（环境科学专业论文）强化有机废水厌氧生物转化作用研究.pdf

强化有机废水厌氧生物转化作用研究 a b s t r a c t i nt h i sp 印e r t h ee f r e c t so fd i 骶r e n tc o n c e n t r a t i o n s0 fd e p r e s s 锄t so n 锄a e r o b i c h 2p r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d锄dm i c r o b i a lc o m m u n i t ) rs t r u c t l l r ew 弱a l s o e x 锄i n e d b yu s i n g d g g e t h u st l l ef a v o r a b l em i c r o b i a lc o m m 吼i t i e sf o r f e 硼e n t a t i v eh 2p r o d u c t i o n b y 觚a e r o b i cs l u d g ew e 陀o b t a i n e d t t l ee 毹c t so f b e n z o a t ec o n c e n t r a t i o no nc h 4p r o d u c t i o n 锄db e n z o a t e 锄r o b i cd e g r a d a t i o n 、e r e 锄a l y z e d 、v i t l lk i n e t i cm o d e t h ec o n t i n u o u se x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e dt oe x p l o 陀 h o wt 0e n h a n c et h ea c t i v i t ) ro fh 2 - p r o d u c i n g e t o g e n si nu a s br e a c t o ro nt i l eb 硒i s o ft l l er e s u l t so f b a t c he x p e r i m e n t s n l e 锄a l y s i sr e s u l t sf o rr e l a t i v ea b u l l d 锄c e so f h 2 p r o d u c i n g e t o g e i l su s i n gf i s h 印p r o a c ha l o n g 诵t l lt 1 1 es m ad e t e n n i n a t i o n d e m o r l s t r a t e dt h a tt h eb a c t e r i a 、 ，e r ee 商c h e d t h em a i nc o n c l u s i o r l sa i ea sf 0 u o 、) r s ： ( 1 ) t h eh 2p r o d u c t i o na b i l 时b y 锄a e r o b i cs l u d g ec o u l db ei m p r 0 v e dt h r o u g h r e p r e s s i n gm e t l l a n o g e n i ct i v i 够 谢t l lc h c l 3锄d p h e n o ip r e 仃e a t m e n t c o r r e s p o n d i n g l y t h ef a v o m b l em i c r o b i a lc o m m u n i 哆s t m c t u r e sf o rh 2p r o d u c t i o nb y 觚r o b i cs l u d g cw e 代f o r m e db yc o n n o l l i n go 唱a i l i ci n h i b i t o r sc o n c e n t r a t i o ni i l a p p r o 砸a t el e v e l 1 1 1 eo p t i m a lc 0 n c e n t r a t i o no fc h c l 3a n dp h e n o lf o rh 2p r o d u c t i o n w e r eo 0 5 0 a n d8 0 0m g c o d l ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) w i t l l1 ) e n z oa t e 舔t h es o l ec a r b o ns o u r c e ，n l em a x i m 啪c h 4y i e l d 觚d s p e c i f i cc h 4p r o d u c t i o nr a t ew e r ea c k e v e da ts u b s 昀t ec o n c e n t r a t i o no f1 o g l 。