ec o n d i t i o n sa r e a sf o l l o w i n g ：t h em e t h y la l c o h o lc o n c e n t r a t i o n6 0 t h ep r o p o r t i o no f l i q u i dt om a t e r i a l i s1 ：2 5 ，t h et i m eo fe x t r a c t i o ni s3 0 m i n ，a n dt h e u l t r a s o u n dp o w e ri s2 5 0 w ：r e m o v i n ga l lt h em e t h y la l c o h o l ，a n da d d i n g c o m p l e xe n z y m e3 - 4 m g g ，t h ee n z y m o l y s i st i m ei s 12 0 m i n ，t e m p e r a t u r ei s 4 5 ，a n dt h ep hv a l u ei s5 c o m p a r e dt ot h eo t h e re x t r a c t i n gm e t h o d s ， i n c l u d i n gc e l l u l o s e a s s i s t e de x t r a c t i o n ，c o m p l e xe n z y m e a s s i s t e de x t r a c t i o n ， a n du l t r a s o n i c a s s i s t e de x t r a c t i o n t h i sm e t h o dc a na c h i e v et h eb e s t e x t r a c t i n ge f f e c ta n dt h ea v e r a g ey i e l do fr e s v e r a t r o li s4 9 0 2 4t h ec o n d i t i o n so fi s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fr e s v e r a t r o li n e n z y m o l y s i sl i q u i dh a v e b e e nd e t e r m i n e dt h r o u g har e s i nt y p eo fa b 一8 t h e b e s ta b s o r p t i o n a lc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w i n g ：f e e d i n gr a t ei slm l m i n ，p h v a l u ei s5a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fr e s v e r a t r o li sr e s p e c t i v e l y3 4 m l t h e o p t i m u me l u t i o n a lc o n d i t i o n sa r ee l u t i o nr a t elm l m i na n dp hv a l u e7 r e s v e r a t r o lc a nb ee l u t e db y7 0 a l c o h 0 1 5t h ew a yo f p u r i f i n gr e s v e r a t r o lb yr e c r y s t a l l i z a t i o ni nt h es y s t e mo f e t h a n o