（细胞生物学专业论文）高致病性禽流感病毒h5n1治疗性嵌合抗体研究.pdf

摘要 摘要 高致病性禽流感( a v i a ni n f l u e n z a ，a i ) 是由a 型流感病毒h 5 n i 引起的烈 性传染病。近年来随着疾病的不断蔓延，禽流感病毒不仅使各地养禽业蒙受巨大 损失，而且还不断突破种间屏障引发人感染事件。目前高致病性禽流感面临的问 题是病死率居高不下且缺乏有效的治疗药物。由于流感病毒的持续快速变异，自 然界中h 5 n i 病毒已逐渐形成多种抗原性不同的变异亚系病毒株共流行的状况， 要满足长期战略储备药物的需求，研制的h 5 n i 治疗药物必须具备广谱性。 中和单抗是防治病毒性疾病的一种有效手段，但由于禽流感病毒基因突变频 率高，特别是血凝素( h a ) 基因，因此针对禽流感病毒的中和单抗中和谱较窄， 往往只能中和少数遗传变异亚系的病毒，极大限制了这些中和单抗的应用。 基于本实验室近期构建的一个具有血凝抑制( a i ) 活性的h 5 特异性单克隆抗 体库( 已经用4 l 株包含全部1 0 个遗传进化分支的h 5 n i 病毒代表株对这些单抗 的h i 活性和以小鼠为动物模型的中和活性进行了测定) ，本研究选取四株广谱中 和活性强的鼠单抗：4 d i 、i o f 7 、8 h 5 、1 3 d 4 进行人源化改造，以降低鼠抗在人 治疗过程中的h a m a 反应，为这些抗体尽快进入临床应用奠定基础：同时也希望 建立一套治疗性抗体人源化研究的平台体系，包括基因的改造、表达载体的构建、 哺乳动物细胞高效稳定表达、无血清大规模培养、抗体纯化工艺等。 本研究先以r t - p c r 的方式从鼠杂交瘤细胞内获得四株抗体的可变区基因， 再结合至人抗体i g g l 的恒定区，插入p c d n a 3 1 表达载体瞬时表达得到嵌合抗体 产物；通过h i 、e l i s a 、免疫荧光方法验证抗体具有活性。为了在短期内累积一 定的产物用于后续研究，我们选用f l p - i n 定点整合表达系统，其f r t 定点整合 的特点使抗体能够稳定高效表达，经过细胞筛选流程，我们现已获得三株稳定表 达细胞株，而且抗体的表达产量提高了3 - 4 倍。在获得少量无血清培养的抗体纯 化物后，我们用多株h 5 n i 病毒株眦实验、及细胞体外中和实验验证嵌合抗体的 广谱中和活性，以确定整个改造及表达过程中抗体的可变区活性没有受到影响。 本研究选择1 3 d 4 嵌合抗体进行大规模表达和纯化。为了满足下游抗体纯化 简便及大规模生产的需求，我们对c h o 细胞的无血清培养方法也进行了探索，包 括优化无血清培养基的营养成分、滚瓶较大规模培养操作等。我们发现b s a 添加 物确实可以显著提高嵌合抗体的产量，尤其是3 的添加比例，可使抗体产量提 摘要 高8 倍，但与此同时给抗体的纯化带来干扰，应该综合考虑抗体的纯度和得率来 决定最优方案；蛋白a 亲和层析法一直是抗体纯化的特异有效方式，我们摸索了 不同洗脱p h 缓冲液，得到适合嵌合抗体纯化的洗脱p h 值，最终纯度达到9 5 ， 得率在9 0 。 针对具有代表性的四株h 5 n 1 病毒的动物保护实验结果证明，在 v i e t n a m 1 1 9 4 2 0 0 5 感染后的第1 和3 天，以及在b hg o o s e q i n g h a i 1 5 c 2 0 0 5 和s h e n z h e n 4 0 6 h 2 0 0 6 感染后的第1 天，13 d 4 嵌合抗体均有10 0 的治疗效果。 而在i n d o n e si a 5 2 0 0 5 感染后的第l 天和s h e n z h e n 4 0 6 h 2 0 0 6 感染后的第3 天，1 3 d 4 嵌合抗体的治疗效果欠佳。 总之，通过以上方法我们成功构建了四株高致病性禽流感h 5 n 1 人一鼠嵌合抗 体，它们保留了亲本鼠抗的广谱中和活性，将降低治疗人感染疾病时的h a m a 反 应，为治疗性抗体在人感染h s n l 领域的应用奠定了基础。 关键词：高致病性禽流感病毒；治疗性抗体；血凝素( h a ) ；广谱中和活性 摘要 a b s t r a c t t h eh i g h l yp a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z a ( h p a i ) i sas e v e r ei n f e c t i o u sd i s e a s ec a u s e db y h 5 n1v i r u s a st h ev i r u ss p r e a dw o r l d w i d ei nr e c e n ty e a r s ，t h ep o u l t r yi n d u s t r yh a s s u f f e r e dl a r g ee c o n o m i cl o s sa n dt h ev i r u sh a sb r o k e nt h er e s t r i c t i o no fi n t e r s p e c i e s t r a n s m i s s i o