1 锄d 1 2 9 l ，r e s p e c t i v e l y t h em a x i m 啪b e n z o a t ec o n c e n t r a t i o nf o rc h 4p r o d u c t i o n 、v 勰 2 7 9 9 l l c o r d i n gt 0h 锄- l e v e n s p i e lm o d e l 锄a l y s i s t h eb e n z o a t ed e 伊a d a t i o nr a t e w 觞f o u n dt ob et i l ef i r s to r d e r 诵m i nr 锄g eo fs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n 舶mo 2 o g l ( 3 ) t h eu a s b 陀a c t o r sw e r eo p e r a t e da ti n t e m a lt e m p e 阳t 1 】r eo f3 7 士l ，p ho f 6 8 - 7 2 ，锄dh r to f3 0 h t h e 孔t i v 时o fh y d r o g e n - p r o d u c i n ga c e t o g e n sc o u l db e e 仃e c t i v e l ye i l h 锄c e db ya d d i n gs o d i 姗e t a t ei ni n n u e n t ( c o d ：n ：p = 3 0 0 ：5 ：1 ) o f u a s b b o t hs m ao f 锄a e r o b i cs l u d g e 锄dr e l a t i v ea b u n d 锄c e so fh 2 p r o d u c i n g e t o g e n st h r o u 曲a u g m e n t a t i o nw e r ei m p r 0 v e ds i 印i f i c 觚t l yc o m p a r e dt 0c o n 们l s y s t e m n a b s t m c t k e y w o r d s ：b i o h y d r o g e np r o d u c t i o n ； p r e t r e a t m e n t ； u a s b r e a c t o r ； h y d r o g e n p r o d u c i n ga c e t o g e n s ；p c r d g g e ；f i s h u i 第一章引言 第一章引言 1 1 选题背景 经济和社会的快速发展使环境污染问题日趋突出。不可再生的资源和能源被 大量消耗又加剧了环境污染与能源危机，资源和能源的供应压力逐渐增大【l 】。因 此，将废弃物进行高效处理并能资源化是实现可持续发展的要求。厌氧生物处理 技术不但能净化污染，还可有效回收能源物质，是一种环境友好的废物处理技术， 应用范围亦日趋广泛，由过去主要用于高浓度有机废水处理和城市污水厂剩余污 泥的稳定处置，向处理低浓度有机废水、含难降解有机物的工业废水以及生物质 制取新能源物质等方面拓展【2 一。但是，该技术在实际应用中也存在一些迫切需 要解决的问题如厌氧微生物种群结构的优化、难生物降解有机物的资源化、厌氧 反应器运行效率和稳定性的提高。 1 2 厌氧生物处理技术研究现状 厌氧生物处理技术通过多种微生物的协调作用将有机物转化为c h 4 和c 0 2 ， 具有能耗低、效率高、污泥产生量少、无二次污染等优点而备受关注【”。自2 0 世纪6 0 年代开始，随高效厌氧反应器如上流式厌氧污泥床反应器( u p f l o w 觚a e r o b i cs l u d g eb l 孤k e t ，u a s b ) 、厌氧颗粒污泥膨胀床反应器( e x p a n d e dg r a n u l a r s l u d g eb e d ，e g s b ) 、厌氧内循环反应器( i n t e m a lc i r c u l a t i o n ，i c ) 等的相继出现 使得厌氧生物处理技术发展迅速，实际应用范围逐渐扩大，效能不断提高，在有 机废水的生物处理过程中发挥着重要作用6 7 1 。 1 2 1 厌氧生物处理技术原理 厌氧过程的微生物主要有不产甲烷菌和产甲烷菌，其中不产甲烷菌包括产酸 发酵菌群、产氢产乙酸菌群和同型产乙酸菌群1 8 9 1 。有机废水厌氧生物处理过程 如图1 1 所示，分为四个阶段。第一阶段( 水解发酵) ，细菌胞外酶将糖类、脂 类等难溶于水的大分子物质水解为易被细菌利用的小分子物质，在发酵细菌的作 用下，单糖、氨基酸等小分子有机物通过乙醇发酵、丙酸和丁酸发酵、混合酸发 酵转化为乙醇、挥发性脂肪酸。第二阶段( 产氢产乙酸) ，产氢产乙酸菌将水解 发酵阶段产生的醇类和挥发性脂肪酸转化为乙酸、h 2 和c 0 2 ，为产甲烷菌提供 l 强化有机废水厌氧生物转化作用研究 底物的同时解除了因挥发性脂肪酸积累对产酸发酵菌群产生的抑制作用【i0 1 。