（植物病理学专业论文）滇重楼内生真菌及其甾体化合物的初步研究.pdf

中国农业大学硕士举位论文中文攮簧 中文摘要 滇重楼属于延龄草科( t r i l l i a c e a e ) 重楼属多年生草本植物，主要分布予我国云南、四川、爨 州等地。滇重楼魁一种重要的药用植物，主要以其干燥根状攀入药，根状蕉中含有的活性成分为 c 2 7 整体4 霉+ 絮的蘩蓣皂营元朝偏诺皂蛰元及其配耱体。植物态生蓥( e n d o p h y t e ) 怒撂那些在英 生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织硪器官内部的真菌或细菌，宿主不袭现出外程 病害症状。本论文对滇重楼( p a r 妇p o l y p h y l l av a t y u n n a n e n s 船( f r a n e h ) h a n d ) 内生真黼的分离和 鉴定、潼体纯会貔蓉蓣皂营元e l i s a 梭测条纷的摸索、内生囊蘩孛警髂豫合辏分辑、肉生囊嚣鬟 取物的抗菌活性进行初步研究，得出以下结果。 1 、本研究首次对滇重楼根状摹内擞真菌分离的方法进行探讨，对根状茎的表面消毒时间、 分褰邦位彝培莽綦约选择遴纷摸索，获褥较尧理想瑟分离效莱。莛分离弱肉生寞蔫1 3 3 撩，撮攒 其形态特征，取2 8 株代表性的真菌，缀鉴定隶属于1 0 个属，分别为酵母属( c a n d l d a ) ( n o 1 ) 、 腐霉属( p y t h i u m ) ( n o 7 ) 、艇核菌属( r h i z o c t o n i a ) ( n o 9 ) 、本霉属( t r i c h o d e r m a ) ( n o 3 6 ) 和 景援拣瘫 羲( c y l i n d r o c t a d i t o n ) ( n o ，1 0 8 ) 各1 拣，诲霉震( p e n i e i l l i u m ) ( n o 。1 5 和n o 6 5 ) 2 椿， 头孢繇属( c e p h a l o s p o r i u m ) ( n o 4 6 、n o + 7 3 和n o 8 4 ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) ( n o 4 7 、n o 5 5 和 n o 6 1 ) 和拟青霉属( p a e c i l o m y c e s ) ( n o 6 0 、n o 8 0 和n o 引) 各3 株，镰孢菌属( f u s a r i u m ) ( n o 1 4 、 n o ，2 4 、n o 。3 2 、n o 。3 8 和n o 6 2 ) 5 撩。 2 、当采用e l i s a 检测时，包被物的稀释倍数为1 ：5 0 ，= 抗的稀释倍数为l ：4 0 0 ，当薯蓣辖 苷元浓度在2 4 4 1 0 6 m g m l - 6 2 5 x 1 0 4 m g m l 范围内，浓度自然对数与吸光值之同存在较好的线 性美系。特吴瞧稔测显示，鬻蓣皂营元抗体相对予耪甾醇、昏镰警酵、麦角甾醇静特辩性较好。 3 、l i e b e r m a n n b u t - c h a r d 显色检测2 5 、3 8 、4 6 、7 3 、1 2 5 号菌株的菌熊悬浮液甾体化合物产 率较勰；e l i s a 梭测9 、2 5 、3 8 、4 6 、1 2 5 号菌株的菌丝悬浮液中薯蓣皂蛰元及其髓生物的含鬣 较赢；t l c 裣溯袭锈：8 0 、8 l 、8 4 、1 1 3 号菡株菌熊正丁醇挺取物中可能材馨蓣亳替元；4 7 、7 9 、 8 0 、8 1 、1 0 8 、l1 3 、1 3 0 号荫株的菌丝提取物中可熊有麦角甾黼；1 4 、6 5 、1 3 0 号菌株的菌液提 取物中可自e 有麦熊鲻酵。此铃，7 、3 2 、勰、5 5 、8 4 、t 2 5 菌株的滤渡正丁酵提取物，9 、1 5 、3 2 、 3 6 、3 8 、4 6 、6 1 、6 2 、7 3 、8 4 、1 1 9 、1 2 5 菌株的菠熊正丁醇携取物串可糍还含有其他掰体类纯含 物。 4 、2 s 株内生囊蘸正了蓦錾攫取物抗壤涟性检测教明，在萤激难丁酵提取物孛，2 4 母蘧橡窝s s 号菌撩正丁醇提取物的抑蕾活性较强；在藩丝正丁簿提取物中，9 号菌株和1 3 0 号菌株正丁醇掇 取物的抑菌活性较强。 本辑究垮为继续分离溪璧楼内生囊壤、了解蠹生囊蓥中躲瓣俸讫台貔糖类，鞋及撬蘩活鳇成 分奠定基础，同时也为阐明藏楼内生真黼与宿主在次生代谢方耐的协同进化规律提供依据。 