nt oi n f e c th u m a n t h ec u r r e n tp r o b l e mo fh 5 n 1i st h eh i g hm o r t a l i t ya n d t h el a c k i n go fe f f e c t i v ed r u g s t h ep a n d e m i cv i r u ss t r a i n sw i t hd i f f e r e n ta n t i g e n i c i t y p r e v a l e n c ea tt h es a n l ep e r i o dd u e t ot h ep e r s i s t e n tm u t a t i o n i ti sn e c e s s a r yt od e v e l o p d r u g so fw i d er a n g et oh 5 n 1t om e e tt h en e e do fl o n g - t e r ms t r a t e g i cr e s e r v e n e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e si sa ne f f e c t i v ew a yt o c o n t r o lv i r a ld i s e a s e s h o w e v e r , t h e n e u t r a l i z i n ga n t i b o d yt oh 5 n 1h a sl i m i ts p e c t r u mt oaf e ws t r a i n sb e c a u s eo ft h e h i g h l yf r e q u e n tm u t a t i o no fv i r u sg e n e s ，e s p e c i a l l yt h eh e m a g g l u t i n i n ( h a ) g e n e s ， w h i c hr e s t r i c t st h ea p p l i c a t i o no fn e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e s w eh a sc o n s t r u c t e dah 5 - s p e c i f i ca n t i b o d yp a n e lw i t hh e m a g g l u t i n i ni n h i b i t i o n ( h i ) t o 41s t r a i n so fv i r u sb e l o n g i n gt o10c l a d e sa n ds o m eo ft h e mh a db r o a d s p e c t r u m p r o t e c t i o n t om o u s ei nv i v o i nt h ep a p e r , f o u rs t r a i n so fm o u s ea n t i b o d i e s d e s i g n a t e da s4 d1 ，lo f 7 ，8 h 5a n d13 d 4w i t hh i g ha c t i v i t yi nn e u t r a l i z i n ga s s a ya r e h u m a n i z e dt or e d u c et h eh u m a na n t i - m o u s ea n t i b o d y ( h a m a ) i nt h e r a p y , w h i c hi s f u n d a m e n t a lt ot h ec l i n i c a la p p l i c a t i o n i ti sa l s oe x p e c t e dt oc o n s t r u c tap l a t f o r mf o r t h e r a p e u t i ca n t i b o d yh u m a n i z a t i o ni n c l u d i n gg e n em o d i f i c a t i o n ，c o n s t r u c t i o no f e x p r e s s i n gv e c t o r , s t a b l ec e l l s t r a i no fh i g h l ye x p r e s s i o n ，s c a l e u pc u l t u r e w i t h s e r u m f r e ea n d a n t i b o d yp u r i f i c a t i o n i no u rr e s e a r c h ，t h ev a r i a b l eg e n e sw e r eo b t a i n e df r o mm u r i n eh y b r i d o m ac e l l sb y r