有 研究表明，产氢产乙酸菌严格厌氧或兼性厌氧，与产甲烷菌和硫酸盐还原菌等互 生，目前可被分离纯化的菌株很少i l 。第三阶段( 同型产乙酸) ，同型产乙酸菌 群将h 2 和c 0 2 转化为乙酸。因h 2 的消耗使得厌氧体系氢分压降低，有利于厌氧 消化过程的进行，产物被产甲烷菌利用合成甲烷。第四阶段( 产甲烷) ，产甲烷 菌利用前三阶段产生的乙酸、甲醇、甲酸、h 2 、c 0 2 等合成c h 4 。 图1 1 复杂有机物厌氧生物降解不恿图 f g 1 1a n r o b i cb i o d e 笋a d a t i o no fc o m p l e xo 玛锄i cc o m p o u n d s 1 2 2 有机废水厌氧生物处理进展 有机废水厌氧生物处理技术发展分为三个阶段【1 2 】，每一阶段均以一种新型反 应器为代表。第一阶段( 2 0 世纪6 0 年代以前) 以第一代厌氧反应器厌氧消化池 为代表，主要用于污泥处理。但反应器内微生物浓度较低，处理效果较差。第二 阶段( 2 0 世纪6 0 一8 0 年代) 以上流式厌氧污泥床反应器( u a s b ) 为代表。其 具有污泥浓度高、容积负荷高、无需搅拌等优点，广泛应用于难生物降解有机废 2 第一章引言 水的处理以及废水的资源化【1 3 15 1 。第三阶段( 2 0 世纪8 0 年代以后) 以第三代厌 氧反应器如i c 和e g s b 反应器为代表，解决了u a s b 反应器在运行过程中出现 的不足，如短流、堵塞等问题，进一步提高容积负荷和处理效率，扩大了适用范 围【引。 1 2 3 厌氧生物过程限速步骤分析 厌氧生物处理过程需要水解发酵菌群、产氢产乙酸菌群、同型产乙酸菌群和 产甲烷菌相互协调才能顺利完成。研究显示一旦厌氧过程中v f i a s 大量积累，超 过了产氢产乙酸菌的转化能力，导致系统p h 下降，会抑制产甲烷菌的活性【1 9 l 。 从热力学角度分析，甲烷化过程可自发进行，而产氢产乙酸过程需消耗能量。因 此，甲烷化过程较产氢产乙酸过程更易进行【2 0 川。产氢产乙酸菌生长缓慢、生长 条件苛刻，在营养生态位上位于产酸发酵菌群和产甲烷菌群之间，其转化乙醇和 挥发性脂肪酸为乙酸的能力较弱。故产乙酸菌群的产乙酸作用是厌氧生物处理过 程的第一限速步骤1 2 2 1 。 产氢产乙酸菌群在功能生态位上起到承上启下的重要作用，强化其产氢产乙 酸作用，增强其代谢活性，将有助于提高厌氧反应器的处理效能和运行稳定性。 产氢产乙酸菌群的代谢活性易受到环境因素的影响【2 3 1 ，如进水成分、p h 和温度 等。通过控制厌氧反应器的运行条件富集产氢产乙酸菌群，能加快其对乙醇和挥 发性脂肪酸的转化利用，为产甲烷茵提供可利用的底物，进而提高厌氧反应器的 处理效率。同时，可以产生清洁能源h 2 和c h 4 ，实现有机废水生物处理的资源 化1 2 4 1 。 1 3 研究的目的、意义和内容 1 3 1 研究目的及意义 利用有机溶剂对厌氧污泥进行预处理，优化微生物种群结构，构建最佳产氢 微生物群落，强化有机废水的厌氧生物转化作用；利用微生物厌氧降解难降解有 机物，实现资源化利用；加富产氢产乙酸菌群，解决厌氧生物处理过程的限速步 骤问题，提高厌氧反应器的处理效能。本课题对有机废水的资源化利用和厌氧生 物处理效能的提高具有重大意义。 3 强化有机废水厌氧生物转化作用研究 1 3 2 研究内容 ( 1 ) 厌氧污泥前处理与种群结构优化 采用不同浓度氯仿和苯酚处理厌氧污泥，进行发酵产氢实验；分析气相产物、 液相产物及微生物多样性，构建最佳产氢微生物群落结构。研究厌氧污泥的产氢 能力及微生物群落结构的稳定性。 ( 2 ) 有机物的厌氧生物转化 研究以苯甲酸为唯一碳源进行发酵产甲烷实验，利用动力学模型分析底物浓 度对厌氧污泥发酵产甲烷能力的影响及苯甲酸的厌氧降解动力学过程。 ( 3 ) 高效厌氧反应器系统的构建 通过运行条件的控制( 进水成分、p h 和温度等) ，强化厌氧生物处理过程中 产氢产乙酸作用。利用荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ， f i s h ) 技术对反应器内产氢产乙酸菌群进行定量分析。通过测定厌氧污泥比产 甲烷活性( s p e c i f i cm e t l l 锄o g e m ca c t i v 时，s m a ) 的变化及液相末端产物的组成 分布，获得富集产氢产乙酸菌群的技术，提高厌氧反应器的处理效能。 1 3 3 课题研究技术路线 利用c h c l 3 和苯酚预处理厌氧污泥，优化微生物种群结构，强化有机废水的 厌氧生物转化作用；利用微生物厌氧降解苯甲酸，实现资源化利用；在以上间歇 实验的基础上进行连续流实验，通过控制u a s b 反应器的运行条件，强化产氢 产乙酸作用，并获得u a s b 反应器高效稳定运行的控制条件。课题研究技术路 线见图1 2 。 4 第一章引言 图1 2 课题研究技术路线图 f i g 1 2t e c t l n o i o 科r o u t eo ft h e 陀s e a r c h 5 强化有机废水厌氧生物转化作用研究 第二章厌氧污泥种群结构的优化 h 2 作为一种可再生的清洁能源，具有能量密度高、转化率高、应用范围广等 优点1 2 5 1 。