（免疫学专业论文）dmso诱导hl60为类中性粒细胞相关的生物学指标分析研究.pdf

d m s o 诱导h l 6 0 为类中性粒细胞相关的生物学指标分析研究摘要目的：中性粒细胞( p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l s ，p m n s ) 是参与机体固有性免疫的主要细胞，它来源于骨髓干细胞，是生命期限极短的终末分化细胞，一旦释放入血便很快启动自发性凋亡( s p o n t a n e o u sa p o p t o s i s ) ，这也是是中性粒细胞的内在生命本质特征。也正因此很难采用基因工程手段直接对中性粒细胞进行基因功能研究，这就为非凋亡非坏死性死亡机理研究带来了一定困难。急性髓细胞性白血病细胞系( h l 6 0 ) 为我们的研究带来了新的思路。h l 一6 0 具有很强的诱导分化能力，在二甲亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ，d m s o ) 的作用下，它可分化为成熟的髓样细胞，即类中性粒细胞( n e u t r o p h i l 1 i k ec e l l s ) 。类中性粒细胞具有很多中性粒细胞的分子标志物并具有中性粒细胞的潜在功能1 。孙。有研究对类中性粒细胞与中性粒细胞在细胞形态、化学激活和趋化性等方面进行了详细比较，发现二者表现出惊人的一致( 4 ) 。目前，类中性粒细胞已经成为广泛使用的中性粒细胞研究替代模型，且可以方便地使用基因工程手段进行基因功能研究( 父。我们的实验通过d m s o 诱导h l 一6 0 细胞为类中性粒细胞，从细胞形态、细胞生物学活性、细胞凋亡相关蛋白等方面进行了探索性的研究，为进一步研究中性粒细胞自发性凋亡的机理提供模型。方法：体外培养h l 一6 0细胞，在对数生长期细胞加入d m s o ( 终浓度1 ) 对其进行刺激和诱导，然后分别于2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、6 d 收集细胞，以未加d m s o 处理的相应各时间点h l 6 0 细胞作为空白对照组；运用光学显微镜镜下观察细胞的形态学变化；m t t 法检测细胞活力；用t r i z o l 法提取各组别细胞的总核糖核酸( r i b o n u c l e i ca c i d ，r n a ) ；将r n a 逆转录为互补脱氧核糖核酸( c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，c d n a ) 以上述c d n a 为模板，分别扩增分化标志物c d ll b 及g a p d h 内参片段；将p c r 产物进行1 5 琼脂糖凝胶电泳；利用免疫印迹( w e s t e r nb l o t t i n g ) 技术检测凋亡相关蛋白f a s 和c a s p s e 3 在类中性粒细胞中的表达。结果：( 1 ) 随着诱导时间的延长被诱导细胞的体积逐渐增大，4 8 h 后出现了肾形核、分叶核、蚕豆核等粒细胞核型，并随时间的延长逐渐增多。( 2 ) d m s o 处理后，2 4 h 开始，p c r 结果显示c d llb 的表达上调，与空白对照组相比有明显的差异性( p o 0 1 )( 3 ) p c r 结果显示空白细胞组，在o h 、2 4 h 、4 8 h 亦隐约可见有c d l1b的表达，7 2 h 、6 d 未见c d ll b 的表达。( 4 ) w e s t e r nb l o t t i n g 显示d m s o处理前后，细胞中f a s 、c a s p a s e 3 的表达量方面未见明显的规律变化。( 5 ) w e s t e r nb l o t t i n g 显示d m s o 诱导h l 6 0 细胞分化为中性粒细胞后，f a s 、c a s p a s e - 3 的w e s t e r n b l o t 条带有变化。( 6 ) w e s t e r nb l o t t i n g显示对比对照组和d m s o 处理组，比较明显的一个现象是，无论是c a s p a s e 3 还是f a s ，在d m s o 处理后，都出现了新的条带。结论：1 d m s o 可以诱导h l 6 0 细胞分化为类中性粒细胞。2 诱导成的类中性粒细胞表现出粒细胞核型。3 f a s 和c a s p a s e 3 不能促进或延迟类中性粒细胞的凋亡。4 d m s o 诱导h l 6 0 细胞分化为类中性粒细胞后，f a s 、c a s p a s e 。3 的表达显示可能有新的亚基出现。