关键谶：滇重楼；内生真菌；掰体化台物；薯蓣皂蛰元；l i e b e n n a n n b u r c h a r d 反应；酶联免疫吸 辩测宠( e l i s a ) 薄瑟层擀( t l c ) a b s t r a c t p a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s 蠡( f r a n c h ) h a n d ( t r i t l i a c e a e ) ，a p e r e n n i a lh e r b m o s t l yd i s t r i b u t i n g i np r o v i n c e so fy u n n a n , s i c h u a na n dg u i z h o uo fc h i n a , h a sb e e nu s e da sa ni m p o r t a n ta n dt r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n a lp l a n tf o ri t sr h i z o m e sc o n t a i n i n gs t e r o i d sw i t hac * 2 7s k e l e t o n ，w h i c hm a i n l yc o n s i s t o fd i o s g e n i n ，p e n n o g e n i na n dt h e i rg l y c o s i d e s e n d o p h y t ew a sd e f i n e da sa no r g a n i s m sw h i c hi n h a b i t p l a n to r g a n s ，a n dc a l lc o l o n i z ei n t e r n a lp l a n tt i s s u e sw i t h o u tc a u s i n ga p p a r e n td i s e a s et ot h e i rh 。s | s8 | s o m et i m ei nt h e i rl i f ec y c l e s i nt h i st h e s i s ，e n d o p h y t i cf u n g iw e r es e p a r a t e df r o mt h er h i z o m e so fp p o l y p h y l l av a ly u n n a n e n s 括，t h ec o n d i t i o n st oa n a l y z ed i o s g e n i nb ye n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ( e l i s a ) h a v eb e e nd e t e c t e d ，s t e r o i d a lc o m p o n e n t so ft h ee n d o p h y t i cf u n g iw e r ea n a l y z e d ，a n d a n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so f t h ee x t r a c t sw a r es c r e e n e d 1 s e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fe n d o p h y t i cf u n g is u c ha sp e r i o do fr h i z o m es u r f a c es t e r i l i z a t i o n p a r t s e p a r a t e d ，a n dm e d i at y p ew e r es t u d i e di nd e t a i l ，a b o u t1 3 3f u n g a l i s o l a t e sw e r es e p a r a t e d o f t h e m ，2 8 f u n g a li s o l a t e s ，w h i c hw e r er e p r e s e n t a t i v e , w e l t ts e l e c t e dt ob ei d e n t i f i e da c c o r d i n gt ot h e i r m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r so fm y c e l i a 、c o n i d i o p h o r ea n de o n i d i a t e ng e n e r ah a v eb e e ni d e n t i f i e da s c a n d i d a ( i s o l a t en o 1 ) ，p y t h i u m ( i s o l a t en o 7 xr h z o c t o n i a ( i s o l a t en o 9 ) ，t r i c h o d e r m a ( i s o l a t en o 3 6 xc y l i n d r o c l a d i u m ( i s o l a t en o 1 0 s ) ，p e n i c i l l i u m ( i s o l a t e sn o 1 5a n dn o 6 5 ) ，c e p h a l o s p o r i l o n ( i s o l a t e sn o 。