（生物医学工程专业论文）用于蛋白质折叠研究的连续流动超快速混合装置的研制.pdf

东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生虢j 妇二吼硅2 11 堕乒 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括 以电子信息形式刊登) 论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布( 包括以电 子信息形式刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名池师签名： 吼2 兰竺：9 f 摘要 用于蛋白质折叠研究的连续流动超快速混合装 置的研制 摘要 在生命体内，信息的流动方向是d n a 序列中的遗传信息通过转录和翻译传入蛋白质一级序列 的肽链中，之后肽链经过疏水塌缩、空间盘曲等折叠过程形成蛋白质的天然构象，同时获得生物活 性。因此，研究蛋白质折叠机制有着深远的意义。目前，用于检测蛋白质折叠的快速混合检测装置 足以在毫秒的时间刻度上测量大多数蛋白质的折叠过程，但是很多折叠中间体的形成时间往往处于 检测装置的死时间范围之内。本课题结合b i o l o g i c 的s f m 3 0 0 停流谱仪制作方法以及r o d e r 等人的 快速混合器的设计思路，设计并制作一台新型的超快速连续混合装置，以满足生化研究的需要。 本课题中，首先设计了该快速混合装置的进样系统的机械部分及运动控制部分。机械部分包括 步进电机、滚珠丝杠、轴承、高压注射器等配件。运动控制部分分为硬件和软件两大块，硬件包括 运动控制卡，接线盒以及步进电机驱动器等；软件则采用l a b v i e w 语言编写程序，完成与下位机的 通讯，使得进样系统机械部分能够完成相应的连续动作。l a b v i e w ( l a b o r a t o r yv i r t u a li n s t r u m e n t e n g i n e e r i n gw o r k b e n c h ) 是目前应用最广、发展最快、功能最强的图像化软件开发集成环境，是一个 虚拟仪器开发平台。 其次，设计了该快速混合装置的混合器部分及光学检测部分。引发化学和生物学过程最重要的 方法之一是通过湍流混合使得溶剂组成迅速改变，基于这一原理本文设计了一种t 型混合器，该混 合器包括混合沟道部分及流动池部分，在混合沟道中发生湍流混合。对于混合均匀后流入流通池中 的溶液，搭建了一套光学检测系统，该光学检测系统可以通过单色仪选择不同的激发波长，由透镜 将光汇聚到流通池上，流通池中混合溶液的发射光经过成像之后，由c c d 采集数据，并用图像处理 软件对数据进行分析。 最后，利用荧光光谱分析技术来检测所搭建的超快速连续混合装置的性能。采用罗丹明荧光染 料设计实验，通过对不同流速下罗丹明6 g 与水混合后的荧光强度数据进行分析，验证该装置具有 良好的混合性能，能够较好地完成两种溶液之间的反应。 关键字：湍流混合，连续流动，运动控制，l a b v i e w ，荧光光谱法 东南大学硕士学位论文 d e v e l o p m e n t o fa nu l t r a - f a s tc o n t i n u o u sf l o w m i x i n g d e v i c ef o rr e s e a r c h i n gp r o t e i nf o l d i n g a b s t r a c t i nl i f e ，t h eg e n e t i ci n f o r m a t i o ni nd n as e q u e n c ei st h r o u g hi n t op e p t i d ec h a i n sb yt r a n s c r i p t i o na n d t r a n s l a t i o n ，t h ep e p t i d ec h a i n sf o r mt h en a t u r ec o n f o r m a t i o no ft h ep r o t e i na n do b t a i nt h eb i o l o g i c a la c t i v i t y a f t e rf o l d i n gp r o c e s s e so fh y d r o p h o b i cc o l l a p s