关键词：中性粒细胞；h l 6 0 细胞；类中性粒细胞；自发性凋亡；f a s ；c a s p a s e 3b i o l o g i c a li n d e xa n a l y s i so fn e u t r o p h i l s - - l i k eh l - - 6 0i n d u c e db yd m s oa b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：p o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l s ( p m n s ) a r ep r i m a r yc e l l si n v o l v e di ni n n a t ei m m u n i t y o n c ed i f f e r e n t i a t em a t u r e ，p m n su n d e r g os p o n t a n e o u sa p o p t o s i sp r o g r a m t h i sp r o c e s sh a sb e e nr e c o g n i z e da sac r u c i a lm e c h a n i s mf o rm a i n t a i n i n gt h es t a b i l i t yo fi n t e r n a le n v i r o n m e n ta n da c c o m p l i s h i n gt h er e s o l u t i o no fi n f l a m m a t i o n p m n sa r ed e r i v e df r o mb o n em a r r o ws t e mc e l la n dt h e ya r et e r m i n a ll yd i f f e r e n t i a t e dc e l l s t h eh i g hr a t eo fc o n s t i t u t i v e l ys p o n t a n e o u sa p o p t o s i si sas p e c i a lf e a t u r eo fh u m a nn e u t r o p h i l s j u s tb e c a u s eo ft h es p o n t a n e o u sa p o p t o s i s ，t h e r ew e r es o m ed i f f i c u l t yw h e nw es t u d yo nt h eg e n ef u n c t i o no fp m n s d i m e t h y l s u l p h o x i d e ( d m s o ) c a nr e d u c eh l - 6 0c e l l st on e u t r o p h i l s 1 i k ec e l l s n e u t r o p h i l s - l i k ea s l oh a v eag r e a tm a n ym o l e c u l em a r k e r sa n dp o t e n t i a lf u n c t i o n so fp m n s w h e nc o m p a r ew i t hn e u t r o p h i l s l i k ea n dp m n s ，s o m er e s e a r c hs h o wt h e r ew e r ej u s tt h es a m eo nc e l ls h a p e ，b i o l o g i c a l a c t i v i t ya n dp r o t e i no fc e l la p o p t o s i s r e p l a c eb yn e u t r o p h i l s l i k ea sam o u l di sm o r ea n dm o r ep o p u l a rw h e nr e s e a r c ho np m n sa tp r e s e n t a n di nt h i sw a y ，i no r d e rt os t u d yp m n sw ec a nm a k eu s eo fm e t h o d so fg e n e t i ce n g i n e e r i n g t h u s ，w ei n v e s t i g a t e dt h em e c h a n i s m so fn e u t r o p h i ld e a t hb yd m s oi n d u c eh l - 6 0c e l lt on e u t r o p h i l s 1 i k e m e t h o d s ：1 h l - 6 0c e l lw a sc u l t i v a t e di nv i t r oa n di n d u c e db yd i m e t h y l s u l p h o x i d e ( f i n a lc o n c e n t r a t i o n1 ) a te x p o n e n t i a l4p h a s e h l 6 0c e l l si n f l u e n c e db yd i m e t h y l s u l p h o x i d ec a p a b l eo fi n d u c i n gd i f f e r e n t i a t i o nf o rd i f f e r e n tt i m ew e r eu s e da ss u b j e c t s n o n ei n d u c e dh l 6 0c e l l sf o rd i f f e r e n tt i m ew e r en e g a t i v ec o n t r 0 1 c e l lm