4 6 。n o 。7 3a n dn o 。8 镀a s p e r g i t l u s ( i s o l a t e sn o 。4 7 ，n o 5 5a n dn o 。6 0 ，p a e e i t o m y c e s ( i s o l a t e s n o 6 0 ，n o 8 0 ，a n d n o 。8 1 ) ，a n d f u s a r i u m ( i s o l a t e s n o 1 4 ，n o 2 4 ，n o 3 2 , n o 3 8 a n d n o 6 2 ) 2 c o n d i t i o n so f d i o s g e n i na n a l y s i sb ye l i s aw e r ed e t e c t e d a na p p r o p r i a t ed i l u t i o np r o p o r t i o no f t h ec o a t i n gs u b s t a n c ew a s1 ：5 0 , a n dt h a to f g o a ta n t i - r a b b i ti g g h p rw a st ：4 0 0 。c o n c e n t r a t i o nr a n g eo f d i o s g e n i ni nt h es o l u t i o nw a sv a l i df r o m2 4 4 x 1 0 6 m g m lt o6 2 5 x 1 0 - 4 m g m l 。a n t i b o d yo fd i o s g e n i n s h o w e dab e f l e rs p e c i a l i t yt os t e r o i d ss u c ha sc h o l e s t e r o l ，1 3 - s i t o s t e r o l ，a n de r g o s t e r 0 1 3 一f u n g a li s o l a t e sn o 2 5 ，n o 3 8 ，n o 4 6 ，n o 7 3a n dn o 1 2 5w e r ef o u n dt op r o d u c em o r es t e r o i d s 珏 w i t ht h e i rh i g h e ry i e l di ns u s p e n s i o nc u l t u r eb yc o m p a r i n gt oo t h e ri s o l a t e su s i n gl i e b e r m a n n b u r c h a r d v i s u a l i z a t i o n f u n g a li s o l a t e sn o 9 ，n o 2 5 ，n o 3 8 ，n o 4 6a n dn o 1 2 5w e r ef o u n dt oh a v ed i o s g a n i na n d i t sd e r i v a t i v e sw i t hr e l a t i v e l yh i g hc o n t e n tb ye l i s aa n a l y s i s t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h ys h o w e dt h a t f u n g a ti s o l a t e sn o 8 0 ，n o ，8 1 ，n o 。