ea n dt w i s t i n go fs p a c e t h e r e f o r e ，t h er e s e a r c ho fp r o t e i n f o l d i n gm e c h a n i s mh a sf a r - r e a c h i n gs i g n i f i c a n c e a tp r e s e n t , t h er a p i dm i x i n ga n dd e t e c t i n gd e v i c ef o r p r o t e i nf o l d i n gc a nm e a s u r em o s to ft h ep r o t e i nf o l d i n gp r o c e s si nm i l l i s e c o n d ss c a l eo fm i x i n gt i m e h o w e v e r , t h ef o r m a t i o nt i m eo fm a n yf o l d i n gi n t e r m e d i a t e so f t e nw i t h i nt h ed e a dt i m eo ft h ed e t e c t i o n d e v i c e t h i si s s u ec o m b i n e dw i t hm a n u f a c t u r em e t h o d so ft h es f m 3 0 0s t o p p e df l o wd e v i c ea n dr a p i d m i x e rd e s i g ni d e a so fr o d e ra n do t h e r sd e s i g na n dm a n u f a c t u r ean e wt y p eo fu l t r a - f a s tc o n t i n u o u sm i x i n g d e v i c e i nt h i sw o r k ，t h em e c h a n i c a lp a r to ft h es a m p l i n gs y s t e mw a sd e s i g n e d ，w h i c hc o n s i s to fs t e p p e r m o t o r s ，b a l ls c r e w s ，b e a r i n g s ，h i g h p r e s s u r es y r i n g e sa n do t h e ra c c e s s o d e s t h es a m p l i n gc o n t r o ls y s t e m w a sd i v i d e di n t om o t i o nc o n t r o ls o f t w a r ea n dh a r d w a r ei n c l u d i n gm o t i o nc o n t r o l l e r , t e r m i n a lb o xa n d s t e p p e rm o t o rd r i v e r s ，e t c l a b v i e w ( l a b o r a t o r yv i r t u a li n s t r u m e n te n g i n e e r i n gw o r k b e n c h ) p r o g r a m l a n g u a g ew a su s e df o rt h ep a r to fs o f t w a r e v i r t u a li n s t r u m e n ti s ac o m p u t e rb a s e di n s t r u m e n ts y s t e m w h i c hh a sav i r t u a lp a n e la n di t sf u n c t i o ni sr e a l i z e db ys o f t w a r e a t - s h a p em i x e rw a sd e s i g n e db a s e do nt h et u r b u l e n c em i x i n gt h e o r y a f t e rt h em i x e ds o l u t i o nf l o