o r p h o l o g yo fd i f r e r e n tc u l t u r e dc o n d i t i o n sw a so b s e r v e db yo p t i c a lm i c r o s c o p e t h ev i a b i l i t yo fn e u t r o p h i l sw a sd e t e c t e db ym t ta s s a y t o t a lr n af r o mn e u t r o p h i l sw a se x t r a c t e db yt r i z o lr e a g e n ta n dt h et o t a lr n aw a sr e v e r s e l yt r a n s c r i b e dt of i r s t - s t r a n de d n a c dllbm r n ae x p r e s s i o no fd i f f e r e n tg r o u p sw a sd e t e c t e db yr t - p c r e x p r e s s i o no ff a sa n dc a s p a s e 3w a sd e t e c t e db yw e s t e mb l o r i n g r e s u l t s ：1 t h eb u l ko fi n d u c e dc e l li sl a r g e ra n dl a r g e ra si n d u c e dt i m eg o e sb y t h er ，c a r y o m o r p h i s ml o o k sl i k el o b u l a t e d ，r e n i f o r ma n df a b a c e o u s 2 t h er e s u i to fr t - p c rs h o w e dal i t t l ee x p r e s s i o no fc dllbm r n aa to h ，2 4 ha n d4 8 hi nn e g a t i v ec o n t r o lg r o u p h o w e v e rt h er e s u l to fr t _ p c rs h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fc d1 lbm r n aw a su p r e g u l a t e dc o m p a r i n gw i t ht h ec o n t r o lg r o u p s ( p 0 01 ) 3 w e s t e r nb l o r i n gs h o w e dt h a tt h e r ew e r en oo b v i o u se x p r e s s i o nc h a n g eo ff a sp r o t e i na n dc a s p a s e 3p r o t e i ni nd m s og r o u p sa n dn e g a t i v ec o n t r o l 5 - w e s t e mb l o w i n gs h o w e dt h a tb a n d so ff a sa n dc a s p a s e 3c h a n g e dw h e nh l - 6 0c e l ld i f f e r e n t i a t e dt on e u t r o p h i l s 1 i k ei n d u c e db yd m s o 6 w e s t e r nb l o t t i n gs h o w e dt h e r ew e r en e wb a n d so ff a so rc a s p a s e 3a f t e rd m s os t i m u l a t i o n ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l s ( p 0 01 ) c o n c l u s i o n ：1 d m s oc a ni n d u c eh l 。6 0c e l lt od i f f e r e n t i a t ea l o n gt h ew a yt o5n e u t r o p h i l s - l i k ec e l l 2 n e u t r o p h i l s - l i k es h o wt h ec e l ls h a p eo f中性粒细胞( p o l y m o r p h o n u c l e a r n e u t r o p h i l s ，p m n s ) 是固有性免疫系统中重要的效应细胞，由于它具有很强的吞噬能力所以和单核巨噬细胞一起被称为专职吞噬细胞。中性粒细胞是由骨髓造血干细胞分化产生的终末细胞，是血液中数目最多的白细胞大约占到外周血白细胞总数目的5 0 7 0 ，在血液循环中正常的生命周期为2 4 4 8 小时，成熟的中性粒细胞通过凋亡这一机制来维持自身数量和内环境的稳定i 们。中性粒细胞的终末分化的特性使它一旦分化成熟，便启动了自发性凋亡程序。