t - p c ra n dc o m b i n e dw i t ht h ec o n s t a n tr e g i o no fh u m a nl g g1 t h eg e n e sw e r et h e n i n s e r t e di n t op c d n a 3 1t ot r a n s i e n t l ye x p r e s s i n gc h i m e r i ca n t i b o d y t h ea c t i v i t yw a s t e s t e db yh i ，e l i s aa n di m m u n o f l u o r e s c e n c e t oa c c u m u l a t et h ea p p r o p r i a t ea m o u n t o fa n t i b o d yf o rf u r t h e rr e s e a r c h ，w eu s e df l p i ne x p r e s s i o ns y s t e mw h i c hc o u l ds t a b l y i 摘要 e x p r e s sa n t i b o d yw i t hh i g he f f i c i e n c yb yf r tt a r g e t e di n t e g r a t i o n a f t e rt h es c r e e n i n g p r o c e d u r e ，w eo b t a i n e ds e v e r a ls t a b l ec e l l l i n e sa n dt h ep r o d u c t i o no fa n t i b o d y i n c r e a s e d3 - 4t i m e s t of u l f i l lt h ep u r i f i c a t i o na n ds c a l e - u pp r o d u c t i o n ，w ed e v e l o p e dt h ec h oc u l t u r e w i t hs e r u m - f r e es y s t e m ，i n c l u d i n gn u t r i e n tc o n t e n ti nm e d i u m ，r o l l e rb o t t l ec u l t u r e w ef o u n dt h a tt h ea d d i t i o no fb s ac o u l di n c r e a s et h ep r o d u c t i o ns i g n i f i c a n t l y , e s p e c i a l l y3 b s aa d d i t i o nw h i c hc o u l di n c r e a s eb y8t i m e sb u ti n f l u e n c e d t h e p u r i f i c a t i o n t h ee x p r e s s i o ns t r a t e g yc o u l db eo p t i m i z e dc o n s i d e r i n gt h ep u r i t ya n d y i e l do fa n t i b o d y t h ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yb yp r o t e i na w a sas p e c i f i ca n d e f f e c t i v ew a yf o ra n t i b o d yp u r i f i c a t i o n w ee x p l o r e de l u t i n gb u f f e rw i t hd i f f e r e n tp h a n do b t a i n e dt h ea p p r o p r i a t eo n ew i t hf i n a lp u r i t yo f9 5 a n dy i e l do f9 0 t oc o n f i r mt h eh u m a n i z a t i o na n de x p r e s s i o np r o c e d u r eh a dn oi n f l u e n c eo nt h e a c t i v i t yo fv a r i a b l eg e n e s ，t h ep u r i f i e da n t i b o d yf r o ms e r u m f r e ec u l t u r ew a s t e s t e db y h ia n dn e u t r a l i z i n ga s s a yt os e v e r a ls t r a i n so fh 5 n1v i r u st ot e s tt h eb r o a d - s p e c t r u m n