w i n t ot h eo b s e r v a t i o nc e l l ，t h e r ew a sas e to fo p t i c a ls y s t e mf o rd e t e c t i n g t h ed a t ao fl i g h ti n t e n s i t yw a s c o l l e c t e db yc c da n dt h e na n a l y z e db yi m a g ep r o c e s s i n gs o f t w a r e t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yw a su s e dt od e t e c tt h ep e r f o r m a n c eo ft h i su l t r a - f a s tc o n t i n u o u sm i x i n g d e v i c e r h o d a m i n e - w a t e rs y s t e mw a sd e v e l o p e df o re x p e r i m e n t s i n t e n s i t yp r o f i l eo b t a i n e df o rt h er e a c t i o n o fr h o d a m i n eb yw a t e ri nd i f f e r e n tv e l o c i t yw a sa n a l y s i st ov e r i f yt h a tt h eu l t r a - f a s tm i x i n gd e v i c eh a s g o o dm i xp r e c i s i o na n db eb e t t e rt oc o m p l e t ek i n e t i c r e a c t i o n k e y w o r d s ：t u r b u l e n tm i x i n g , c o n t i n u o u s - f l o w , m o t i o nc o n t r o l ，l a b v i e w , f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y 目录 摘要1 a b s t r a c t i i 第一章绪论l 1 1 快速混合装置概述1 1 1 1 快速混合装置原理湍流混合1 1 1 2s f 方法与c f 方法3 1 1 3 快速混合装置性能参数6 1 2 快速混合装置在生物学中的应用7 1 2 1 蛋白质折叠研究的目的与意义7 1 2 2 蛋白质折叠研究方法8 1 3 论文的研究目标和内容9 第二章进样控制系统1 0 2 1 进样控制系统的机械装置1 0 2 1 1 机械装置的c a d 设计1o 2 1 2 滚珠丝杠及导轨。l l 2 1 3 微型注射器1 4 2 1 4 机械装置的加工及组装。1 5 2 2 进样控制系统的硬件构成1 6 2 2 1 控制系统硬件的总体结构1 6 2 2 2 步进电机的结构及工作原理1 6 2 2 3 步进电机的驱动方式。1 8 2 2 4 运动控制卡及连接板。2 2 2 3 进样控制系统的软件结构2 7 2 3 1 g 语言与虚拟仪器2 7 2 3 2 控制系统应用程序的总体结构一2 9 第三章混合装置3 2 3 1t 型混合器设计3 2 3 1 1 混合沟道部分的设计3 2 3 1 2 流动池部分的设计3 3 3 2 进样流路的设计3 5 第四章光学检测装置3 7 4 1 光学检测的基本原理3 7 4 2 入射光路的设计3 7 4 2 1 氙灯及其电源3 8 4 2 2 光栅单色仪4 0 4 2 3 光学透镜4 2 4 3 检测光路的设计4 3 4 3 1 成像透镜4 4 4 3 2c c d 检测4 4 第五章装置性能检测与结果分析4 7 5 1 装置性能的检测方法4 7 5 2 实验及结果讨论4 7 5 2 1 噪声抑制4 7 东南大学硕士学位论文 5 2 2 混合实验4 8 5 2 3 实验结果讨论51 第六章总结与展望5 4 参考文献5 6 j 【谢5 9 附萄之6 0 附录a 进样装置机械部分设计图纸6 0 附录b 混合沟道部分设计图纸6 l 附录c 石英流通池夹持器设计图纸。6 2 附录d 夹持器底座设计图。