而中性粒细胞也可以在激素、l p s 、g m c s f 、n 师0 【等外界因素的作用下发生凋亡的加速或延迟【7 ，8 9 1 ，适时、适度地调控其进程可以促成炎症的无损伤性收敛( r e s o l u t i o n ) i1 0 1 。当然，如果调控不当，也会使自身的炎症细胞对自身组织细胞造成损伤。随着对中性粒细胞凋亡研究的深入，人们发现，中性粒细胞还存在其它非凋亡性程序化的细胞死亡方式。g u n t e n 等报道唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素( s i a l i ca c i d b i n d i n gi m m u n o g l o b u l i n 1 i k el e c t i n s ，s i g l e c 一9 ) 可介导中性粒细胞发生既不同于凋亡也不同于坏死的死亡1 ；f u c h s 等报道中性粒细胞在炎症过程中可出现基于胞外捕捉( n e u t r o p h i le x t r a c e l l u l a rt r a p s ，n e t s ) 的死亡形式，这种死亡形式也与自发性凋亡明显不同【1 2 】；同时也有学者提出其它细胞中存在如平行性凋亡、自嗜性细胞死亡等新的细胞死亡形式 1 3 - 1 6 1 。尽管到目前为止，这些细胞死亡方式的机理均未完全阐明，但却提示我们凋亡并非中性粒细胞和其他细胞的唯一主动性死亡方式。本课题前期研究也首次发现，前列腺素e 2 受体亚型3 ( e p 3 ) 的选择性激动齐u o n o a e 2 4 8 可以诱发中性粒细胞发生非凋亡非坏死性的主动性细胞死亡，这一现象的发现引起了国际白细胞生物学界的广泛关注【1 7 1 。h l 6 0 是人早幼粒细胞白血病细胞系( h u m a nl e u k e m i a ) ，它能在体外长期培养并具有相对的遗传稳定性，如果用化学药物对其进行诱导，h l 6 0 细胞则可以表现出不同程度地向粒细胞，单核细胞分化的现象。二甲基亚砜( d i m e t h y l s u l p h o x i d e ，d m s o ) 可以诱导h l 一6 0 细胞沿粒系统方向成熟分化，这种经诱导分化而来的细胞具备吞噬能力且细胞核的形态比较特殊，多呈分叶状，其性质和形态均类似中性粒细胞，我们称之为类中性粒细胞( n e u t r o p h i l s l i k e ) 。虽然类似，然而类中性粒细胞却不具备中性粒细胞内在的生命本质特征自发凋亡( s p o n t a n e o u sa p o p t o s i s ) ，也正因此这种细胞只能被称作为类中性粒细胞。f a s 是于1 9 8 9 年由y o n e h a r a 等发现的一种单克隆抗体，它可以诱导多种人体细胞系发生凋亡。同年，t r a u t h 等也发现了一株可以诱导活化或恶性变淋巴细胞凋亡的单克隆抗体，他们将这株抗体所识别的蛋白称之为凋亡蛋白一l ( a p o - 1 ) 。基因克隆明，f a s 军 1a p o 1 是同一种蛋白。f a s 为细胞凋亡的信号分子，当表达f a s 的细胞与f a s 抗体或自然存在的f a s 的配体( f a s l ) 结合形成三聚体形式后，就可以活化并传导凋亡信号来触发f a s 靶细胞在数小时内发生凋亡【1 8 1 。也有研究表明【1 9 1 ，某些细胞在发生、发展过程中，f a s基因的表达不断加强，凋亡抑制基因b c l 2 的表达逐渐减少，最终导致细胞凋亡的发生，完成细胞代谢过程，达到细胞增生与凋亡平衡。到目前为止，已失i f a s 启动的细胞内信号需要通过蛋白酶途径。而c a s p a s e 3 通常是以无活性的前体形式存在于细胞浆中，通过蛋白水解作用由激活i 拘c a s p a s e 3 来进一步激活d n a 酶，介导细胞染色体d n a碎裂和磷脂酰丝氨酸由膜内移向膜外从而启动细胞凋亡的这一途径也被认为是细胞凋亡的主要途径。中性粒细胞对f a s 诱导的凋亡较敏感，在生理条件下中性粒细胞以自分泌和旁分泌方式表达f a s 矛l f a s l 调控细胞凋亡，保持自身数量的稳定2 们。h s i e h 等【2 1 1 用流式细胞仪检测出了正常中性粒细胞的f a s 币lf a s l 动态表达，发现体外培养时f a s 矛i f a s l 表达阳性率随时间逐渐降低，说明在中性粒细胞表面既表达f a s 也表达f a s l 。另外一些学者发现，活化型f a s 抗体i g m ( m a bc h - 1 1 ) 可以显著加速p m n 的自发性凋亡进程，而拮抗型f a s 抗体i g g l ( m a bi b 4 ) 则具有一定的凋亡抑制功能【2 2 】。还有的研究显示中性粒细胞凋亡延迟与f a s l 并i c a s p a s e 3 的表达下调有关2 3 1 。综上所述，这些研究反映- j f a s 矛i c a s p a s e 3 可均参与中性粒细胞的凋亡进程。当然，中性粒细胞在多种外界因素的作用下发生凋亡的加速或延迟，这个过程是一个受自身多基因调控、众多细胞因子参与、多条途径独立或交联而形成的复杂的调控网络，目前许多环节仍不完伞明了。我们的实验以此作为研究的靶点，用d m s o 诱导h l 6 0细胞成为类中性粒细胞，并运用w e s t e r nb l o t t i n g 技术从蛋白水平检测f a s 弄i c a s p a s e 3 在类中性粒细胞中的表达来为发现中性粒细胞白发性凋亡的原因提供新的思路。