la n dw a t e rm i x t u r e sh a sb e e nf o u n d ：4 0 e t h a n o l ，t h et e m p e r a t u r ei s 4 a n dt h et i m ei s2 4 h t h en u m b e ro fr e c r y s t a l l i z a t i o ni s2 u n d e rt h i s c o n d i t i o n ，w ec a no b t a i nt h er e s v e r a t r o lc r y s t a l s ，w h o s ep u r i t yi s9 8 6 4 ， a n dt h ef i n a ly i e l di s0 13 3 k e yw o r d s ：p o l y g o n u mc u s p i d a t u ms i e b e t z u c c ，r e s v e r a t r o l ， c e l l u l o s e ，c o m p l e xe n z y m e ，r e c r y s t a l l i z a t i o n ，e x t r a c t i o n i v 目录 摘要一i a b s t r a c t i 1 绪论1 1 1 虎杖的研究现状1 1 1 1 虎杖的简介l 1 1 2 虎杖的资源分布。2 1 1 3 虎杖的主要化学成分2 1 2 白藜芦醇的研究现状3 1 2 1 白藜芦醇的存在及分布3 1 2 2 白藜芦醇的功能作用：oo oooooo ooooo0 0 3 1 2 3 国内外研究动态和水平。5 1 3 论文的研究目的及意义6 1 4 本论文研究方法的确定。7 1 5 论文研究内容8 2 白藜芦醇的检测方法的研究9 2 1 白藜芦醇的理化性质。9 2 2 白藜芦醇的定性检测9 2 2 1 实验材料与仪器9 2 2 2 实验方法1o 2 2 3 实验结果与讨论。11 2 3 白藜芦醇的定量检测1 1 2 3 1 紫外分光光度法1 l 2 3 2 高效液相色谱法1 3 2 4d 、结。1 5 3 白藜芦醇的提取研究1 6 3 1 酶辅助提取的作用原理1 6 3 2 纤维素酶辅助提取虎杖白藜芦醇1 6 3 2 1 实验材料与仪器1 6 3 2 2 实验方法17 3 2 3 实验结果与讨论1 7 3 3 复合酶提取白藜芦醇2 5 i 3 3 1 实验材料与仪器2 5 3 3 2 实验方法2 5 3 3 3 实验结果与讨论2 6 3 4 超声波辅助提取虎杖白藜芦醇3 3 3 4 1 超声提取的作用机理3 3 3 4 2 实验材料与仪器3 3 3 4 3 实验方法3 4 3 4 4 实验结果与讨论3 4 3 5 酶法提取与超声提取相结合3 8 3 5 1 实验方法3 8 3 5 2 实验结果与讨论3 8 3 6 小结3 9 4 白藜芦醇的纯化研究4 0 4 1 实验材料和仪器4 0 4 1 1 实验材料4 0 4 1 2 实验仪器。4 0 4 2 实验方法4 1 4 2 2 大孔吸附树脂的选择4 l 4 2 3 树脂预处理4 l 4 2 4 树脂对白藜芦醇的动态吸附4 1 4 2 5 大孔吸附树脂的梯度洗脱4 2 4 2 6 树脂的再生4 2 4 2 7 重结晶溶剂的选择4 3 4 2 8 白藜芦醇的重结晶4 3 4 3 实验结果与讨论4 4 4 3 1 上样速率对吸附率的影响4 4 4 3 2 上样浓度对吸附效果的影响4 5 4 3 3p h 值对吸附效果的影响4 5 4 3 4 解吸剂浓度对解吸效果的影响4 6 4 3 5 流速对解吸效果的影响4 7 4 3 6 解吸剂的p h 值对解吸效果的影响4 7 4 3 7 最佳解吸条件下的解吸曲线4 7 4 3 8 白藜芦醇的重结晶4 8 i i i i i 4 9 5 0 5 2 5 3 5 8 5 9 高纯度白藜芦醇的提取纯化研究 1 绪论 1 1 虎杖的研究现状 1 1 1 虎杖的简介 虎杖为蓼科植物虎杖p o l y g o n u mc u s p i d a t u ms i e b e tz u e e 的干燥根茎和根，是 我国的传统中药，通常采挖于春、秋二季，除去须根，洗净，趁鲜切成短段或厚片，晒 干。