8 4 ，n o 11 3w e r ed e t e c t e dt op o s s i b l yh a v ed i o s g e n i ni nn - b u t a n o l e x t r a c t so f t h e i rs u s p e n s i o nc u l t u r e s ，a n df u n g a li s o l a t e sn o 4 7 ，n o 7 9 n o 8 0 ，n o 8 1 ，n o 1 0 8 ，n o 1 1 3 a n dn o 1 3 0w e r ed e t e c t e dt op o s s i b l yh a v ee r g o s t e r o li nt h e i re x t r a c t so fm y c e l i a ，a n df u n g a li s o l a t e s n o 1 4 ，n o 6 5 ，a n dn o 1 3 0w e r ed e t e c t e dt op o s s i b l yh a v ee r g o s t e r o li nt h e i re x t r a t so ff i l t r a t e o t h e r w i s e , o t h e rs t e r o i d sw o r ea l s od e t e c t e di nn - b u t a n o le x t r a c t so f t h ef i l t r a t e so f f u n g a li s o l a t e sn o 。7 n o 3 2 ，n o 3 6 ，n o 5 5 ，n o 8 4 ，n o 1 2 5 ，a sw e l la si nn - b u t a n o le x t r a c t so f t h em y c e l i ao f f u n g a li s o l a t e s n o 9 n o 1 5 ，n o 3 2 ，n o 3 6 , n o 3 8 ，n o 4 6 ，n o 6 1 ，n o ，6 2 ，n o 7 3 ，n o 8 4 ，n o 1 1 9a n dn o 1 2 5 4 ，a l l2 8r e p r e s e n t i v ei s o l a t e sw e 揩s c r e e n e df u rt h e i ra n t i m i c r o b i a la c t i v i t y o ft h e m 。i s o l a t e s n o 2 4a n dn o 5 5s h o w e ds t r o n g e ra n t i m i c r o b i a la c t i v i t yi nt h e i rf i l t r a t e s ，i s o l a t e sn o 9a n dn o 1 3 0 s h o w e ds t r o n g e ra n t i m i e r o b i a la e t i v i t yi nt h e i rm y c e l i a ln - b u t a n o le x t r a c t st h a no t h e ro n e s t h i st h e s i sw o u l db e n e f i tf u rf u t u r es e p a r a t i o no ft h ee n d o p h y t i ef u n g if r o mpp o l y p h y l l av a r y u n n a n e n s i sr h i z o m e s ，f o rs t e r o i dc o m p o u n ds t u d yo f t h ee n d o p h y t i ef u n g i ，f o ra n t i m i e r o b i a lc o m p o u n d s t u d y , a sw e l l 黼f o rc o e v o l u t i o ns t u d yo ft h ee n d o p h y t i ef u n g iw i t ht h e i rh o s tpp o l y p h y l t av a r , y u n h a n e t t $ l $ i 皤w o r d s ：p a r sp o l y p h y l l a v a t y t m n a n e n s 括；e n d o p h y t i ef u n g u s ；s t e r o i d s ；d i o s g e n i n ； l i e b e r m a n n 。b u r c h a r d r e a c t i o n ；e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ；t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) i l l 图索引 图1 - 1 重楼植物的形态示意圈“2 2 图i - 2 薯蓣皂营元和偏诺皂替元结构2 3 圈2 1 滇重搂摄敬茎2 7 图2 2 篇1 号菌株形态特征，3 5 图2 - 3 第7 号菌株形态特征3 5 图2 - 4 筹9 号萤檬形态特征3 5 图2 - 5 第1 4 号蘸椿形态特援3 6 图2 - 6 第1 5 号菌株形态特征3 6 图2 7 第2 4 号藏橼形态特链3 6 蚕2 - 8 第2 5 号裁椿形态特链一3 6 图2 - 9 第3 2 号菌株形态特征3 7 图2 1 0 第3 6 号荫株形态特锻，3 7 罄2 1 l 第3 8 号蘩糖形态耱援。