e u t r a l i z a t i o n t h ep r o t e c t i o na s s a yi nm o u s ew a sp e r f o r m e dt ot h e13 d 4 c a bw i t h b r o a d s p e c t r u mn e u t r a l i z a t i o n i ts h o w e dt h a tt h e13 d 4 c a bh a d10 0 t h e r a p e u t i c a c t i v i t yt o4c l a d e so fv i r u s i ns u m m a r y , w es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e df o u rs t r a i n so fc h i m e r i ca n t i b o d i e st oh p a i h 5 n 1 t h e ym a i n t a i n e dt h eb r o a d - s p e c t r u mn e u t r a l i z i n ga c t i v i t ya sm u r i n ea n t i b o d i e s a n dr e d u c e dt h eh a m ai nt h e r a p y , w h i c hl a i daf o u n d a t i o nt oa n t i b o d yt h e r a p yf o r h 5 nli n f e c t i o n k e yw o r d s ：h i g h l yp a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z av i r u s ；t h e r a p e u t i ca n t i b o d y ； h e m a g g l u t i n i n ； i v - b r o a ds p e c t r u mn e u t r a l i z a t i o n 缩略词 a b b r e v i a t i o n ( 缩略词) a i ：a v i a ni n f l u e n z a禽流感 a i v ：a v i a ni n f l u e n z av i r u s 禽流感病毒 a d c c ：a n t i b o d yd e p e n d e n tc e l l - m e d i a t e dc y t o t o 抗体依赖性细胞毒效应 b s a ：b o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 c a b ：c h i m e r i ca n t i b o d y 嵌合抗体 c d c ：c o m p l e m e n t d e p e n d e n tc y t o t o x i c i t y 补体依赖细胞毒效应 c d r ：c o m p l e m e n t a r i t yd e t e r m i n i n gr e g i o n ，抗原决定簇 c h ：c o n s t a n tr e g i o no fh e a v yc h a i n ，重链恒定区 c l ： c o n s t a n tr e g i o no fl i g h tc h a i n ，轻链恒定区 e l i s a ：e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b a n ta s s a y 酶联免疫吸附测定 f r ：f r a m e - w o r kr e g i o n 骨架区 h a h e m a g g l u t i n i n ，血凝素 h a c a ：h u m a na n t i c h i m e r i ca n t i b o d i e s 人抗嵌合抗体抗体 h i ：h a e m a g g l u t i n a t i o ni n h i b i t i o nt e s t 。血凝抑制实验 h p a i v ：h i g hp a t h o g e n i ca v i a ni n f l u e n z av i r u s ，高致病性禽流感病毒 i f a ：i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n ta s s a y ，间接免疫荧光检测 i g ：i m m u n o g l o b u l i n 免疫球蛋白 h r p ：h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 m a b ：m o n o c l o n a la n t i b o d y 单克隆抗体 m a p ：m u l t i p l ea n t i g e np e p t i d e ，多抗原肽 n