6 3 附录e 氙灯电极座设计图纸6 4 附录fc 接口设计图6 5 作者简介。6 6 2 第一章绪论 1 1 快速混合装置概述 第一章绪论 1 1 1 快速混合装置原理湍流混合 1 湍流的概念 引发化学和生物学过程最重要的方法之一是通过湍流混合使得溶剂迅速改变。湍流又称紊流， 它是一种极不规则的流动现象【l l o 在长期实验研究和工程实践中，人们注意到流体运动有两种结构不同的流动状态。流体流动时， 如果流体质点的轨迹( 一般说随初始空间坐标x 、y 、z 和时间t 而变) 是有规则的光滑曲线( 最简 单的情形是直线) ，这种流动叫层流。没有这种性质的流动叫湍流。 湍流是十分复杂的多尺度不规则流动。在湍流中流体的各种物理量，如速度、压力、温度等都 随时间与空间发生随机的不规则的变化，这种不规则同时还表现在它的不重复性。从物理结构上说， 可以把湍流看成是由各种不同尺度的涡旋叠合而成的流动，这些涡旋的大小及旋转轴的方向分布是 随机的。大尺度的涡旋主要是由流动的边界条件所决定，其尺寸可以与流场的大小相比拟，是引起 低频脉动的原因；小尺度的涡旋主要是由粘性力所决定，其尺寸可能只有流场尺度的千分之一，是 引起高频脉动的原因【2 】。大尺度的涡旋破裂后形成小尺度涡旋，较小尺度的涡旋破裂后形成更小尺 度的涡旋。因而在充分发展的湍流区域内，流体涡旋的尺度可在相当宽的范围内连续地变化。通过 涡旋间的相互作用，大尺度的涡旋从主流获得的能量逐渐向小的涡旋传递。最后由于流体粘性的作 用，小尺度的涡旋消失，机械能就转化为流体的热能。同时，由于边界作用、扰动及速度梯度的作 用，新的涡旋又不断产生，这就构成了湍流运动。 v a n k a v m a n 和i gt a y l o r 对湍流的定义为：湍流是流体中出现的一种无规则流动现象，当流体 流过固体边界或流体之间相互流过时会产生湍流。1 9 5 9 年，j o h i n z e 曾对湍流下过这样的定义： 湍流是流体的不规则运动，流场中各种量随时间和空间坐标发生紊乱的变化，然而从统计意义上说， 可以得到它们的准确的平均值。此后，b r a d s h a n 对湍流的定义为：湍流是宽范围尺度的涡旋组成的。 在粘性流体中存在着两种截然不同的流态，并给出了判定层流与湍流两种流态的准贝, t j m 。实验 结果研究发现，流动由层流到湍流的转变与管内的平均流速1 ，、圆管直径么流体密度p 以及流体的 粘度组成的无量纲数有关，这个无量纲数就称为雷诺数( r e y n o l d s 数) 。即： 东南大学硕士学位论文 r e - y p d 一= 堕 d ( 1 ) 式( 1 ) 中，l 卜- i 霆动粘度。r e y n o l d s 数是反应流动特性的一个重要准则。当r e 值很小时， 表示流体的惯性力作用要比粘性力作用小，流动进入层流状态。实验证明，尽管当管径或流动介质 不同时，临界流速不同，但对于任何管径和任何流体来说，判别流态的临界雷诺数r e 口却是相同的， 这个临界值大约在2 3 0 0 - - - 2 8 0 0 左右。若r e r e 口，层流就不可能存在了，一旦有小的扰动，扰动 会逐渐增长从而转变成湍流。一般r e 在2 0 0 0 - - 4 0 0 0 是由层流向湍流转变的过渡区。 从r e y n o l d s 实验可以知道，层流和湍流的根本区别在于：层流中各流层间互不掺混，只存在由 于粘性所引起的各层流间的摩擦阻力；湍流中则有大量大小不等，旋转角速度也不同的涡旋不断产 生，这些涡旋活动于各流层间，除了粘性阻力，还存在着由于质点间相互掺混，相互碰撞所造成的 惯性阻力。所以，湍流阻力比层流阻力大得多。 因此，湍流就是在一定的r e y n o l d s 数下，流体表现在时间和空间上的随机脉动运动，流体中含 有大量不同尺度的涡旋。 大多数学者认为应该从纳维斯托克斯( n a v i e r - s t o k e s ) 方程出发研究湍涮3 训。因为尽管湍流运 动是流体微团的运动，但远未达到分子水平。所以无论湍流运动多么复杂，非稳态的n a v i e r - s t o k e s 方程对于湍流的瞬时运动仍然是适用的。n s 方程反映了粘性流体流动的基本力学规律，在流体力 学中有十分重要的意义。n s 方程如下所示： x 一上鱼+ 丝v z 。：堕 p 瓠p 3 d t l ， z 式( 2 ) 中x 、y 、z 作为已知量，肭流体密度，肋流体的粘度，p = 一丢( 艮+ 岛+ 办) 为 法向应力的平均值，魄，吩，地为速度分量，v 2 = 导+ 熹+ 等为拉普拉斯算子。 