目前9 0 的氢以不可再生的能源为原料通过化学法制取，能量消耗高 且易引起环境污染2 6 1 。与化学方法相比，厌氧生物制氢技术具有低能耗、低成 本、可利用多种有机废弃物等优点。但厌氧发酵制氢中，h 2 易被产甲烷茵、同 型产乙酸菌、硫酸盐还原菌等耗氢菌消耗，从而造成氢气产率降低1 2 7 l 。有研究 表明，对厌氧污泥进行预处理，可有效抑制耗氢菌活性，从而富集产氢菌，以达 到提高厌氧污泥的发酵产氢能力的目的【2 8 】。 厌氧污泥前处理方法主要有酸碱处理、热处理、曝气处理、超声处理、有机 抑制剂处理等1 2 7 2 9 1 。在有些研究中热处理被认为是提高污泥产氢效能的最有效的 措施1 3 们。而另一些研究中显示化学预处理方法，如酸、碱、有机物的添加( 三 氯甲烷、苯酚) 可有效提高产氢效率【3 。与酸、碱、热处理方法相比，三氯甲 烷、苯酚等有机抑制剂能抑制污泥中耗氢菌如产甲烷菌的活性【3 2 l 。本章研究了 不同浓度c h c l 3 和苯酚处理厌氧污泥的发酵产氢效能：采用p c r d g g e 技术分 析了微生物种群多样性的变化和微生物群落结构。 2 1 材料与方法 2 1 1 接种污泥与产氢 接种污泥取自处理工业废水的厌氧反应器。在使用之前，水洗三次并过孔径 2 0m m 筛，以去除粒径较大的物质。原始污泥样品记为y 。 c h c l 3 处理厌氧污泥发酵产氢：实验在6 0 0 m l 玻璃反应器中进行，分别向 其中加入1 0 0 m l 厌氧污泥和o 3 m l 营养液，营养液【3 3 】组成为( m g l 。1 ) ：c 6 h 1 2 0 6 l o ，o o o ；n h 4 h c 0 32 0 2 4 ；n a c ll o ；k 2 h p 0 4 3 h 2 08 0 0 ；c a c l 25 0 ：m g c l 2 6 h 2 0l o o ： f e c l 22 5 ；c u c l 2 5 h 2 05 ；c o c l 2 6 h 2 05 ；m n c l 2 4 h 2 05 ；a l c l 32 5 ；z n c l 25 ； n i c l 2 6 h 2 05 ；( n h 4 ) 6 m 0 7 0 2 41 5 ；h 3 8 0 45 。用蒸馏水定容至3 0 0 m l ，调p h 至 7 0 ，向玻璃反应器中充高纯氩气3 m i n 以保证厌氧环境，并迅速密封。分别向玻 璃反应器中注入0 0 0 0 、0 0 2 5 、o 0 5 0 、0 0 7 5 、0 1 0 0 、0 1 2 5 、o 1 5 0 、 0 1 7 5 、o 2 0 0 ( 质量百分百比) c h c l 3 溶液，置于( 3 6 士1 ) 、1 2 0 印m 恒温 6 第二章厌氧污泥种群结构的优化 摇床中进行发酵产氢实验。污泥样品分别记为f 1 、f 2 、f 3 、f 4 、f 5 、f 6 、f 7 、 f 8 和f 9 。 产氢停止后对污泥进行离心、蒸馏水冲洗5 次以去除剩余葡萄糖和反应过程 中生成的液相产物。将污泥样品接种到新鲜的培养基，再次进行发酵产氢实验， 条件同上。反应结束后样品分别记为s l 、s 2 、s 3 、s 4 、s 5 、s 6 、s 7 、s 8 和s 9 。 所有污泥样品设置3 个平行样。 苯酚处理厌氧污泥发酵产氢：取1l 份l0 0 m l 厌氧污泥接入6 0 0m l 的玻璃 反应器中，然后依次加入3 0 9 葡萄糖、o 3 m l 营养液，体积控制为3 0 0 m l ，用l m o l l dh c l 或lm o l - l 。1n a o h 将p h 调至7 0 ；鼓氩气3 m i n ，迅速用橡胶塞密封， 依次注入不同浓度的苯酚溶液( 苯酚浓度4 2 0 m g l 1 = c o d l o o o m g l 1 ) ：o 、4 0 0 、 8 0 0 、1 2 0 0 、1 6 0 0 、2 0 0 0 、2 4 0 0 、3 0 0 0 、4 0 0 0 、5 0 0 0 、7 0 0 0 ( 实验结束后的污泥 样品记为b l 、b 2 、b 3 、b 4 、b 5 、b 6 、b 7 、b 8 、b 9 、b 1 0 、b 1 1 ) ，置于( 3 6 士1 ) 、1 2 0r p m 的恒温摇床中进行发酵产氢实验，设置3 个重复。 2 1 2 理化性质分析方法 v s s 和p h 的测定采用标准方法1 3 4 1 ，总糖用葸酮法测定1 3 5 1 。氢气含量采用气 相色谱法测定，取1 0 0 l 样品注入配备有不锈钢填充柱( g d x 1 0 2 ) 的气相色 谱仪( s p 一6 8 0 0 a 6 ) 中进行分析；检测器为热导池，桥电流8 0 m a ：进样器、色 谱柱和检测器的温度分别为l o o ，6 0 和1 0 5 ；载气为高纯氦气，流速3 0 m l m i i l 一。 