a ： n e u r o m i n i d a s e ，神经氨酸酶 r t p c r ：r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep c r ，反转录p c r s p a ：s m a l lp r o t e i na ，小分子蛋白a w h o ：w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ，世界卫生组织 v h ：v a r i a b l er e g i o no f h e a v yc h a i n ，重链可变区 v l ：v a r i a b l er e g i o no f l i g h tc h a i n ，轻链可变区 v - 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 糯篡急篡：为。膨黼鳓弱$ 赫徽，另外，该学位论文为( 田獬黼断访汹弱$ 猡怕百谋题 ：组) 的研究成果，获得( 谈) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在(趁) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 声明人( 签名) ： 厶f 7 年易月f 日 辱磐嗡 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“、产或填上相应内容。保密学位论文应 是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦f - j ；k 学保密委 员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为 公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ： 年月日 第一章前言 第一章前言 禽流感( a v i a l l ；n f l u e n z a ， i ) 是由a 型流感病毒引起的一种禽类呼吸系 统性疾病，根据病毒表面抗原血凝素( h a ) 和神经氨酸酶( n a ) 的不同，a 型 流感病毒通常可以分为若干亚型；而根据致病性不同，禽流感又可分为高致病、 低治病和无治病性禽流感。迄今为止，所有高致病性禽流感的爆发均由h 5 和 h 7 亚型病毒引起【l 】。自2 0 0 3 年以来，h s n l 高致病性禽流感病毒引起世界范围 内禽类高致病性禽流感的爆发流行，也不断引起人类感染和死亡。尽管目前没有 确切证据表明禽流感能在人人之间传播，但由于禽流感病毒可能通过候鸟迁徙造 成全球播散，人类对禽流感病毒普遍缺乏免疫力，h s n i 禽流感高病死率以及可能 出现的病毒变异等原因，使h 5 n i 禽流感作为可能引起国际大流行、严重威胁公 共卫生安全的烈性传染病，受到世界范围的密切关注【1 1 。 血凝素( h a ) 和神经氨酸酶( n a ) 是禽流感主要表面抗原蛋白，能够诱导 机体产生相应的中和抗体，而由于血凝素( h a ) 基因的突变率极高，容易产生 抗原的漂移和转变，日益成为禽流感防治研究的焦点。 目前针对h 5 n 1 的预防和控制措施主要包括：疫苗研发、抗病毒药物研制、 治疗性抗体研发。鉴于h a 的高突变性，疫苗和药物都无法有效应对新毒株的大 规模爆发；而近年来随着治疗性抗体技术的发展，研制具有广谱中和作用的治疗 性抗体越来越成为防治高致病性禽流感爆发的趋势【3 】。广谱中和治疗性抗体具有 特异性强，疗效好等优点，以h a 蛋白为靶向的治疗性抗体的生产和研究，对于 禽流感的治疗有着重大意义。 一、高致病性禽流感病毒 1 1 高致病性禽流感的危害 1 9 9 4 年，美国动物卫生协会家禽和其它禽类可传播疾病委员会将禽流感划分 为高致病性、低致病性、无致病性三种。在所有的亚型组合中，目前只发现部分 h 5 、h 7 亚型属于高致病性禽流感，其它亚型皆表现为低致病性【4 1 。， 自1 9 9 9 年以来，高致病性禽流感的爆发非常频繁，对人类的养禽业造成巨大 的经济损失，尤其是2 0 0 4 禽流感的爆发最为严重，流行的规模之大、地理分布范 围之广、破坏程度之深在人类养禽业历史上均史无前例。 第t 前自 高致病性禽流感不仅对禽类造成巨大的危害，对人类的生命安全也带来了很 大程度的威胁。1 9 9 7 年，香港出现了首例h 5 n i 禽流感病毒直接由鸡传播到人的 事件，造成1 8 人患病，包括6 人死亡。据世界卫生组织统计自2 0 0 3 年至2 0 0 9 年5 月全世界共1 5 个国家出现人感染h 5 n i 亚型禽流感病毒，确诊病例4 2 9 人，死亡 率达6 1 。我国于2 0 0 9 年新增感染7 人例，4 人例死亡。目前h 5 n i 禽流感疫情己 成为继2 0 0 3 年“非典”疫情之后，人类面临的最大的传染病威胁之一( 图l - 1 ) 。 