n s 方程与粘性流体的连续性方程誓+ 誓+ 姿：o 相结合形成具有四个方程的方程组，从 g 卵 o z 理论上讲，在一定的初始条件和边界条件下，可以求解出n s 方程中的p ，魄、吩、屹四个未知量。 但是，n s 方程是二阶非线性偏微分方程组，要进行求解是很困难的，只有在某些简单的或特殊的 以百丝衍 = = 叱 v v 一p一p + + 印一砂勿一昆 ，一p一p 第一章绪论 情况下，才能求得精确解。目前一般采用数值计算方法利用计算机求解，得到近似解。 2 湍流混合 湍流是广泛存在于自然界和工程中的流动现象，对很多重大科技问题极为重要。因此，近几十 年所采取的做法是针对具体一类现象建立适合它特点的具体的力学模型。湍流混合是流体力学的一 个重要问题，它在化工和燃烧过程中有极其广泛的应用。湍流混合可以简述为对流、扩散和反应这 三个物理过程在不同尺度上的相互作用。 混合过程是在强制对流作用下通过主体扩散、涡流扩散和分子扩散，最终达到分子级的均匀混 厶【5 】 口 o l 将两种或两种以上的溶液进行快速混合是实现化学反应和生物过程最通用和最普遍适用的方 法。在许多生物学分析体系中快速混合都是必不可少的，例如核酸的测序与合成、生物化学分析、 药物研制等等。酶反应、细胞活化、蛋白质折叠等生物过程也需要反应物之间的混合才能实现。同 样，在许多需要完成复杂化学合成的化学体系中，混合过程同样是至关重要的【6 1 。 1 1 2s f 方法与c f 方法 动力学分析法是通过测定反应速率及监测反应的物理或化学动力学过程来实现的分析方法【7 1 。 反应动力学的主要内容是研究化学反应的反应速率及反应机理【引。反应速率是化学反应快慢程度的 量度，广义地讲是参与反应的物质的量随时间的变化量的绝对值。影响反应速率的基本因素是反应 物的浓度和反应的温度【引。 目前，快速混合装置中所采用的动力学方法大致可以分为连续流( c o n t i n u o u s - f l o w ，c f ) 方法 和停流( s t o p p e d f l o w ，s f ) 方法【1 们。 ( 1 ) s f 方法 停流技术是一种研究快速反应的进样技术，将停留技术与其它检测方法结合后，可用于定量分 析和反应动力学研究。停流技术由于消耗试剂量小，而且混合后可立即测量，因此可以大大地缩短 分析时间和提高常规分析的质量，在分析领域得到了广泛的应用。其工作原理是样品快速混合单元 将各反应物在气动装置的作用下快速推进，经喷嘴在短时间内完全混合后，流入反应观察池，并突 然停止流动，通过测定混合物的某一特性如吸光度随时间的变化来监测反应进程【l l 】。 如图1 1 所示，仪器由液路和光路两系统组成，每次采样时，在气动机械装置的驱动下，两种 反应物分别从驱动注射器a 和b 进入混合器混合。共同通过样品池，触动停流注射器。停留注射器 是液路的终点，其作用是设定进样体积。混合器与样品池之间的连接管体积之和，通常为 2 0 0 1 0 0 0 p l 。当停流注射器的活塞被推到终点时，液体停止流动，光路系统接收触发信号进行检测。 3 东南大学硕士学位论文 光路系统中，氙灯的复合光经单色器后变为单色光，通过光缆到达样品池。在样品池的一侧，与入 射光成9 0 。处，信号接收和数据处理装置将光信号转变为电信号，绘出光强随时间变化的动力学曲 线。 荧光检溅器 l f 光路 a 机械驱动装键 图l - l停流装置工作原理示意图 a 、b 注射器管内置有活塞，该活塞可向注射口方向移动，则混合物推动停流注射器活塞通过一 段距离后就会停止。检测器用来检测停留在管中特定位置的混合物的某一物理量随时间的变化值， 就能测定在不同反应时间反应物或生成物的浓度。停流技术中常用到的检测方法主要有紫外可见吸 收光谱法、荧光光谱法、散射光谱法、红外光谱法、拉曼光谱法、核磁共振法等掣1 2 彤】。 基于上述的s f 方法，目前常用的装置是b i o l o g i cs c i e n c ei n s t r u m e n t s 公司的s f m 3 0 0 4 0 0 停流 谱仪，如图1 2 所示。 每个b i o - l o g i c 的停流模块( s t o p p e d - f l o wm o d u l e ，s f m ) 都包括一个机械子系统和一个电机电源 ( m o t o r p o w e rs u p p l y ，m p s ) 。s f m 仪器中所有的注射器、阀、延迟线以及流通池都包裹在水套中， 方便反应物容器的温度调节。