挥发性脂肪酸( v 0 l a t i l ef a t t ) ，a c i d ，v f a ) 和苯酚的测定采用气相色谱法( 安 捷伦6 8 9 0 ) ，配备有毛细管柱d b f f a p ( 3 0m o 2 5m m o 2 5p m ) 的。液体样 品1 2 0 0 0 叩m 离心l o m i n ，与3 甲酸等体积混合，并使用o 4 5 肛m 水系滤膜过滤， 处理后样品待测。进样器和检测器温度分别为2 2 0 、2 3 0 ，采用程序升温的 方法，初温l o o 保持3 m i n ，以2 0 m i nj 的速率升温至1 8 0 ，终温1 8 0 保 持3 m i n 。载气为氮气，流速5 0m l m i n 一。用g o m p e n z 方程分析累积氢的变化1 3 6 】： = 尸a ( p 一a ( p 【! 笔( 九一，) + 1 】) ( 2 1 ) r 式中，日( m l ) 为累积氢，p ( m l ) 为潜在累积氢，尺m ( m l h j ) 为最大产 氢速率，九( h ) 为延滞期。 7 强化有机废水厌氧生物转化作用研究 2 1 3 微生物多样性分析方法 2 1 3 1 厌氧污泥总d n a 的提取 总d n a 的提取方法参考文献进行1 3 7 】。取厌氧污泥1 2 m l ，依次加入0 1 m o l l 1 p b s ( p h 8 0 ) 5 4 0 p l ， 1 5 m o l l 1n a c l ，o 1m o l l 1 t r i sb a s e ( p h 8 0 ) ， o 1 m o l l 1 e d t a 和8 l 蛋白酶k ( 1 0 m g m l 1 ) ，3 7 、2 2 5 r m i n - 1 振荡3 0 m i n ， 然后加入2 0 的s d s 6 0 “l ，6 5 水浴2 h 。将上述样品8 0 0 0 印m 离心1 0 m i n 后取 上清，向其中加入等体积酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，混匀后离心l o m i n ，取上 清，并重复此步骤一次。加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，8 0 0 0 印m 离心1 0 m i n ， 取上清，并向其中加入o 6 倍体积的异丙醇，室温沉淀2 h ，1 2 0 0 0 印m 离心2 0 m i n ， 弃上清，用7 0 冰乙醇清洗两次，无菌吹干，加入3 0 “l t e 缓冲液溶解沉淀，置 于2 0 保存备用。 2 1 3 2p c r 扩：噌 对提取的总d n a 采用嵌套式p c r 扩增【3 引。第一套p c r 扩增：引物为f o r ( 5 - g a g l l t g a t c c t g g c t c a g - 3 ) 和d e v ( 5 a g a a a g g a g g t g a t c c a g c c 3 ) ，反应体系5 0 “l ：5 lp c r b u f l f e r ， 1 p ld n t p s ，上下游引物各2 p l ，2 “l 模版，o 5 lt a q 酶，用超纯水补至5 0 “l 。 反应程序：9 4 5 m i n ；前2 0 个循环，6 5 5 5 ( 每个循环降o 5 ) 4 5 s ， 7 2 1 2 0 s ，后1 0 个循环9 4 6 0 s ，5 5 4 5 s ，7 2 1 2 0 s ：7 2 5 m i n 。 第二套 p c r扩增：引物为特异性引物g c f 3 5 7 ( 5 c g c c c g c c g c g c g c g g c g g g c g g g g c g g g g g c a c g g g g g g c c t a c g g g a g g c a g c a g 3 ) 和r 9 0 7 ( 5 c c g t c a a t t c c t l t r a g t l v r - 3 ) ，反应体 系5 0 p l ：5 “lp c rb u f f e r ，l p ld n t p s ，弓i 物各2 “l ，o 5 p lt a q 酶，2 “l 模 板( 一轮扩增产物的1 0 0 倍稀释液) ，用超纯水补至5 0 “l 。反应程序： 9 4 5 m i n ：前2 0 个循环为9 4 6 0 s ，6 5 5 5 ( 每个循环降o 5 ) l m i n ，7 2 3 m i n ， 后1 0 个循环为9 4 6 0 s ，5 5 l m i n ，7 2 3 m i n ；7 2 8 m i n 。扩增产物2 0 保存。 2 1 3 3d g g e 分析 使用第二轮p c r 扩增产物进行d g g e 电泳。聚丙烯酰胺凝胶浓度为6 ，变 性剂浓度梯度为4 5 6 5 。每孔加入2 5 “lp c r 产物和6 “l 的缓冲液，置于6 0 、 8 第二章厌氧污泥种群结构的优化 电压1 0 0 v 的l t a e 缓冲液中电泳1 7 h ，然后用核酸染料避光染色3 0 m i n ，用双 蒸水清洗后，使用t a l l o n 凝胶成像系统对图像进行采集。 