材料与方法1实验材料与仪器1 1实验标本h l 6 0 细胞购自中国科学院上海细胞库。1 2 主要实验试剂d m s o 购自s i g m a ；m a r k e r 购白f e r m e n t a s 公司：蛋白抽提试剂盒购自p i e r c e 公司；g a p d h 和t r i z o l 购自i n v i t r o g e n 公司；d e x t r a nt 5 0 0 购自g i b c o 公司：r p m i 一1 6 4 0 培养基，胎牛血清购自h y c l o n e 公司：精制胰蛋白酶购白s i g m a 公司；西班牙琼脂糖购自北京天根生物有限公司；r t - p c r 试剂盒购自t a k a r a 公司；引物均由i n v i t r o g e n 公司合成；f a s 兔多克隆抗体购自s a n t a 公司，c a s p a s e 3 兔单克隆抗体抗购自a b c a m 公司，二抗购自北京赛驰生物技术有限公司。1 3 主要试剂配制( 1 ) 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ) ，0 0 1 m o l l ：n a c l8 5 0 9 ，n a 2 h p 0 41 5 6 9 ，k h z p 0 40 2 9 ，k c10 2 9 溶于10 0 0 m l 三蒸水，i o mn a o h 溶液调p h 值至7 2 7 4 ，分装，高压灭菌，4 c 保存备用。l l( 2 ) 细胞冻存液：每次冻存细胞前配置，比例为二甲基亚砜：小牛血清：1 6 4 0 培养基= 1 ：2 ：7 ，4 。c 冰箱内保存备用。( 3 ) 0 2 5 胰酶( t r y p s i n ) 溶液：精制胰蛋白酶( r e f i n e dt r y p s i n ) 0 2 5 9和0 0 2 9 乙二胺四乙酸二钠( e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ，e d t a )溶于1 0 0 m l 事先备好的p b s 液，0 2 2 p m 滤膜过滤消毒，一2 0 * ( 2 储存备用。( 4 ) 1 * s d sb u 低r _ 甘氨酸( 电泳缓冲液) t r i s b a s es d s加水溶解，定容至1 0 0 0 m l ( 5 ) 1 * t r a n s f e rb u 脏r 甘氨酸转膜缓冲液t r i s b a s es d s甲醇加水溶解，定容至1 0 0 0 m l 3 0 2 91 8 8 91 0 92 9 95 8 90 3 7 92 0 0 m l( 6 ) 5 宰s d s p a g el o a d i n gb u f f e 卜l m i r i s - h c l ( p h 6 8 )1 2 5 m ls d sb p b甘油2 m eo 5 92 5 m g2 5 m l2 5 u l加去离字水溶解后，定容至5 m l 使用前稀释至3 * l o a d i n gb u f f e r 1 21 4 主要实验仪器h f s a f e 1 2 0 0 型超净工作台( 中国力申科学仪器有限公司)p c r 扩增仪( e p p e n d o r f 公司) ；倒置相差显微镜( 重庆光学仪器厂) ；微型凝胶电泳仪( 日本m u p i d 一2 公司) ；h e p a c l a s s l 0 0 型c 0 2 培养箱( t h e r m o 公司) ；g 8 0 f 2 3 y c n 2 l c 3 型微波炉( 中国格兰仕公司)半干式电转移槽及电泳仪( b i o t a d 公司) ；w f h 1 0 l 型凝胶成像系统( 上海精科实业有限公司) ；l d x z 一5 0 f b 型压力蒸汽灭菌器( 中国上海申安医疗器械厂) ；8 5 7 1 型超低温冰箱( 美国f o r m a 公司)m a x i m a s c 型超纯水仪( 英国e e g ad e m o n 公司)h w s 2 0 型恒温水浴箱( 太仓实验设备厂)d h g 9 1 4 0 a 型恒温鼓风干燥箱( 上海一恒科技有限公司)5 4 1 7 r 型高速低温微量离心机( e p p e n d o r f 公司)l x j i i b 型高速台式离心机( a n k e 公司)2 实验方法2 1h l 一6 0 细胞的培养及处理2 1 1h l 一6 0 细胞培养h l 6 0 细胞购自中国科学院上海细胞库，按其公司操作说明培养细胞。培养液为r p m i 1 6 4 0 ( 含1 0 f c s ，1 0m m o l lh e p e s ，0 2m m o l l 谷氨酰胺，2 5u m l 青霉素，2 5g m e 链霉素) ，于饱和湿度、5 c 0 2 、3 7 。c 的培养箱培养2 3 天。隔天补充适量的新鲜培养基。待细胞长到8 0 9 0 满后，即细胞连成片，可进行传代。