3 7 图2 1 2 第4 6 号黼株形态特征3 7 图2 1 3 第4 7 号菌株形态特征3 8 圈2 1 4 第5 2 号藏拣形蠢特 霆一3 8 图2 1 5 第5 5 号蔚株形态特征3 8 图2 。1 6 第6 0 号菌株形态特征3 8 图2 一1 7 繁6 l 号麓株形态特缀3 9 图2 - 1 8 第6 2 号蓊株形态特糍3 9 图2 1 9 第6 5 号菌株形态特徽3 9 臻2 瓣第8 4 号蘩糖影态转臻的 躅2 2 5 第1 0 8 号菌株形态特征4 l 图2 - 2 6 第11 3 号菌株形态特征4 1 强2 - 2 7 第l1 9 号蘩椿形态持经4 l 图2 - 2 8 第1 2 5 母菌株形态特征4 l 图2 - 2 9 筇1 3 0 号菌株形态特征4 2 图3 - le l i s a 检测藩蓣逛萤竞豹骧理和步骤4 4 稠3 - 2e l i s a 测定藉蓣皂萤嚣的浓度范圈4 9 图4 - 1 辫蓣皂昔元l i e b e r m a n n b u r c h a r d 龆色反应标准曲线5 5 图4 - 2 内生寞菌滤波正t 醇提取物薄层层橱图谱5 9 圈4 - 3 蠹玺囊蓉蔼丝正丁醇攥墩扬薄瑶趱析图谱5 9 图5 - 1 部分内生真菌菌液正丁群提取物对枯草芽孢杆菌抑菌活性6 6 图5 - 2 内生真菌馥熊正丁醇提取物对溶血葡萄球菌抑黼活性6 8 v i i 婵稻舳 征徽；薹徽 特蒋特特态态态态 形澎形形株掾株棣藏藩菌蔚号每号号 竹弦跚叭 第第第第 0 l 2 3 o t 心o 2 2 2 2 图鹫困图 表索萼l 表t - 1 植物 勾生真菌产生的生物碱类活性物质5 表l 蠹生囊蔻产生静菇娄滔经魏震8 表1 - 3 内生真菌产生的甾体裟活性物质1 0 表1 - 4 内生真菌产生的其它燮活性物质1 1 表1 - 5 我国己遗季子蠹生赛蓉毳鞲究静楂耢耱类 7 表2 - 1 马铃薯蔗糖琼脂培养基配方2 8 表2 - 21 0 组织煎汁马铃薯蔗糖琼脂培养艇成分2 8 表2 0 查镀培莽熬成分一，+ 2 8 表2 - 4 马丁氏培养基成分2 9 表2 - 5 玉米粉琼臌培养基成分。2 9 表2 - 6 承璩嚣薅养基成分2 9 表2 7 滇重楼根状茎表面消礴处理31 表2 - 8 滇重楼根状茎韧皮部和本质部分离的内生真菌一3 2 表2 - 9 誉闻培葬蒸分离滇重褛出生真菌静筹异，3 2 表2 - 1 0 内生真菌形态描述及初步鉴定3 3 表3 - 1 薯蓣皂营元平醇溶液的配制方法4 7 表3 - 2 包被物和二抗工作浓度的对应关系4 8 表3 - 3 甲醇对e l i s a 测定的影响4 8 表3 - 4 薯蓣皂营元及其类戗耪交叉反应攀5 0 表3 。5e l i s a 检测藉蓣皂苷元的灵敏性5 0 表4 - 1 滇重楼内生真菌正丁酵提取物产率5 4 表4 0 演重搂走生襄萤中甾体纯台物含蛩5 5 表4 - 3 酶联免疫法检测薯蓣皂箭元及其衍生物含量5 7 表5 - l 用丁抗菌活性测定的微生物6 2 表5 - 2l b 培养基酝方5 2 表5 - 32 8 株肉生黧莆提取物煎最6 4 表5 4 菌液正丁醇提取物抑菌活性6 5 表5 - 5 蘩丝正丁醛摄取耱蘩蒴活性，6 7 v i i i b s a c b c f u c m a d m s o e l i s a e t o h h t p s a l c i o m b m i c o p d 0 v a p b s p d a p s a r f t l c w a u v a b b r e v i a t i o n b o v i n es e r u ma l b u m i n c o a t i n gb u f f e r c o l o n yf o r m i n gu n i i c e m i m e t e r c o m - m e a la g a r d i m e t h y ls u l f o x l d e e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ； e t h a n o l h o s tt i s s u e p o t a t o s u c r o s ea g a r 5 0 i n h i b i t o r yc o n c e n n a 6 0 n m a n 讧b u 丘旨 m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n