2 1 3 4 克隆测序与构建系统进化树 选d g g e 图谱上的主要条带进行p c r 扩增，引物为不含g c 夹f 3 5 7 和r 9 0 7 。采 用上海生工胶回收试剂盒对目的产物进行回收纯化。用p c r 产物克隆试剂盒将扩 增产物与p e a s y t l 载体连接，转化到e 疗感受态细胞，在3 7 孵育1 h ，将其 涂布于含氨苄青霉素的培养基平板上，3 7 培养过夜。挑取白色单菌落于3 7 摇 床振荡培养4 6 h ，用特异性引物m 1 3 进行菌落p c r 。选择阳性克隆子菌液进行测 序，所得序列与g e n b a l l l ( 数据库中所含序列进行比对分析后构建系统发育树 ( m e g “1 ) 【3 9 1 。 2 2 结果与讨论 2 2 1c h c l 3 处理污泥厌氧发酵产氢 2 2 1 1c h c l 3 浓度对厌氧污泥发酵产氢的影响 不同浓度c h c l 3 对污泥发酵产氢的影响见表2 1 。在低的c h c l 3 浓度范围内 ( o 0 0 5 0 ) ，累积h 2 、最大产h 2 速率、h 2 含量、h 2 产率和葡萄糖转化率随 c h c l 3 浓度的增加逐渐增大；c h c l 3 浓度在o 0 5 0 加1 2 5 时，各参数逐渐减小； 当浓度大于o 1 2 5 时，无h 2 产生。在第一次实验中，当c h c l 3 浓度为o 0 5 0 时，累积h 2 ( 7 5 3 m l ) 和葡萄糖转化率( 9 9 9 3 ) 均达到最大值。综合考虑以 上各参数，o 0 5 0 为最适产氢c h c l 3 浓度。 为研究c h c l 3 处理厌氧污泥产氢的稳定性，将第一次实验结束后的污泥离心 沉淀，水冲洗后接入新鲜的培养基，进行再次发酵产氢实验。如表2 1 所示，当 c h c l 3 浓度为o o 0 5 0 时，累积h 2 等变化趋势与第一次产氢实验结果一致。在 浓度为o 0 5 0 时，累积h 2 、最大产h 2 速率、h 2 产率和葡萄糖转化率均达到最 大值；c h c l 3 浓度大于o 0 5 0 时，各参数逐渐减小。与第一次产氢实验相比， c h c l 3 浓度大于o 1 2 5 时，仍有h 2 产生且无c h 4 。这表明，c h c l 3 抑制产甲烷 菌的活性在c h c l 3 去除后仍难以恢复，但是产氢菌的活性不受影响，产氢能力具 较好的稳定性。 9 强化有机废水厌氧生物转化作用研究 表2 1 两批发酵产氢实验结果比较 t h b i e2 1 c o m p a r a t i v eh 2p r o d u c t i o no ff i r s ta n dr e p e a t e de x p e r i m e n t s p 猢e l 粥 c h c l l o 0 0 0 0 0 2 5 0 0 5 0 o 0 7 5 0 10 0 o 12 5 o i5 0 o 17 5 0 2 0 0 厌氧发酵产氢过程中常伴随大量脂肪酸的产生，添加不同浓度的c h c l 3 显著 影响液相产物的分布。乙醇、乙酸、丙酸和丁酸等主要液相产物的分布见图2 1 。 在第一、第二批次实验中，丁酸( 2 1 1 0 一5 8 6 8m m ) 和乙酸( 2 8 _ 4 8 6m m ) 是主 要的液相产物。丁酸随c h c l 3 浓度的变化趋势与累积氢一致，在c h c l 3 浓度为 o 0 5 0 时，丁酸浓度最大为5 8 6 8 m m ，当c h c l 3 浓度大于o 1 2 5 时，v f a s 的 浓度较低。如图2 1 所示，除样品f 7 f 9 外，其他样品产氢结束后的液相产物中 丁酸含量最大，且丁酸乙酸 l ，故厌氧发酵类型均是典型的丁酸型发酵。 l o 第二章厌氧污泥种群结构的优化 o 图2 1 主要液相产物分布图：a ：第一批实验b ：第二批实验 f i g 2 1t h e d i s t r i b u t i o no fs o l u b l em e t a b o l i t e so ff i r s t ( a ) a n dr e p e a t e db a t c ht e s t ( b ) 2 2 1 2 微生物种群多样性分析 c h c l 3 显著影响微生物群落结构，对微生物具有选择作用。图2 2 为不同 c h c l 3 浓度下厌氧污泥的d g g e 图谱。在f 1 f 9 中，随c h c l 3 浓度的变化，一 些条带出现( 条带1 5 、1 6 ) ，一些条带消失( 条带1 、1 3 、1 4 ) ，而一些菌群没有 发生变化( 条带3 、4 、6 、7 ) 。在样品s 1 s 9 中，一些菌群含量逐渐减少( 条带 强化有机j ：i f 水厌氧生物转化作用研究 8 ) ，一些菌群含量逐渐增加( 条带1 0 ) ，与第一批样品比较，条带9 、11 1 6 消失。 