2 1 2 d m s o 处理研究实验用台盼蓝拒染试验、怀特姬姆萨混和染色法鉴定活性与纯度达均达到9 6 以上方可进行后续试验；调整细胞数为2 1 0 6 m l ，加样于2 4 孔培养板中( 分别为1m l 孑1 ，混匀) ，设d m s o 组( 终浓度1 ，v v ) 对其进行刺激和诱导，然后分别于2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、6 d收集细胞；以未加d m s o 处理正常培养的h l 6 0 细胞作为空白对照组；所以，细胞分组即为d m s 0 处理组：o h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、6 d ，空白对照组：o h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、6 d 。2 2r t - p c r 检测c d l l b 的表达2 2 1 总r n a 的提取( 1 ) 在预定时间收获分别收获每组细胞各l 1 0 6 个，1 ，5 0 0r p m 5m i n 离心，待弃去上清后分别在各实验组中加入1m l r z 裂解细胞，并用加样枪反复吹打数次以使r z 充分接触细胞，静置待r z 液体变浑浊后再转移至1 5 m l e p 管中备用；( 2 ) 室温下将按照预先设定的各实验分组细胞放置3 5 分钟以达到核算蛋白复合体完全分离的效果( 3 ) 在装有各实验分组细胞的e p 管中加入2 0 0 “l 氯仿，保证管盖充分盖紧的情况下剧烈振荡e p 管1 5s ，之后在室温放置3m i n ；( 4 ) 将各实验分组的e p 管4 。c1 2 ，0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，之后各组样品的e p 管中会分成无色水相层、白色中间层和黄色有机层的上中下3 层( r n a 在水相层) ，吸取水相层5 0 0 1 t l 并转入新的e p 管中；( 5 ) 在各组e p 管内缓慢加入2 5 0 9 l 无水乙醇并混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中，4 c1 2 ，0 0 0r p m 离心3 0 s ，之后弃去各组收集管中的废液；( 6 ) 向吸附柱中加入5 0 0u l 去蛋白液，4 1 2 ，0 0 0r p m 离心3 0s ，之后弃去各组收集管中的废液；( 7 ) 向吸附柱中加入7 0 0 “l 漂洗液，室温条件下静置2m i n 后再4 = c1 2 ，0 0 0r p m 离心3 0s ，弃去各组收集管中的废液；( 8 ) 向吸附柱中加入5 0 0l a l 漂洗液，室温条件下静置2m i n ，4 c1 2 ，0 0 0r p m 离心3 0s ，之后去除各组收集管中的残余液体；( 9 ) 将吸附柱放入2m l 收集管中，4 c1 2 ，0 0 0r p m 离心2m i n ，去除各组收集管中的残余液体，之后再将离心后的吸附柱静置在超净工作台上以充分晾干；( 1 0 ) 将各组吸附柱均转入一个新的离心管中，加入5 0 山r n a s e f r e ed d h 2 0 ，室温条件下放置2 m i n 后再4 1 2 ，0 0 0r p m 离心2r a i n 。( 1 2 ) 弃去离心柱就得到了各组样品的总r n a( 1 3 ) 取2 “lr n a 溶液，以去离子水为空白对照，在紫外凝胶成像分析仪上测定2 6 0n n l 和2 8 0n m 的吸光度值，进行r n a 含量测定和o d 2 6 0 o d 2 8 0 的比值分析，所提取的r n a 各组样品的o d 2 6 0 o d 2 8 0 的比值应在1 8 2 0 之间。之后再用琼脂糖凝胶以检测r n a 有无降解和降解污染及其完整性，如若立即反转录，其操作步骤则参照试剂盒说明书来进行。2 3 2 获得c d n a以从各组细胞中提取的总r n a 为模板，在p c r 仪上进行反转录。反应体系：r e a g e n tw o l u m e ( b t l )l o 木m u l vb u 能rm u l vr t a s e ( n e b )r n a s ei n h i b i t o rd n t p ( 1 0 m m )o l i g o ( d t )t o t a lr n ad h 2 0 ( r n a s ef l e e )t o t a l2 5o 5o 512l53 52 5 u l反应条件：4 2o c6 0 m i n ，9 5o c5 m i n 。扩增获得的c d n a 置于2 0o c 保存。2 3 3 引物的设计以上述c d n a 为模板，分别扩增c d ll b 及g a p d h 内参片段。c d ll b和g a p d h 的引物均来源于n c b i 数据库，运用p r i m e r5 0 软件二级结构评分参数检查引物是否符合条件。c d ll b 和g a p d h 引物序列分别如下：c d1 1b f 5 g g c c t c a g a g a a t a c c a g t 一3 c d1 1b r ：5 g g g t g a a c a c g g a a t c g t t 3 ( p r o d u c t l e n g t h = 416 b p ，g c = 5 6 ，t a = 5 4 )g a p d h 4 5 2 f 5 a c c a c a g t c c a t g c c a t c a c 3 g a p d h 4 52 r ：5 t c c a c c a c c c t g t t g c t g t a 3 ( p r o d u c t l e n g t h = 4 5 2 b p ，t a = 5 8 )2 3 4r n a 琼脂糖凝胶电泳及图像分析将电泳缓冲液灌注电泳槽，注入1 0 m g m l 溴化乙锭的1 5 琼脂1 6糖，插上样品梳待其冷凝后再将其拔出。