其味苦、涩、性寒，归肝、胆、大肠及肺经，中医学认为虎杖具有祛风利湿、散疲 定痛、止咳化痰的功效【- 】。虎杖最早出自名医别录，本草纲目解释其名为：虎杖， 杖言其茎，虎言其斑也。其别名有：大虫杖( 药性论) ，苦杖( 本草拾遗) ，酸杖、 斑杖( 日华子本草) ，酸桶笋( 救荒本草) ，斑庄根( 滇南本草) ，鸟不踏( 医 林纂要) ，蛇总管( 岭南采药录) ，大活血、血藤、紫金龙( 南京民间草药) ，酸 汤秆、黄地榆、号筒草( 贵州民间方药集) ，斑龙紫、野黄连( 中医药实验研究) ， 活血丹( 江苏植药志) 等 2 1 。 植物虎杖为多年生灌木状草本，高达1 米以上。根茎横卧地下，木质，黄褐色，节 明显。茎直立，圆柱形，表面无毛，散生着多数红色或带紫色斑点，中空。单叶互生， 阔卵形至近圆形，长约7 1 2 厘米，宽约5 - 9 厘米，先端短尖，基部为圆形或楔形；叶柄 长1 2 5 厘米；托鞘膜质，褐色，早落。花单性，雌雄异株，圆锥花序腋生；花梗较长， 上部有翅；花小而密，白色，花被5 片，外轮3 片，背面有翅，结果时增大；雄花有雄 蕊8 枚，雌花子房上部有花柱3 枚。瘦果卵形，具3 棱，红褐色，光亮，包在翅状的花 被中。花期7 - 9 月，果期约9 1 0 月。 图1 - 1 虎杖 f i g 1 1p o l y g o n u mc u s p i d a t u ms i e b e t z u e e 虎杖( 见图1 1 ) 根的形状不一，多数呈圆锥形弯曲，或呈块状，长1 7 厘米，直径 0 6 1 5 厘米，外表棕褐色，有明显的纵皱纹、紫色斑块以及散在的须根疤痕；质坚硬不 易折断，断面棕红色，纤维性，本质部占根的大部分，呈菊花状放射形纹理。根茎圆柱 形，节明显，通常着生卷曲的须根，折断面中央有空隙，根茎顶部有残存的茎基。气微 1 陕西科技大学硕士学位论文 弱，味微苦。以根条粗壮、内心不枯朽者为佳。 1 1 2 虎杖的资源分布 虎杖常见于海拔5 0 0 2 5 0 0 米的山坡山麓、溪谷两岸的灌丛边、沟边草丛及田野路旁， 是我国传统的中药材。该植物对湿度要求较高，广泛分布于我国的河南、河北、山东、 江苏、浙江、安徽、江西、湖南、湖北、广东、广西、福建、台湾、四川、贵州等省区。 此外，在我国的云南、西藏、陕西南部以及秦岭地区也有大面积的种植，资源较为丰富。 野生虎杖的主要产地集中在湖南、安徽、广西、四川、云南等省，大多成片生长于湿润 而深厚的土壤中。 1 1 3 虎杖的主要化学成分【3 】 为了弄清楚虎杖的化学成分，国内外学者已经做了大量深入的研究，并也已经成功 检测到了蒽醌类化合物、芪类( 二苯乙烯类) 化合物、黄酮类化合物等成分，而这些也 正是构成虎杖的主要化学成分，概括为如下几类物质。 ( 1 ) 葸醌类化合物：游离态和结合态是该类化合物在虎杖中的两种存在形式。其中以游 离态为主，常见的大黄素( e m o d i n ，e m o ) 、大黄素甲醚( p h y a c i o n ) 、大黄酚( c h r y s o p h a n 0 1 ) 及大黄酸( r h e i n ) 等均属于游离型；结合型蒽醌类物质含量较低，包括：大黄素一8 o 葡萄 糖甙、大黄素甲醚1 p d 一葡萄糖甙、大黄素1 0 d d 一葡萄糖甙、羟基芦荟大黄素，大黄 素- 8 单甲醚、6 羟基芦荟大黄素8 单甲醚等。 ( 2 ) 芪类化合物：白藜芦醇( r e s v e r a t r 0 1 ) 及白藜芦醇甙( p o l y d a t i n ，p 0 1 ) ，这两种存在 形式相比较而言，白藜芦醇甙更加稳定，因而在天然虎杖中白藜芦醇甙的含量大大超过 了白藜芦醇的含量。 ( 3 ) 黄酮类化合物：虎杖中的黄酮类化合物主要包括槲皮素( q u e r c e t i n ) 、槲皮素3 葡萄 糖苷( q u e r c e t i n - 3 g l u c o s i d e ) 、槲皮素3 阿拉伯糖苷( q u e r c e t i n - 3 a r a b i n o s i d e ) 、槲皮素3 鼠李糖苷( q u e r c e t i n 3 r h a m n o s i d e ) 、槲皮素3 半乳糖苷( q u e r c e t i n 一3 一g a l a c t o s i d e ) 、木犀草 素7 葡萄糖苷( l u t e o l i n - 7 g l u c o s i d e ) 等。 ( 4 ) 酚类化合物：虎杖中酚类化合物主要有：迷人醇( f a l l a c i n 0 1 ) 、原儿茶酸( p r o t o c a t e e h u i e a c i d ) 、几茶素( c a t e c h i n ) ，7 - 羟基- 4 - 甲氧基- 5 一甲基香豆素( 7 一h y d r o x y - 4 m e t h o x y 一5 一m e t h y l c o u m a r i n ) ，决明松8 一o 葡萄糖萘苷( t o r a c h r y s o n e 8og l u c o s i d e ) ，2 , 5 二甲基7 羟基色 原酮( 2 ，5 d i m e t y y l 7 。h y d r o x y c h r o m o n e ) ，2 - 甲氧基6 一乙酰基7 一甲基一胡桃醌 ( 2 一m e t h o x y 一6 一a c e t y l - 7 一m e t h y l j u g l o n e ) 、没食子酸( g a l l i ca c i d ) 等。 ( 5 ) 其它成分：一种分子量约6 0 0 0 的多糖，p 谷甾醇，游离氨基酸、脂肪酸及c u 、f e 、 m n 、z n 、k 等微量元素。 2 高纯度白藜芦醇的提取纯化研究 1 2 白藜芦醇的研究现状 1 2 1 白藜芦醇的存在及分布 近几十年来，随着科学技术和研究手段的不断提高，人们对各种天然植物的化学成 分及其药用价值的研究也越来越深入。而作为抑制肿瘤发生最有前途的药物之一，白藜 芦醇的存在与分布也自然成为一大新的研究热点。到现在为止，研究人员已经在许多植 物属种中发现了白藜芦醇，如：葡萄科的葡萄属、豆科的落花生属、百合科的藜芦属、 姚金娘科的桉属等 9 1 。人们日常生活中常见的葡萄、花生、决明、藜芦、虎杖、桑葚等 中都含有白藜芦醇。其中，虎杖、葡萄、花生中的含量较为丰富，主要以反式存在 i o l 。 目前，虎杖和葡萄是获取白藜芦醇最常用的原料。 研究者发现，白藜芦醇在葡萄不同部位中的含量有所不同，葡萄皮中自藜芦醇的含 量要明显高于其他部位，可达到5 0 1 0 0 1 x g g 。也正因为此，一直以来倍受法国人推崇的 葡萄酒中自藜芦醇的含量也较高。有人做过相关调查，其结果显示，红葡萄酒中白藜芦 醇含量可达1 5 3 m g g ，而由于酿制方法的不同，白葡萄酒中则白藜芦醇含量很少 1 0 1 。近 年来，人们对花生原料中的白藜芦醇的研究也越来越多。据报道，每克花生大约含2 6 毫克白藜芦醇。而在花生各个组织中，白藜芦醇含量一般为壳多于红衣，多于花生仁【- l 】， 而且不同产地的花生中白藜芦醇的含量也不相同。 除了以上较为常见的含有白藜芦醇的植物可作为提取资源外，科学家们也正在积极 的寻找和开发新的途径以获取白藜芦醇，并且已经有所发现。近年已有报道，在黑巧克 力中首次发现了白藜芦醇，可可豆浸提液中也被证实确有白藜芦醇的存在 1 2 1 。