图2 2 不同c h c l 3 浓度下污泥d g g e 图谱 f i g 2 2d g g ep r o 行l e so fs l u d g es a m p i e sw i t hd i 伺 e r e n tc h c l 3c o n c e n t r a t i o n st r e a t m e n t 注：y ：接种污泥样品：f 1 f 9 ：添加不同浓度c h c l 3 进行产氢实验后的污泥样品；s 1 s 9 ： 玄除c h c l 3 进行产氢实验后的污泥样品。 n o t e ：y ：t h ei n i t i a ls e e ds l u d g es a m p l e ；fl f 9 ：t h es l u d g es a m p l e st r e a t e dw i t hd i f f e r e n t c h c l 3c o n c e n t r a t i o n sa tt h ee n do ff i r s tb a t c he x p e r i m e n t sl s 9 ：t h es i u d g es a m p i e so fr e m o v i n g c h c l 3a tt h ee n do tr e p e a t e de x p e n m e n t 构建系统发育树( 图2 3 ) 并进行比对结果见表2 2 。全部1 6 个克隆序列分 罹予b t l r k h o l d e r i a l e s ，c o r i o b n c | e r i n l e sa 媳c i o s l r i d i a l e s 。存在_ 于除1 1 9 桷既奄样 品中条带4 与蚴印办口p 阳p 口“c f v d m ，? ss t r a i nv t te 一0 3 2 3 4 l ( 严格厌氧的g + 菌) 的相似度达到9 9 ，为h p b f 4 0 4 。严格厌氧的g + 菌c s ，砌“聊( 条带6 、7 ) 是 主要的产氢菌属【4 2 4 3 1 。条带6 ( c - f d s ，油“mc p ，f 材，d s fs t r a i nd 3 ) 存在于所有样品中， 高浓度的c h c l 3 抑制产氢菌的活性，故样品f 7 f 9 无氢气产生。存在于除f 9 和 s 9 的所有样品中的条带7 属于嘞j 肛肋z 删s p h p b 4 ，对c h c l 3 具有一定的耐性， 但c h c l 3 浓度过高亦会使其失去活性。 1 2 b t l r l l o ! d e r i n i 缟 - 。叫 o 0 2 图2 3 基于1 6 sr d n a 序列的优势种群系统发育树 f i g 2 3p h y l o g e n e t i c 垤eo fd o m i n a mm i c r o b i a is p e c i e sb 笛e do nl6 sr d n a 辩q u e n 注：以n e i g l l b o r j o i n i n g 方法建立系统发育树；b 锄d 标记为d g g e 图谱中用于再扩增条带 的1 6 sr d n a 序列；节点数字为以b 0 0 t s t m p1 0 0 0 次进行自展分析的支持率：标尺0 0 2 为2 的核苷酸替换频率。 n o t e ：p h y lo | g e n e t i c 订e ew 撼c o n s 仃u c t e d 吣i n gn e i g h b o r j o i n i n ga l g o r i t h m t h em a r k e db 卸d 1 3 强化有机废水厌氧生物转化作用研究 w 豳r e a m p l i n e dl6 sr d n ag e n es e q u e n c e sf r o md g g eb a n d n u m b e r sa te a c hn o d ei n d i c a t et h e s u p p o r t i n gp e r n t a g eb yb o o t s t r a p 锄a l y s i sw i t h lo o oi t e r a t i o n s t h e a l eb a r 他p 陀s e n t so 0 2 s u b s t i t u t i o n sp e rn u c l e o t i d ep o s i t i o n u n c u l t u r e dd 西p 刀p ，口印c l o n ej 2 7 ( 条带1 ) 仅出现在样品f 1 f 8 中，其含量 随c h c l 3 浓度的增加逐渐减少，与累积氢的变化趋势一致，故u n c u l t u r e d 佻p ”p 砌 可能为h p b 。u n c u l t u r e db a c t e r i 哪c l o n e1 9 8 ( 条带1 5 ) 的含量随c h c l 3 浓度增 加逐渐增大，其变化趋势与累积氢相反，需要进一步研究其生理特性。条带1 6 与u n c u l t u r e db 材，砌d ，出，f 口c p 口pb a c t e r i u m 的相似度为9 4 ，在c h c l 3 浓度大于 o 1 5 0 时，此菌仍具有一定的活性。