注射器的活塞是由步进电机通过滚珠丝杆驱动。s f m 注射器的速度性 能使得观察槽中的死时间( d e a dt i m e ) 低于l m s 。 s f m 可以与b i o l o g i c 的模块化光学系统( m o d u l a ro p t i c a ls y s t e m ， m o s ) 相结合以获得高性 能的光学检测，同时，s f m 还可以与其他的高品质光学检测系统相结合。 4 第一章绪论 ( a )( b ) 图1 - 2 b i o l o g i cs f m 实物图。( a ) s f m 3 0 0 及其控制部分实物图；( b ) s f m 4 0 0 及其控制部 分实物图。 以s f m 3 0 0 为例，在s f m 3 0 0 的机械子系统中包括三个注射器、三个三通阀组成的单极阀组、 一到两个混合器、以及一个进样环。这三个注射器由独立的四相步进电机驱动，每个步进电机的电 源由微处理器控制，注射器的进样速度也通过带有简便操作菜单的微处理器来进行调整。随着电机 转子惯性产生的阻尼衰减将导致连续线性运动的注射器的流速降低，这时，步进电机可以通过手动 或自动两种方式激活。手动模式主要用于填充或清洗注射器，自动模式则用于实际实验过程中。 该注射器的运动完全由微处理器控制，因此，在其他传统的停流设备中需要的手动停止功能在 s f m 3 0 0 中不再需要。该装置的观测系统也可以通过m p s 单元所提供的触发脉冲与注射器运动自勺开 始”和“停止”动作同步。由于每个注射器的独立控制，使得该装置可以完成多种功能的进样顺序。 ( 2 ) c f 方法 基于湍流混合的原理，上世纪2 0 年代连续流动混合技术被应用与快速反应动力学的研究之中。 但是，由于连续流动混合技术要消耗大量的反应试剂，所以大部分的动力学研究不得不用以上所介 绍的更为经济的停流技术。 得益于混合器设计上的改进和检测技术的进步，连续流动混合技术重新得到了重视。运用连续 流动的方法可以获得更短的死时间来进行动力学的研究，在这一方法中，两种或两种以上的溶液被 以很高的线速度从不同的注射器推入一个很小的混合区域来完成混合，这一混合过程可以在微秒级 的时间尺度内完成。 与s f 方法不同的是，c f 的方法不会由于压力、振动或气穴现象而出现伪影，也不会因为对流、 发色团的光学增白或光强度的变化而引起伪影。然而这些因素正是限制了s f 方法所得到的数据质量 5 东南大学硕士学位论文 的关键原因。 基于c f 的方法，r o d e r 等人研制了连续流动超快混合装置，如图1 3 所示【1 0 1 。在他们设计的超 快混合器中，使用注射器泵进样系统，将两种溶液注入该混合器中：由于在混合区域使用了玻璃微 珠的结构，从而引起湍流，促进混合过程：为克服非常微小的混合体积而导致的高反向压力，在流 路中使用了可承受高压的注射器、在线过滤器和压力释放阀。 摊牙雩器泵 & 1 4 0 岬 2 0 0l i m 钠球 2 5 0 岬流动池 图1 3r o d e r 等人设计的连续流动超快混合装置。a ：装置示意图；b ：混合器结构。 该装置经过r o d e r 等人的实验验证，死时间( d e a dt i m e ) 可以达到微秒级。在这一死时间条件 下，为我们更好的研究许多生物学中快速动力学反应提供了可能n 6 。1 7 1 。 1 1 3 快速混合装置性能参数 快速混和装置的主要性能参数有：混合时间、死体积和死时间。 6 第一章绪论 ( 1 ) 混合时间( m i x i n gt i m e ) 混合时间即两种反应物完全混合所需要的时间。 ( 2 ) 死体积( d e a dv o l u m e ) 死体积即混合区域到观察点之间的体积。在实际测量时，还包括了管路和连接头间的体积，当 管路和接头之间的体积很小时，可以忽略不计。 ( 3 ) 死时间( d e a dt i m e ) 所谓死时间是指从混合反应开始至第一个有效观测点所需的时间。在死时间内反应混合物发生 的变化观测不到。死时间是影响混合系统性能的主要指标。目前最先进的停流装置的死时间一般可 达0 5 m s ，而快速连续流混合装置可以达到几十个微秒( 邮) 。死时间关键取决于装置的混合时间、 溶液流速以及死体积。它决定了一台快速混合装置的时间分辨率。尽管很难精确地测量混合时间和 死体积，但是根据二阶反应的幅值，我们也可以很好的将死时间定义为最大有效幅值所对应的时间 坐标到混合开始所对应的时间坐标之间的时间范围。 