将制好的胶置入电泳槽内对应位置，取5p l p c r 产物样品和1p l 电泳上样缓冲液混匀后在各凝胶孔中点样。接通电源，启动电泳仪，以1 0 0m v 恒压电泳3 0m i n 。之后在紫外凝胶成像仪上观察琼脂糖凝胶，并用凝胶图像成像系统照相。使用凝胶定量软件q u a n t i t y - o n e 分析系统进行扫描定量分析r t - p c r 扩增产物电泳条带的吸光度值。2 3 6 统计学处理所有数据均经过s p s s17 0f o rw i n d o w s 软件进行统计分析。实验的结果都取白一次代表性实验且被5 次独立实验证实。计量资料以x土s 来表示，两组均数比较使用t 检验，多个均数的比较使用方差分析，p o 0 1 为有统计学意义。2 4 蛋白印迹实验检测蛋白f a s 和c a s p a s e 3 的表达差异2 4 1 抽提类中性粒细胞总蛋白转染特异性s h r n a 质粒载体后4 8 d 时后经0 2 胰酶处理各实验组及对照组的细胞，将收获的各组细胞上离心机1 2 ，0 0 0r p m 离心5分钟，之后再将收集的细胞用备好的p b s 漂洗，用无菌吸管吸净p b s缓冲液，把事先预冷过的蛋白质抽提缓冲液加入其中，随后拿去冰上裂解3 0m i n ，调整离心机在4 下1 2 ，0 0 0r p m 离心1 5m i n 以去除细胞碎片，吸取上清液即为细胞总蛋白质。用蛋白定量试剂盒测定各实验组中的蛋白含量，2 0 c 保存或进一步分析。2 4 2s d s p a g e 电泳( 1 ) 准备玻璃板，依次用水，i o s d s ，双蒸水冲洗，干燥。( 2 ) 确定凝胶浓度体积，按如下配方配制分离胶溶液。分离胶配方( 5 0m l )去离子水1 6 3 4m l1 5m o l l t r i s c l s d s ( p h8 8 )1 3 1 7m l3 0 凝胶储液2m l1 0 a p2 5g lt e m e d5 “l( 3 ) 在玻璃板间隙注入分离胶，并控制分离胶注入的量来为积层胶留有足够空间。为阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用还需要在项层加入1 5m l 无水乙醇。( 4 ) 凝胶聚合完成后将覆盖物丢弃，并用去离子水洗胶数次，之后用滤纸把凝胶顶端的残存的液体吸干。( 5 ) 按照去离子水1 7 5m l 、3 0 凝胶储液0 4 1 3m l 、1 5m o l lt r i s c l s d s0 3 3 8m l 、1 0 a p1 2 5 此、t e m e d2 5u l 的配方配制2 5m l 积层胶，并注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。( 6 ) 在积层胶聚合的同时，将样品2 0 此蛋白提取液与样品缓冲液6 x s d s4g l 混合，1 0 0 加热3m i n 。( 7 ) 积层胶完成后，用去离子水冲洗梳孔，将凝胶放入电泳槽上上下槽均加入lx s d s 电极缓冲液，检查是否泄漏。驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡，上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。( 8 ) 按次序上样，一定安排已知分子量的标准物。最好将l x 电极缓冲液加入未使用的梳子孔。( 9 ) 电泳。开始时电压为8v c m 凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到1 5v c m 凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。2 4 3 免疫印迹及显影( 1 ) 转膜：按照转移胶的尺寸裁剪硝酸纤维素膜和6 块相同大小的滤纸。待电泳完成后将胶放入电转缓冲液中平衡2 0m i n ，同时把准备好的滤纸和n c 膜用电转缓冲液中进行预湿。在转膜仪的不锈钢板上铺3 层滤纸并用尺子赶走滤纸下的气泡，接着铺n c膜和s d s p a g e 胶，最后再铺上3 层滤纸并将安全盖盖好，恒压1 4 伏条件下进行电转移并设定温度4 摄氏度冰箱内过夜之后把蛋白质转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面。( 2 ) 用含有1 0 脱脂奶粉的t b s 缓冲液把转印好的硝酸纤维素膜封闭6 0 分钟。( 3 ) 膜浸没分别加入用封闭剂l ：5 0 0 稀释的兔抗人f a s 多克隆抗体( 一抗) 和兔抗人c a s p a s e 3 单克隆抗体( 一抗) 的封闭剂中，之后将其放上脱色摇床中摇l 小时来使稀释的抗体与硝酸纤维素膜充分结合。( 4 ) t b s 缓冲液洗膜l o 分钟，每个实验组4 重复次。( 5 ) 将辣根过氧化物酶标记的小鼠抗兔i g g ( 1 ：10 0 0 ) 作为第二抗加入封闭剂，使膜浸没其中于脱色摇床中摇1h 。