胁，6 唧f ，f 刀删s p p t 5 ( 条带8 ) 仅存在于 少量样品中( y 、f l 、f 2 、f 7 f 9 、s 1 s 3 ) ，可适应c h c l 3 浓度较低的环境，但 高浓度的c h c l 3 会抑制其活性。条带3 、1 0 与妇甩，厅加d 6 口c 陀，f “朋s p 7 、 七月砌加d 6 口c 胞，- f 姗，s p l e l b 4 6 的相似度分别为1 0 0 、9 9 ，如疗，厅f 刀d 6 口c 胞，f 姗zs p l e l b 4 6 ，仅存在于样品s 2 s 9 中，其相对含量的变化趋势与累积氢一致，故为 h p b 【4 4 1 。条带1 3 、1 4 的克隆序列属于不可培养细菌，仅存在于样品y 中，在 c h c l 3 浓度较低的环境中其活性即被抑制。 1 4 第二章厌氧污泥种群结构的优化 表2 2d g g e 优势条带的基因序列比对结果 t a b l e2 2a 币l i a t i o no fd g g ed o m i n a n tb a n d sb yt h e16 sr d n as e q u 朗c e so fv 鲥。吣s 锄p l e s 2 2 1 3 最适产氢微生物种群结构 c h c l 3 浓度为o 0 5 0 ( f 3 ) 时，累积氢、h 2 含量、最大产h 2 速率和底物利 用率均达到最大值，污泥产氢效果最好。c h c l 3 去除后，以上各参数的变化趋势 与第一批次实验结果一致。微生物多样性分析结果表明，样品- s 3 与f 3 具有相 似的微生物群落结构，是最适产氢微生物群落，主要的微生物有u n c u l t u r e d b a c t e r i 哪c l o n en b tl7 6 c ol 、，口玎，办伽d 6 口c ，p ，甜小s p 7 、 zp 口“c f ，d ，口力ss t r a i nv t t e - 0 3 2 3 4 l 、c 卯，”，d s fs n 面nd 3 、c - d s 护触“朋s p h p b - 4 。这表明，c h c l 3 处理厌 氧污泥后，微生物群落结构具有一定的稳定性。 强化有机尸发水厌氧生物转化作用研究 2 2 2 苯酚处理污泥厌氧发酵产氢 2 2 2 1 底物的转化与产氢 不同浓度苯酚处理厌氧污泥发酵产氢，累积h 2 、底物降解率等参数变化见 表2 3 。累积氢随苯酚浓度的增加而增加，在浓度为8 0 0 m gc o d l 。1 时，h 2 体积 达到最大值3 2 4 2 m l ，同时，产h 2 速率、h 2 产率和总糖降解率均达到最大，分 别为2 6 8m l h 一、o 8 7m o lh 2 m o l 1g l u c o s e 、9 9 9 4 ；然后累积h 2 随苯酚浓度的 增加而降低，在浓度为7 0 0 0 m gc o d l d 时，无h 2 生成，这主要是因为高浓度的 苯酚对产氢菌的活性产生抑制作用1 4 ”。图2 4 为发酵液中v f a s 各组分含量，乙 酸、丙酸和丁酸是主要的代谢产物，且丁酸浓度随苯酚浓度的变化趋势与累积氢 一致。反应结束后，p h 均有不同程度下降，这主要与发酵制氢过程中v f a s 的 生成有关。综合分析结果表明，厌氧污泥最适产氢苯酚浓度为8 0 0 m gc o d l 一。 表2 3 不同苯酚浓度对厌氧污泥发酵产氢的影响 t a b l e2 3e f to fd i 毹r e n tc o n c e n 仃a t i o 璐o fp h e n o lo n 锄r o b i ch 2p r o d u c t i o n 在厌氧条件下，苯酚首先转化为中间产物，再彻底分解为c h 4 和c 0 2 。本 研究中，反应结束后，样品中苯酚的浓度均有一定程度的下降，但在整个反应过 程中，未检测出c h 4 。这表明苯酚被转化为中间产物，没有彻底分解。 1 6 第二章厌氧污泥种群结构的优化 ，、 茎 e c o d m 虮) 图2 4 主要液相产物各组分含量 f i g 2 4d i s 仃i b u t i o no fs o l u b l em e t a b o l i t e s 2 2 2 2 微生物种群多样性分析 根据d g g e 图谱可半定量分析不同菌群的相对含量【矧。由图2 5 可以看出， 苯酚对厌氧污泥中微生物群落结构具有显著影响，随苯酚浓度的增加，不同样品 中菌群的相对含量有增加( 条带l o 、1 1 、1 7 ) ，有减少( 条带1 4 ) ，甚至消失( 条 带7 ) 。其中，一些菌群的相对含量无明显变化( 条带5 、6 、1 3 ) 。 1 7 8lioa四_dic q i q = l o - o co一萎_cdocoj 强化有机废水从铽生物转化作用研究 图2 5 小l 刭苯酚派厦f 污泥d g g e 图诸 f i g 2 5d g g ep r o n l e so fs l u d g es a m p l e sa td i f l 一e r e n tp h e n o lc o n c e n t r a t i o n s 注：b 1 b 1 1 ：添加不同浓度苯酚发酵产氢结束后的污泥样品 n o t e ：b1 一bl1