其中黑巧 克力中白藜芦醇的含量约为0 4 p p m ，而可可豆浸提液中自藜芦醇的含量则至少为 0 5 p p m 。此外，白藜芦醇还在西红柿和某些越橘品种中被检测出来4 】。 1 2 2 白藜芦醇的功能作用 白藜芦醇之所以受到如此广泛的关注，主要归功于其所具有的多种生物学活性及药 理作用。人们已经发现它具有抗癌、抗菌、抗氧化、预防心脏病、降血脂和抗诱变等作 用。 ( 1 ) 抗癌作用 目前，想要降低癌发病率和死亡率，一种最直接的方法便是对癌症进行化学预防。 为了找到一种全新高效无毒的防癌剂，人们筛选出了数百种植物提取物，通过大量的试 验和研究，最终从决明根中分离得到了活性成分白藜芦醇。越来越多的证据表明白藜芦 醇具有抗增殖作用，可用于预防和治疗慢性炎症及肿瘤 1 s - t r l 。白藜芦醇对肺癌、肝癌、 肠癌、胃癌、乳癌、白血病等均具有拮抗作用。在生理代谢过程中，环氧化酶将产生四 烯酸催化成前列腺素等前炎症物质，这类物质可以刺激肿瘤细胞，使其快速生长，并能 麻痹人体免疫系统对肿瘤细胞的警觉作用。此外，环氧化酶能够催化致癌物形成激活态， 3 陕西科技大学硕士学位论文 对细胞基因物质造成直接的破坏1 1 8 1 。白藜芦醇通过抑制人体内环氧化酶及过氧化氢酶的 功能，可以对抗最初的细胞和亚细胞损伤，抑制肿瘤的发生和发展，起到防治癌症的作 用。经不断的研究表明，白藜芦醇对癌细胞d n a 合成的抑制作用是羟基脲( 可清除自 由基，临床用于肿瘤的化疗) 的2 5 倍。另外，值得一提的是，白藜芦醇对癌细胞的抑制 作用具有高度选择性，它在抑制癌细胞增殖的同时，还对正常细胞的存活具有促进作用， 被认为是最有希望的一种天然化学防癌剂【- 9 1 。 ( 2 ) 对心血管的作用 适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的观点已得到普遍认同，研究证实，白藜芦醇是 葡萄酒中发挥心血管保护作用的主要功能因子。白藜芦醇通过与人体内雌性激素受体的 结合调节血液中的胆固醇水平，减少人患心血管病的风险。白藜芦醇还具有抗血小板凝 集作用，对血小板相互之间发生聚集形成血块并黏附在血管壁上的现象有抑制作用，从 而抑制和减轻了心血管病的发生和发展。此外，白藜芦醇能抑制铜介导的低密度脂蛋白 的氧化，通过整合和消除自由基来保护低密度脂蛋白的过氧化，从而预防冠心病。 ( 3 ) 抗氧化、抗自由基、抗衰老作用，可预防老年痴呆症 目前，氧化和自由基损伤已经被公认为是引起细胞中d n a 损伤进而导致细胞恶变 的重要机制之一。多酚类化合物大多具有较强的抗氧化、抗自由基作用，白藜芦醇也不 例外刚。它不仅可对人体中低密度脂蛋白( l d l ) 的氧化起到抑制作用，还能抑制膜脂 的过氧化，减少过氧化氢( h 2 0 2 ) 等的产生，从而起到抗氧化、抗自由基的作用【2 - - 2 3 1 。 冯永红等通过大量的实验研究，证明了白藜芦醇对f e n t o n 反应所产生的o h 有显著的抑 制作用，而且对黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶自由基发生系统所产生的0 - 2 的抑制效果也很不 错。瑞典与英国科学家通过大量的科学试验证明，白藜芦醇可对老鼠胚胎脑细胞起到一 定的保护作用，含有脑磷脂细胞的神经元可因为白藜芦醇的保护而避免叔丁基过氧化物 自由基的损伤【9 】。由于白藜芦醇能够清除体内自由基，活化体内功能因子，促进并保持 体内新陈代谢的顺畅，被美国抗衰老圣典列为“1 0 0 种最有效的抗衰老物质之一 刚。 ( 4 ) 抗菌、抗炎作用【2 s 删 白藜芦醇最初被人们所认识，是作为葡萄类植物在受到真菌感染、紫外线照射等不 利条件作用时所产生的一种抗逆物质。近几年来国内外的研究表明，白藜芦醇能够较好 的抑制金黄色葡萄球菌和肺炎双球菌，对深红色发癣菌以及趾间发癣菌也能起到不错的 抑制效果。