( 6 ) 再用t b s 缓冲液沈膜1 0 分钟，每个实验组重复4 次。( 7 ) 在暗室内新鲜配置化学发光底物反应液，将其均匀滴到p v d f膜上，使之作用5 分钟之后，操作x 光片压片、曝光、显影、定影。2 4 4 化学发光及条带分析暗室内把p v d f 膜置于新鲜配置的化学发光底物反应液中反应5分钟后将其取出并用滤纸吸去膜上多余的液体，再放入洁净的小塑料袋中；接着放入荧光化学发光图像分析仪中进行曝光，调整曝光时间为3 0 秒、1 分钟、5 分钟、1 0 分钟。使用q u a n t i t y o n e 分析系统检测蛋白条带的平均密度值，将所得的各组条带与内参条带的灰度比值作为参考的依据来分析目的蛋白相对表达量。实验中应保证所有条带的密度值均在相同条件下检测完成。2 4 5 统计学处理所有数据均经过s p s s l 7 0f o rw i n d o w s 软件进行统计分析。实验的结果都取自一次代表性实验且被3 次独立实验证实。计量资料以x4 - s 来表示，两组均数比较使用t 检验，多个均数的比较使用方差分析，尸 o 0 5 为有统计学意义。实验流程图( e x p e r i m e n t a lp r o t o c 0 1 )o台盼兰拒染试验及怀特姬姆萨混合染色法鉴定类中性粒细胞活力与纯度k 莲：ij 暑二o + 鬈d 萼麓】l 参黪：篓2 琼脂糖电泳检测r n a 完整性收集各组细胞，置于e p 管中，加入l m lt r i z o l ，按照常规方法提取总r n a 。将提取获得的r n a 进行1 5 琼脂糖凝胶电泳，结果如2 l下。琼脂糖凝胶电泳结果可见到2 8s 和1 8s 亚基清晰显示，2 8s 与1 8s 的带宽比在1 8 2 0 之间，说明r n a 完整性良好，满足后续实验要求。( 图3 )l23456789图2 各组细胞总r n a 琼脂糖凝胶电泳图谱泳道1 ：空白细胞组- o h 泳道；2 ：空白细胞组2 4 h ；泳道3 ：空白细胞组4 8 h ；泳道4 ：空白细胞组一7 2 h ；泳道5 ：空白细胞组6 d ；泳道6 ：d m s o 处理组2 4 h ；泳道7 ：d m s o处理组4 8 h ；泳道8 ：d m s o 处理组一7 2 h ；泳道9 - d m s o 处理组6 df l g 2a g a r o 鼬g e le l e c t r o p h o r e s i so fr n af r a g m e n tn o t e ：1 m e d i u ma l o n e - o h ；2 m e d i u ma l o n e - 2 4 h ；3 m e d i u ma l o n e - 4 8 h ；4 m e d i u ma l o n e 7 2 h ；5 m e d i u ma l o n e6 d ；6 d m s o i n d u e e d - 2 4 h ；7 d m s oi n d u c e d - 4 8 h ；8 d m s oi n d u c e d - 7 2 h ；9 d m s oi n d u c e d 6 d3r t - p c r 检测c d i l b 基因表达按上述实验方法中的步骤获得c d n a ；以c d n a 为模板，分别扩增c d l l b 及g a p d h 内参片段；将p c r 产物进行1 琼脂糖凝胶电泳，结果显示：同空白组相比，d m s o 处理后2 4 h 开始，即有c d l l b 的表达上升，且随着时间延长，c d ll b 的表达量也逐步升高( p o 0 1 ) 。提示在d m s o 的处理下，h l 6 0 细胞已成功分化成为类中性粒细胞。用p h o r e t i x1 d 软件读取各条带灰度值：( 注：各实验分组分别运用s p s s 软件进行统计分析，结果尸值均为0 0 0 0 ) 。( 图3 )泳道空白处理图3r t - p c r 检测c d l l b 的表达及c d l l b g a p d h 灰度值f i g 3c d l l bm r n ae x a m i n e db yr t - p c r ( a ) a n dr e l a t i v ed e n s i t yo fc d l1bt og a p d hb a n d s ( b )n o t e ：1 m e d i u ma l o n e - 0 h ；2 m e d i u ma l o n e - 2 4 h ；3 m e d i u ma l o n e _ 4 8 址4 m e d i u ma l o n e - 7 2 h ；5 m e d i u ma l o n e6 d ；6 d m s oi n d u c e d - 2 4 h ；7 d m s oi n d u c e d - 4 8 h ；8 d m s oi n d u c e d - 7 2 h ；9 d m s oi n d u c e d - 6 dp o o lc o m p a r e dw i mt h ec o n s o l s表1c d l l b g a p d h 灰度值比较t a h i e1 c o m p a r ew i t ht h er e l a t i v ed e n s i t yo fc d l lbt og a p d hb a n d sl23456789n ，5