越来越多的迹象表明禽流感j e 通过进化变异运渐获得直接感染哺乳动物和人的 能力使禽流感病毒作为可以感染人的病原得到了人们的重新认识，更引发科学 研究者们对于原来只存在于禽类中的流感病毒亚型是否也具有引起人类流感大 暴发的潜在威胁的重新思考：禽流感的控制和防制成为当前我国乃至世界面l 临的 紧迫问题。 图卜1 ：2 0 0 3 年至2 0 0 9 年5 月确诊人感染h 5 n i 病毒的地区 f i g l i a f f e c t e da t e m $ w i t hc o n f i r m e dc a s e so f h s n ia v i a n i n f l u e n z as i n c e 2 0 0 3 ，s t a t u sa so f 0 5 2 0 0 9 一! = ! ! 1 2 膏漉盛病毒的肜态特征殛分类 禽流感病毒属于正粘病毒科a 型流感病毒。病毒颗粒一般为球形，直径是 8 0 - 1 2 0 n m ( 图l 2 ) ，最外层被双层类脂囊膜包裹，囊膜由纤突，双层类脂膜构 成t 纤突包括两种物质，一类呈棒状，由血凝素分子( h a ) 三聚体构成；另一 类呈蘑菇状，由神经氨酸酶分子( n a ) 四聚体构成，两种纤突在囊膜上的比例 为4 - 5 ：1 ，m 2 基质蛋白镶嵌在囊膜中。中间的基质膜紧贴在类脂双层内面，由病 毒粒子内的基质蛋白m l 组成。最内层是直径9 - 1 5 n m 的螺旋对称的核壳体，由核 酸、n p 及三种聚合酶( p b l 、p b 2 、p a ) 所组成。核壳体内含8 个节段的病毒基因 组，均为单股、负链r n a 。 根据核蛋白和基质蛋白抗原性的不同，可将流感病毒分为甲型、乙型、和 丙型，禽流感属于甲型流感病毒，其主要抗原表位是跨膜塘蛋白血凝素( h a ) 和神经酰胺酶( n a ) ，两者可诱导亚型特异的免疫反应从而在各个不同的亚型 内产生完全保护而在亚型问只能产生部分交叉保护。根据这些糖蛋白抗原性的 差异，目前将甲型流感病毒分为l 补h 亚型( h i h 6 ) 和9 个n 亚型( n l - n 9 ) 吼 图l - 2 ：流感病毒的结构 f i g l - 2 t h e s t r u c t u r e o f i n f l u e n z av i r u s ( 摘自n a i m s 廿i l c t u r a l m o l c c u l b i o l o g y i & 2 3 3 2 3 4 2 0 0 9 ) 第一章前言 1 3 高致病禽流感的致病机制 迄今为止，高致病性禽流感均是由甲型流感病毒的h 5 和h 7 亚型引起的。然 而事实上仅有少数几种h 5 和h 7 的代表亚型表现出高致病性【6 1 。通常h 5 和h 7 亚型 病毒以低致病性的形式稳定存在于自然宿主体内，需经过数轮循环感染之后，这 些病毒会以跃进的方式突变为高致病性的形式【7 】。 甲型流感病毒具备病毒的一般特性，其致病力具有多基因特征且主要依赖于 多个基因间的最佳相互作用，这些相互作用影响着病毒的宿主和组织嗜性、复制 效率、病毒侵入免疫系统的机制。核苷酸测序研究表明，绝大多数高致病性禽流 感病毒的h a 基因具有共同的特征，而针对家禽来说，h a 正是病毒毒力的标签之 一【引。高致病性禽流感病毒的h a 切割位点由位于1 4 ( h 5 ) 和1 3 ( h 7 ) 的两 个碱性氨基酸组成f 9 】。这些位点对组织特异性的胰岛素样蛋白酶敏感，该酶常表 达于呼吸道和胃肠道上皮细胞表面，因此，人们认为高致病性禽流感病毒大多在 这些部位高效复制。 推澳 j h 5 和h 7 亚型病毒编码h a 基因的r n a 具有不同的二级结构，这有助于病 毒聚合酶参与的、被称为重复拷贝的机制，在编码h a 蛋白内切酶中富含嘌呤的 切割位点区域产生插入突变【。利用反向遗传学技术进行的研究表明，一些h 5 n i 亚型病毒的第9 2 位含有谷氨酸的n s 1 蛋白可以阻碍干扰素及肿瘤坏死因子- o t 发 挥抗病毒作用，从而增强病毒在感染宿主体内的复制并降低宿主对病毒的清除速 率【l l 】。 ， 以上各因素说明病毒自身的突变并非真正是对哺乳动物致病的必要条件1 1 2 】 基因间最佳的相互作用达到一定程度后，病毒似乎才表现出对哺乳动物宿主依赖 的致病特异性，见表l 1 。 表卜1 ：高致病性h 5 n i 病毒导致哺乳动物致病性增强的相关基因位置一览 基因突变位置 所起作用参考文献 h a 多元内部蛋白酶水解位点 有利于病毒全身扩散和复制 l i p a t o v2 0 0 4 1 3 】 m a t r o s o v i c h n a茎区1 9 2 2 个氨基酸缺失适于在鸡和火鸡体内增殖 1 9 9 9 1 4 1 p b 26 2 7 位赖氨酸在老鼠体内各部位复制增强h a t t a2 0 0 1 1 5 】 7 0 1 位天门冬氨酸对老鼠的致病性增强l i2 0 0 5 1 6 1 1 3 位苯丙氨酸，聚合酶活性增强：有利于早 g a b r i e l2 0 0 5 1 7 】 p b - i 6 7 8 位的天门冬氦酸期种特异性适应性变化过程 第一章前言 基因突变位置 所起作用参考文献 n p3 1 9 位赖氨酸 易于逃避天然免疫反应，降 n s - 19 2 位谷氨酸低猪对病毒的清除作用 s e o2 0 0 4 i s 1 4i - i h 蛋白的结构和生物学功能 1 4 1h a 蛋白的结构 h a 蛋白基因极易发生突变，不同毒株的h a 基因序列均存在一定差异。