也正是由于这些作用，许多含有白藜芦醇的药物被广泛应用于烧伤、烫伤、 感染及放射性皮炎等的治疗。 ( 5 ) 保护肝脏的作用 研究发现，白藜芦醇能有效降低血清和肝脏中沉积的脂质，对脂质过氧化物在体内 的积累也有显著的抑制作用，避免肝脏受到损害。另据报导，具有抗氧化性的白藜芦醇 4 高纯度白藜芦醇的提取纯化研究 可以调整肝脏星形细胞和星状细胞的功能，由此具有抵御肝损伤的功能鲫。白藜芦醇还 能降低g p t ，具有抗肝炎的作用。 。 ( 6 ) 其他 金春华【1 9 】等以虎杖苷为对象，深入的研究了虎杖苷改善微循环的作用机理。结果表 明，白藜芦醇对细胞内钙及酸碱度具有双向调节作用，可以使白细胞对血管内皮的粘附 性直接降低，从而改善微循环。另有不少研究证实，白藜芦醇及白藜芦醇甙还具有神经 保护、镇咳平喘、免疫调节以及对暂时休克的治疗作用等1 3 0 - 3 1 ，并且也已经广泛用于治疗 皮炎、脚癣、脓肿等疾病。此外，有研究报导，白藜芦醇在治疗胃溃疡方面取得了令人 满意的效果。近年来，美国天然药物研究所( 研究发现白藜芦醇还具有抗艾滋病的 作用。 1 2 3 国内外研究动态和水平 就全球范围来看，癌症的发病率和死亡率正在呈现逐年上升的趋势，而对于癌病的 治疗和预防也成为医学领域的一大难题。被誉为继紫杉醇之后的又一新型绿色抗癌药物 的白藜芦醇，已凭借其独特的抗癌效果及其他方面的保健功能越来越多的受到人们的关 注。目前，世界上已经有十多个国家和地区正在积极致力于寻找和开发白藜芦醇原料及 制剂，我国也不例外。大量的研究人员以葡萄籽、葡萄皮以及花生皮等富含白藜芦醇的 下角料为研究对象，尝试采用不同的方法提取分离其中的白藜芦醇，企图提高食品原料 的附加值及综合利用率，变废为宝。国内包括白藜芦醇在内的天然纯品提取物的生产厂 家也越来越多，但其产品在国内市场上较为少见，大部分用于出口。目前白藜芦醇的年 生产能力约为5 0 6 0 吨，低纯度产品的市场售价已达到每公斤1 8 2 0 万元。由于白藜芦 醇具有多种生物和药理活性，使其广泛应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领 域【3 2 】。 美国已把它作为一种膳食补充剂，在日本，已将从植物中提取的白藜芦醇作为功能 食品添加剂，加拿大的n a t r o lr e s v e r a t r o l 已作为含有白藜芦醇的保健品投放市场并且销 售火爆。在国内也有将含白藜芦醇的植物提取物制成具有降脂、美容和减肥、抗癌的胶 囊，或将其添加到果酒中。国内含有白藜芦醇的保健品也有不少，如四川天狮集团生产 的“天狮活力康胶囊”、西安纳贝生物工程技术有限责任公司的“纳贝益生胶囊 等。在 “十一五 计划中，我国也已将研制白藜芦醇口服抗癌药列为重点项目。另外，还可以 将其添加到各种保健饮料中。许多葡萄酒生产厂家已经将白藜芦醇的含量作为检测葡萄 酒性能的重要标准之一。 1 2 3 1 检测方法 随着现代科学技术水平的日益提高，能够应用于白藜芦醇的检测手段也越来越多，其 中最为常用的方法是紫外分光光度法0 r e ) t - 羽l 、薄层色谱法( t l c ) 【3 5 】和高效液相色谱法 5 陕西科技大学硕士学位论文 ( h p l c ) 【3 7 1 ，其他一些近年来研究较多的检测方法还包括荧光法【3 9 l 、毛细管电泳法 ( h p c e ) - l 、气相色谱一质谱联用法( g c m s ) 、二极管阵列检测法以及一阶导数光谱法等。 这些方法大多操作简单、快速安全，而且检测结果准确可靠，重现性较好【4 2 】。此外，这 几种方法还都具有样品用量少的特点，适合于微量样品的检测。 1 2 3 2 提取方法 自从白藜芦醇及其独特的药理功能第一次被人们所发现，对其分离提取的尝试和研 究就始终没有停止过。