m i l l i m e t e r 口- p h e n y l e l l e d i a m i n e o v a l b u r a i n p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o t a t o - d e x t r o s ea g a r p o t a t o - s u c r o s ea g a r r a t eo f f l o w t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y w a t e ra g a r u i 时a v i o l e t 牛血清白蛋白 包被缓冲液 菌落形成单位 厘米 玉米粉琼脂培养基 一甲基弧砜 酶联免疫吸附测定 乙醇 组织煎汁马铃薯蔗糖琼脂培养基 半抑制浓度 基质缓冲液 最低抑制浓度 毫米 邻苯_ 二胺 卵清蛋白 磷酸缓冲盐溶液 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 马铃蔗糖琼脂培养基 比移值 薄层层析 水琼脂培养基 紫外 独创性声明 本人声明所呈交的论文悬我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 袋。尽我所知，除了文中穗羽翱班标注和致谢的壹| 囊方井，论文中不惫含箕佳人已经发 袭或撰写避的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 箍健矮遥翡謇孝耨。与我一露工佟靛霜恚辩零磷究瘊傲酶 王德舞献筠已在论文孛佟了弱 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：案觋冬 时润：叠彬年z 月g e t 关于论文使用授权的说明 本人完全了勰中国农业大学有关保爨、使用学位论文豹规定，即：学校有权保留 邀交论文的复印件茅h 磁盘，允许论文被森阅和借阅，可以采朔影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编攀位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不阔媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密斡学位论文在瓣密嚣应遵守此携议) 研究生签名：霄观冬时间：幽彬萨，月1 g e ：l 嚣舞签名： 丽渺7 辩麓：御苦年f 冀日 中孱农业犬学硕士学位论文 第l 章翦言 1 1 植物瞧生真菌 1 1 1 植物内生藏 第1 章前言 早在1 0 0 多年前人们就已发现在健康植物组织的内部也脊微生物存在，但由于这些微生物生 活在没有终在感染症状的德瘫接物缀绞内部，其存在嚣l 作用& 麓娃来一囊必太嚣l 黪忽援。“内艇 菌( e n d o p h y t e ) ”一词的最早含义是捂内生植物，后来被研究糟用来特指采本科牧草中那些属予 麦角蒲科( c l a v i c i p i t a c e a e ) 的不引起病症、系统发生、种子携带的内生真菌，以与植物病原真菌 静类翱嚣别( 邹文默等，2 0 0 1 ) 。因戴，逡生蘩定义中一度强调其不；l 粒密主塞琨癌获瓣特点， 同时叉与互惠共生( m u t u a l i s m ) 的菌搬真菌( m y c o r r h i z a lf u n g i ) 相区别。 对于内生菌的概念，学术界仍有缀多争论和分歧( s t o n ee ta l ，2 0 0 0 ) 。随着磷究的扩震，瞻 生蔼概念静发震裔秘个明显静取囱，帮注重予内生蔼生物本身特定静生淼残生理作埘的研究者， 如植物病理学家通常强调宿主专一性及生态适应性方面的特征；而侧重内生菌生态学、生物多样 性以及群落分板的研究者透露糨放地把生活于宿主缀织内的全酆擞生物都称戈肉生藤，其中包撬 植穗病理学家掰熬悉的潜伏的( l a t e n t ) 、静患的( q u i e s c e n t ) 域条件致病( c o n d i t i o n a lp a t h o g e n i c ) 的一蟪瘸原菌。从生物资源利用的角度，目前常用较宽泛而叉寰用的概念，即植物内生菌是指那 些在蕊生活史的一定除段或全部阶段生海予壤康獯物的各穆缀织霉鞋器害态耨靛宾莛竣纲莲，被感 染的宿主植物( 楚少是暂时) 不表现出外在症状，研通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组 织中分离或从组织中直接扩增出微生物d n a 的方法来证明其内生( s t o n ee t a l ，2 0 0 0 ) 。