以 h a 基因的差异性将禽流感分为1 6 个h a r 型( h i h 1 6 ) 。h a 完整开放阅读框( o r f ) 长度为1 7 4 2 1 7 7 8b p ，在5 端和3 端分别有2 0 和3 5 个核苷酸组成的非编码区，编 码区由1 6 8 3 1 6 9 8 个核苷酸组成，编码5 6 0 5 6 6 个氨基酸。氨基酸序列分析显示h 1 和h 3 亚型的h a 蛋白差别最大，同源性仅为2 5 ；h 2 和h 5 亚型h a 蛋白的同源性 最高，可为8 0 ；同一亚型不同毒株之间h a 蛋白的同源性均在9 0 以上。 h a 分子量7 5 k d ，属于i 型糖蛋白，是流感病毒囊膜纤突的主要成分之一。 自然状态下h a 以三聚体形式存在于双层类脂层上，其项端膨大的球形体是h a l 蛋白，3 6 k d ，由不平行的d 折叠片构成( 图1 3 ) ，是受体结合位点和抗原表位； 多数糖链位于球形体下面的基部，使茎部外侧面有亲水性【饽】；柄状区域包含有3 股a 螺旋线圈，是h a 2 蛋白，2 7 k d ，与囊膜相连并伸出膜# b 7 6n m 。h a 前体产 生后通常在加工过程中先切除信号肽，然后由细胞中的蛋白酶裂解成h a l 和 h a 2 ；每3 个h a l 和h a 2 又以二硫键结合成为功能性三聚体或h a i 力u h a 2 - - 聚体。 h a 含7 个寡糖链，6 个在h a l ，位置分别是8 ，2 2 ，3 8 ，8 l ，1 6 5 ，2 8 5 ，1 个在h a 2 ， 位于1 5 4 。 第一章前言 圈1 3 ：流感l i a 单体结构图 f i g l - 3 t h es t r u c t u r eo f a h e m a g g l u f i n i n m o n o m e r ( 摘自h l f c s t r u c t u m l m o l e c u l a r b i o 岫y 1 6 2 3 3 - 2 3 4 0 9 ) 1 t2m 蛋白生物学功能 h a 蛋白在病毒吸附和穿膜过程中起关键作用也是禽流感病毒中最重要的 保护性抗原，同时还是病毒致病性强弱的关键因素。 h a 蛋白吸附于靶细胞膜后，被蛋白酶水解为h a l 和h a 2 两条多肽链是病毒 造成瘟染的先决条件。h a l 链具有与宿主细胞受体特异性结合的特性；h a 2 链是 参与细胞膜融合的重要亚单位。整个病毒吸附融合的过程是，先通过h a l 蛋白上 的受体结合位点( p e t s ) 与靶细胞膜上相应受体结合后h a 结构重捧，带有融 台序列的h a 2 链暴露出来井与细胞质膜发生融合，病毒基因组穿入细胞内，病毒 复制开始( 图1 4 ) 。 第一章前言 田1 1 4 ：甲型流痞病毒穿膜及复嗣周期过程 f i g l _ 4 t h e i n f l u e n z a a v i r u sr e p l i c a t i o nc y c l e ( 擅自：j o h n b c i g c l ，m i k e b r a y c u r r e n ta n d f u t u r e 蛐t i v i r a l t h e r a p y o f s e v e r ns e a 帕l a n d a v i a n i n f l u e r l z a a n d v 砌r e s e a r c h7 8 ( 2 0 0 9 1 一l 哟 禽流感病毒的毒性高低是各基因产物共同作用的结果，但h a 蛋白在其中起 着最为重要的作用。h a 蛋白能否被水解为h a l 和h a 2 是禽流感感染细胞的先决 条件，而裂解位点的氨基酸序列决定着病毒毒力。通过对多株禽流感病毒h a 核 苷酸序列和氨基酸序列的比较分析，发现高致病性禽流感病毒裂解位点有6 个连 续碱性氨基酸，而低致病性禽流感病毒仅有2 个碱性氨基酸唧1 h a 蛋白是禽流感病毒中最重要的保护性抗原。它不仅可刺激机体产生保护 性抗体，而且可诱导产生细胞毒作用。对同一亚型病毒的攻击产生良好的保护力。 h a l 蛋白和h a l 单克隆抗体已被作为检测禽流感感染的诊断抗原和抗体，h a 蛋 白或h a l 蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原唧i 。 1 5 高致病性禽漉摩的防治对策 51 疫苗和抗病毒药枸 禽流感引发社会恐慌的最重要原因是病死率居高不下且缺乏有效的治疗药 第章前言 物。目前，禽流感疫苗的研制主要是传统型的病毒灭活疫苗和基因工程疫苗，然 而疫苗面临着生产周期长、对机体潜在的危险性、及难以应对新毒株大规模爆发 的威胁等问题；且a i v 具有高传染性，各种家禽、野生鸟类、不同年龄不同性别 的人都可能成为易感对象，疫苗所能够起到的作用只是保护机体免受病毒侵犯， 不能对感染者进行治疗，而a i v 具有高死亡率的特点，一旦人类遭受感染，生命 安全将受到严重威胁。 