科学家及研究人员发现，白藜芦醇易溶于甲醇、乙醇等极性有机 溶剂，因而可以以极性有机溶剂作为浸提液，采用加热提取、回流提取及索氏提取等方 式进行提纯【4 3 卅。通过对白藜芦醇结构的分析，发现可以对溶液的p h 值进行调节，采用 碱溶酸沉淀法进行提取【4 5 】。然而，这些经典的化学方法存在很多弊端，诸如：提取时间 长、得率低、耗费试剂和药品较多、易造成环境污染等。随着科学技术的发展，新技术、 新设备的不断出现，使得分离手段不断改进，提取方法也不断的在创新。目前较为先进 的提取技术包括：超声波辅助提取技术( , g , - 4 7 1 、微波辅助提取技术【4 8 1 、超临界流体萃取技术 4 9 - ! i 0 、酶工程技术等。它们都极大的推动了中药提取技术的发展。 1 2 3 3 纯化方法 同提取方法相比较，自藜芦醇的纯化方法显得略微单调，目前使用较多的纯化方法 是柱层析纯化法 s 1 - ，2 1 。其中，又以大孔吸附树脂柱和硅胶柱最为常见，也有文献报道将两 种吸附柱串联使用纯化白藜芦醇，得到的效果令人满意。要得到纯度高、品质好的白藜 芦醇，制备型高效液相色谱是国外常用的手段之一。但该纯化法对样品前期处理的要求 较高，成本较大。此外，近年来研究较多的纯化手段还包括分子蒸馏纯化法、高速逆流 色谱纯化法【5 3 】等。 1 3 论文的研究目的及意义 虎杖是我国传统的中药，临床上多用于关节痹痛、湿热黄疽、经闭、咳嗽痰多、水 火烫伤、跌打损伤、筋骨疼痛、痈肿疮毒等症状的治疗【l 】。其自然资源相当丰富。随着 对虎杖活性成分的深入研究，认为白藜芦醇是虎杖中最主要的有效成分。高纯度的白藜 芦醇更是高附加值产品，在医药、保健品、化妆品及食品添加剂等众多领域具有广阔的 应用前景。目前国内售价为3 4 0 0 0 元k g ，国际市场上同类产品的售价更高。近几年来， 国内外已有多家科研机构正在积极开展与白藜芦醇有关的工作。在我国的“十五 科技 发展计划及陕西省年度重点资助的科研项目指南中，都包括“大力推进中药现代化”的 内容。要实现中药现代化，质量控制和采用先进的加工工艺是关键，而质量控制必须有 相应简便、快速、准确的检测方法相配套，这也是本研究的重要内容。我们以陕南及秦 岭地区资源丰富的虎杖作为研究对象，采用先进的方法将白藜芦醇从虎杖中分离，并制 成高纯度产品，以期在中药现代化进程中发挥一定作用。 6 高纯度白藜芦醇的提取纯化研究 1 4 本论文研究方法的确定 白藜芦醇( r c s v e r a t r 0 1 ) 是一种多酚物质，广泛存在于葡萄、花生、桑树、决明、藜芦、 虎杖等植物中，其中以虎杖中的白藜芦醇的含量最高 4 3 1 ，综合多个文献，在干燥虎杖根 茎中的含量约为1 - 6 m g g 。虎杖为蓼科属多年生草本植物，是我国的一种传统中药。由 于大部分中药材的有效成分都被包裹在植物细胞壁内，用一般的有机溶剂提取，难以破 坏其细胞壁，导致提取率较低，国外2 0 世纪8 0 年代已有利用酶法处理提取天然产物的 报道 s 4 - s s ，国内近些年也有许多类似工作【5 6 】，研究表明，酶解作用可以使细胞壁疏松、破 裂，减小传质阻力，加速有效成分的释放，从而提高提取率，提高原料的利用价值，成 为天然产物提取的新兴技术。 分离纯化是天然药物生产的关键步骤，天然产物中活性成分多且结构复杂，其有效 成分的分离、纯化十分困难。因此，选择适合的分离材料和分离方法很关键。 常规柱色谱方法是天然产物分离纯化广泛使用的方法，具有设备简单、易于操作、 可用于纯品制备且分离效率高等特点。目前，天然产物的分离研究已经由最初的纸色谱、 常规柱层析，发展到应用低压的快速层析、逆流液滴层析、高效液相层析、气相层析、 大孔吸附树脂精制法等，以得到更纯、更多的有效成分。大孔吸附树) 旨( m a e r o p o r o u sr e s i n ) 是一类有机高聚物吸附剂，具有比表面积大，吸附容量大，选择性好，再生