我们可把 疆毖斑生蘧理辫态接馥组织瘫魏正誉甍群，它喾l 苓经毽括了嚣惠互裁匏( m t r u a l i s t i c ) 魏中性熬 ( n e u t r a l ) 内共生微生物，散包括了那艘潜伏在宿主体内的病原微生物( 邬文欣等，2 0 0 1 ) 。 寄关植物内生萤的起源存在鼹种假设郎内生说( e u d o s y m b i o t i ct h e o r y ) 和外生说 ( e x o s y m b i o t i ct h e o r y ) ( 鄂文敢和谭仁祥，2 0 0 1 ；文才艺等，2 0 0 4 ) 。肉嫩说认为，肉生菌是出 植物细胞中的线粒体或叶绿体演变而来的，因此，馁们与宿主植物具有相同或相似的漶传背景， 运用生物技术对内生茁进行政整，势分离相应鲍具鸯增强植物抗逆性的内艇莹基因以凝霉将其转 移到耩物的基因缀，可以获得其有特豫抗性或耐受性植物。井童说认为，裢物内生蔼照从病原藩 演化而米的。病原菌通过自然孔口或伤口进入体内，在与宿主植物长期的欺进化过程中。一方面， 瘸原藩可能发生影响其毒力熊基冈突变，病原萤侵入槎主怎在缓圭孛生长繁疆嚣对密囊不产生毒 害，不使宿主出蕊症状，闲_ i i i i 变成内生麓。例如炭瘢菌( c o t l e t o t r i c h u mm a g m a ) 是世界上许多瓜 类作物的主要病原菌之一，f r e e m a n 等( 1 9 9 3 ) 发现一个突变株( cm a g n ap a t h ”却可像普邋 内生落郏襻正常生漭在密主体是，不仅幂s l 起铗键疲状，反露霹敬激遗瘩主的防磐系统，使之受 中周农业大学硕十学位论文 第1 章前言 受镰刀菌和其他炭疽菌等病原菌的侵害。进一步研究发现，该内生菌突变株与野生型致病菌株的 基因组之间仅有一个基阏位点的差异，而且除了生长速度较慢外，在孢子粘附、附着胞形成、侵 染路径及宿主专化性等方面与致病菌株并无两样。另一方面，当侵入的病原菌毒力与宿主的防卫 能力处于平衡时，病原菌也就以内生菌的方式存在于植物体内。s i e b e r 等( 1 9 9 0 ) 对大叶槭( a c e r - m a c r o p h y l l u m ) 愈伤组织与其内生菌烈重培养的研究结果发现，宿主愈伤组织的存在对内生菌的 生眭具明显促进作用，相反，内生菌则对宿主愈伤组织的生长产生抑制作用。p e t e r s 等( 1 9 9 8 ) 研究了3 种内生菌与其宿主及非宿主植物愈伤组织共培养时的相互作用，也得山同样结果。s c h u l z 等( 1 9 9 9 ) 通过对落叶松和大麦两种植物的内生菌及病原菌感染引起的宿主防卫性次生产物以及 大量内生菌次生代谢产物的分析，结合内生菌与宿主愈伤组织共培养等一系列实验结果的分析发 现，内生菌能产生对宿主有毒害的次生代谢产物，内生菌的侵染同样会引发宿主的防 _ - 反应，因 此得出结论认为内生菌和宿主植物之间是一种处丁动态平衡的拮抗关系。某些内生菌在宿主植物 衰老或受到环境胁迫时又会转变为病原菌的事实，也从一个侧面支持了部分内生菌是处于潜隐状 态的病原菌这种观点。又如白灰制菌素a ( l e u c i n o s t a t i n a ) 是许多病原真菌产生的植物毒素，可 引起多种植物产生坏死症状( n e c r o t i cs y m p t o m s ) ，但在欧洲紫杉( t a x u sb a c c a t a ) 中，尽管其内 生真菌枝项孢( a c r e m o n i u ms p ) 产生了白灰制菌素a ，却不引起宿主产生坏死症状，因为该植 物体内与内生菌一样具有一种糖基化酶，可将白灰制菌素a 转变成低毒的白灰制菌素a 一葡萄糖 苷( s t r o b e le t a l 1 9 9 7 ) 。 内生菌包括内生真菌( e n d o p h y t i cf u n g i ) 和内生细菌( e n d o p h y t i cb a c t e r i a ) 。近二十年来， 人们更多地关注内生真菌的研究，所研究的植物类群数量大约有数百种。从目前已经研究过的植 物来看，未发现没有分离到内生真菌的植物种类，因此可以推断内生真菌在植物体内是普遍存在 的。通过对内生真菌与宿主专一性分析，平均每种宿主有4 - 5 种专性内生真菌，按地球已知2 5 万种植物计算，内生真菌总数可以超过1 0 0 万种( p e l r i n ie t a l ，1 9 9 1 ) 。以下主要讨论植物内生真 菌的生物学和生态学作用，以及内生真菌产生的次生代谢物质。 1 1 2 植物内生真菌的生物学和生态学作用 1 1 2 1 促进植物生长的作用 内生真菌对宿主植物的促进生长作用表现在种子发芽、幼苗存活、分蘖生长、花序、生物量 等多个方面。c l a y 等( 1 9 8 9 ) 发现，内生真菌感染的黑麦草和高羊茅种子，其发芽率均比相应未 感染内生真菌的种子高1 0 左右，且感染和来感染的高羊茅种子中，饱满种子所占比率分别为 “和1 9 。