目前针对禽流感的药物主要有达菲( o s e l t a m i v i r ) ，金刚烷胺( a m a n t a d i n e ) 、 金刚乙胺( r i m a n t a d i n e ) 等，但这些药物是在病毒感染前或病毒感染早期用药才 有效f 2 i 】，事实上临床病人通常都在发病中后期才到医院就诊，常已错过该药物 的最佳治疗时机；金刚烷胺( a m a n t a d i n e ) 和金刚乙胺( r i m a n t a d i n e ) 是m 2 离子通 道抑制剂，虽然对于流感病毒的一些亚型十分有用，但是却有很严重的副作用， 并且病毒很快的进化出了耐药株2 2 l 。 1 5 2 抗体治疗 由于流感病毒的持续快速变异，自然界中h s n i 病毒已逐渐形成多种抗原性不 同的变异亚系病毒株共流行的状况。根据血凝素抗原( h a ) 的抗原性差异，h 5 n i 病毒目前被分为1 0 余个主要进化分支( c l a d e ) ，其中已有引发人类感染事件报 导的有四个分支，分别是c l a d e1 ，2 1 ，2 2 和2 3 4 【2 3 】。因此，要满足长期战 略储备药物的需求，研制的h 5 n i 治疗药物必须具备广谱性，即对各种h 5 n i 变异亚 系病毒均有疗效，且疗效不因病毒变异而明显下降。 利用中和抗体进行免疫治疗一直是急性传染病的主要特异性治疗手段之一。 抗禽流感病毒的抗体可以通过阻止病毒对宿主细胞的侵入、或通过补体效应和t 细胞效应杀死被感染的细胞而达到预防和治疗流感的作用。 早在1 9 1 8 年流感大规模爆发时，康复病人血清中的抗体对流感的疗效就已 经得到验证【2 4 j ；而在2 0 0 7 年也有报道证明含有抗体的血清使感染了高致病性 h 5 n i 病毒的患者得到了康复( 图1 - 5 ) 。然而，病人恢复期血清来源困难，数量 有限，难以成为常规治疗药物，且多抗血清有病原传播的潜在危险，因此治疗性 单克隆抗体成为国内外禽流感特效治疗药物的研究重点。 第一章前言 h 哪血* t 埘d m 崎嘶撙h 拥n 咖由u b - 出t 枷h h 嘲 r 幽咖 1 9 0 7 耐t m e 删咖m “b ur 帅p 帅2 1 9 1 8 a d 一咖州 m 1 o m c h i n i f 枷h d f n i i d r “w a s _ 郴轴m f m 帅 自m m b ：叫咖日删懈口o e c l s d ；帅时h 呐m m ：叫 m 咖k m “b4 1 9 2 3 惭“l l ；嘲f bp 。d w 螂 1 9 6 3 0嘣m m 砷t 吲c 钿h n 自l i d 5 9 - 1 9 8 9 7 栅* 忡k 蚶目o 删 1 9 7 4 - - 1 9 7 9 q ! _ m 啡婶h 1 9 6 9h m t 1 9 z m f e hm 缸b 伸l f e m 1 9 9 s e b b 怕怕t l 珥k 衙* t r e m m 蛇 t 4 。4 为 2 1 7 i 2 7 t r u m m n to f 口帮6 3 q 呻m 州c h w i n m p m p h i 4 a m 柑* 鲥 啪o m t n 油o n 剐hr 删h 报i 哪l m f 呐“州9 7 ，粥 mc i ”h w h 帅c h 甜日a “h f m d 岫d f * 嘲3 5 唰帕 m d m 抓呻d 限 m 帅 蚓d m f 6 啪如 1 。0 蜥椭胁 挑m r s 蛇雎m m * 诎j 出“捌 】d l h _ h e i 哟i c ”l * m a 州l l 懈m o d m o f l 恼b 州- m m 叫n e 口l n n1 0 2 t h 州h m u a l 呲“1 0 3 a l l 蛐奇q b 吣口啪衄口咖t h l 吣蛳 l 叫 q m * ma m l o 1 2 韩h “q n k 眺删ic 船洲mr m o f 8 0 毗 1 0 5 l m 眦l 删袖岫峭i n r k 哦 b 删 r d 帅酬蛐k n do 帅d 喇口b 女l 由b 出 l o g 坩b 脚2 5 0 m i o fh i m n u 峋 e w y 4 _ hh o 岬l f 叫n 蜘d ha r a e n 黼f o u r d r a 咖删蛐# u mo o n l h 嘲i m ls t u d y w b k b 州1 0 7 目懈3 0 0 m lo f p l a t , r i l lr l d l m 矾州m l 训i b 畸“州1 4 d 啦栅lv 吼a l r 岍l h 哦 s o b 辖唰 月黼l ，2 d n w “i t b 拍州i b 捌a m i h1 0 8 却r m 础i n h k 刚柳0 廿l * l m 叫州m u l h 呻弧 f 坩d c 删m 砖n m 时dc k 卿n “驯1 0 9 m l l d 懈s 删姗* i m h d l a q 如l d h u i l o m 时蛐胁i _ w m * b h f 岬b h 嵋u 刊h i v 州帅腓目 图卜5 ：多抗血清治疗事件 f i g l 一5p a s s i v ei m m u n o t h e r s p y