其后c l a y 等( 1 9 9 1 ) 又对美国l o u i s i a n a 中部的高羊茅( f e s t u c aa r u n d i n a c e a ) 草 场进行了3 年的观察，结果表明感染内生真菌植株的存活率比未感染植株高5 0 ，且产生的分蘖、 花序和生物量分别比未感染植株高5 0 、4 0 币17 0 。t a n 等( 2 0 0 1 ) 发现内生真菌胶孢刺盘孢 ( c o l l e t o t r i e h u mg l o e o s p o r i o i d e s ) 能够促进宿主植物黄花蒿( a r t e m i s i aa n ? 1 1 1 0 ) 愈伤组织的生长。 郭顺星等( 1 9 9 0 ) 从兰科植物细叶石斛( d e n d r o b i u mh a n c o c k i i ) 和见血青( l i p a r i sn e r v o s a ) 的 原球苇中分离到3 株真菌，它们均能促进其宿主植物种子的萌发。 2 1 122 增强宿土植物对生物胁迫的抗憾 内生真蓝可增强宿主楗物对病原藏、昆虫和蠛乳动物的抗性。c l a y 等( 1 9 8 9 ) 发现侵染出生 真菌的草遭受至真菌病害影响的程度遗远低于没有感染内生粪菌的。傅艇擎等( 1 9 9 9 ) 用内生冀 菌及其代谢产物与棉花黄萎痫i 笥共培葬的方式，证明内生真菌可通过促生长作用米提高棉株的抗 逆性。p r e s t i d g e ( 1 9 8 2 ) 观察到内生真慧感染的多譬生黑麦苹霹啦抵挠西搬廷象鼻虫( l i s t r o n o t u s b o n a r i e n s i sk u s e h e l ) 豹侵袭。c h e p l i c k 黎i c l a y ( 1 9 8 8 ) 对内生囊蘸l a c r e m o n i u mc o e n o p h i a l u m l 鼓辩 的黑麦草和高节茅的植株和种子的揽虫性进行丁研究，发现喂食感染植株叶片的秋粘m ( s p o d o p t e r a f r u g i p e r d a ) 幼虫，其存瓣率和生长速率明显低于嚷食来感染时片的幼虫，且发育惩 迟。b a c o n 等( 1 9 7 7 ) 发现离羊茅对牛酌毒性是由于内生真蔼“c r e m o n i u mc o e n o p h i a t u m 产生的生 物碱所引起的。 1 1 2 3 灌强宿主植携黠嚣凌耪追静抗撩 内生真菌感染宿主植物厢，宿主植物对环境胁迫的抗性增强。w e s t 镣( 1 9 9 3 ) 对高羊茅进杼 不弱壤农分撵发戆蟹闫实验，发现程瘩分魏遥下蠹生囊莹来餐染耪臻魄瘫生奏蘩覆豢耱嚣l 垮冀 更早凝老，分蘩死亡也更快。a r a e h e v a l e t a 等( 1 9 8 9 ) 通过温察水分胁迫实验表明，在轻度水分 胁迫下，内生真菌侵染的高羊茅产量比对照高，在艇度水分胁追下，7 5 的未感染槌株死亡，感 染毽撩垒熬存滔，虽有大鬟露囊毽产蘩零受饔显影旗，蘧。卷鼗蠛象在内生褰蓉经染黪整拣孛更糟 遍。陈世萍等( 2 0 0 1 ) 证明，谯正常条件f ，感染内生真菌的烈庄草体内保护酶系统如p o d 、s o d 的活性明显高于朱感染内生真菌的植株，并认为内生真菌很可能增强了植物的s o d 活性调节能 力，麸磊对褪魏静抗孥缝产囊有益影晌。m a l i n o w s k i 蒋 1 9 9 9 ) 磅究表胡，内生囊蘩n e o t y p h o d i u m p h o p h y i a l u m 俊染高羊茅艏，高羊茅对铝的毒性鼹有更强的抗性。此外，内生真菌还可增强宿 主植物对低温、污染等环境胁迫的抗逆性( m a g a ne t a t ，1 9 9 6 ) 。 1 1 2 4 增强宿主撩物盼魍撼作用 内生真菌能够通过分泌他感物质抑僚4 其它植物的生长，从弼提高感染掇物在群落中的竞争能 力。s u t h e r l a n d 摹l l h o g l a n d ( 1 9 8 9 ) 发袋感觌t c r e m o n i u m t o l i i 鹣燕麦苹能产生镪惑佟魂物震，经蜀潮 白三叶草( t r i f o l i u mr e p e n sl ) 的密度降低。r e a d 等( 1 9 9 0 ) 用从感染熬麦草植株中提取的植 物毒豢处理多种鼹科檀物，发现提取液可以明显抑制豆辩植物擞系的发育，进一步确诞黑麦草对 豆辩穗物其袍惑作用。 1 1 2 5 促进宿主产生代谢产物 内生真菌的彼染可敬健避宿主植物产生更多的次生代谢产物。w a n g 簿( 2 0 0 1 ) 扶孛嚣红益 杉( t a x u s c h i n e s i s ) 的树皮中分离到一株黑曲霉( a s p e r g i l l u