1 2 快速混合装置在生物学中的应用 快速混和装置常被用来研究超快反应机理，包括化学及酶反应机制、配体结合、以及其他许多 生物学方面的快速动力学反应进程。论文中所设计的快速混合装置是对蛋白质折叠机制的动力学研 究。 1 2 1 蛋白质折叠研究的目的与意义 对蛋白质折叠机制的理解是当前生物学研究所面临的巨大挑战之一。过去的三十多年中，在这 一研究领域里聚集了一大批科学家，他们利用不同的研究手段( 物理、化学、生物、计算等) 从理 论与实验两个方面开展大量的研究工作，对蛋白质折叠机制的理解取得了重大突破，人们开始逐渐 理解小分子量简单蛋白质的折叠和去折叠机制。不仅如此，研究中也发现蛋白质的折叠和去折叠在 细胞中都是非常重要的，具有完整一级结构的多肽或者蛋白质分子，只有折叠形成正确的三维空间 结构才可能具有正常的生物学功能。如果蛋白质分子折叠在体内发生差错，不仅会丧失其生物学功 能，甚至会引发多种疾病，如囊性纤维化、阿尔茨海默病( 进行性老年痴呆症) 、羊瘙痒病等。阐明 有关蛋白质的“在体”折叠机制将有助于研究这类“折叠病”的病理学和研究相应的治疗手段 1 8 - 1 9 1 。 蛋白质折叠问题也是分子生物学中心法则未能解决的一个重大生物学问题，是在后基因组时代 推动生物学朝定量化发展的重要方向之一。随着人类基因组计划的顺利完成，在后基因组时代，对 7 东南大学硕士学位论文 蛋白质折叠机制理解的需求，从来没有像今天这样的重要和迫切，并且相关研究成果将对从结构生 物学到材料科学等诸多学科和领域产生深远的影响。 1 2 2 蛋白质折叠研究方法 近年来在使用荧光技术研究蛋白质分子折叠方面最为活跃和卓有成效的研究工作还是将荧光信 号的变化与折叠动力学研究两者相结合起来。通过与包括s f 在内的多种动力学研究手段联用，科学 家们对许多种蛋白质的折叠过程进行了实验研究，从而加深了对折叠中间体的构象特性和在折叠过 程中起着限速作用的过渡态的了解m 1 1 。 而b e e c h e m 等将时间分辨率光谱和停流谱两者相结合，发展了一种研究蛋白质折叠重要的快速 反应动力学分析技术。这种双重的动力学研究技术能够同时测量荧光信号在皮秒纳秒和毫秒时间尺 度上的改变【2 2 】。一旦折叠过程开始，在毫秒时间间隔上测量色氨酸各项异性的衰减，用来观察在蛋 白质的折叠过程中色氨酸残基转动的灵活性。这些信息可以用来确定与色氨酸“包装”到中间体结 构当中和最终达到天然结构有关的时间尺度。同时，这些实验还能够测量在折叠和去折叠状态之下 不同程度荧光淬灭所带来的那秒时间尺度上荧光寿命的改变。 尽管通常的流动停止技术足以在毫秒时间尺度上测量大多数两种状态的蛋白质分子折叠过程随 时间的变化情况，以及测量以更为复杂机制进行折叠的蛋白质分子在折叠后期的事件，由于折叠中 间体的形成时间处于常用的停流谱仪器的死时间范围之内，所以无法用停流谱来对它们形成过程的 动力学进行测量。因此我们需要有更为快速的方法来揭示在大量蛋白质的最初折叠阶段中间体是如 何形成的。 r o d e r 等人研制的超快混合器能够在微秒时间尺度上对变性溶液进行稀释和测量蛋白质的折叠 过程。溶液的超快混合是一种高度通用的技术，并且最重要的是，超快混合可以在接近天然状态的 条件下对折叠进行分析。并且在实验中可以使用极高浓度的变性剂对蛋白质进行去折叠。因此，他 们的方法是与当前的停流谱技术完全兼容，并且分别来自这两种实验的数据可以并置在一起1 2 3 - 2 4 1 。 c a p a l d i 等将连续流动超快混合实验与通常的停流谱技术相结合，获取了折叠过程开始后从5 0 9 s 至l j l o s 时间范围上的动力学数据f 2 5 l 。s e r g i u 等利用荧光光谱与拉曼光谱技术检测一个稳定的混合装 置死时间在2 0 0 1 i s 左右【2 6 1 。超快混合测量技术将连续流动和荧光光谱测量相结合，为蛋白质折叠动 力学及折叠中间体的研究提供了可靠的条件【2 7 1 。 8 第一章绪论 1 3 论文的研究目标和内容 本课题中。将结合b i o l o g i c 的s f m 3 0 0 停流谱仪的制作方法以及r o d e r 等人的超快速混合器的 设计思路，设计并制作出一种新型超快速混合装置。整台装置包括进样控制部分、混合器部分以及 光学检测部分。采用n a t a - n b s 体系检测装置性能。实现对国外仪器的消化、吸收以及再创新。 本论文的主要研究内容： ( 1 ) 系统论述湍流混合原理以及快速混合器的的研究进展与应用。 ( 2 ) 设计并制作超快速混合装置的进样控制部分。该部分包括迸样仪器的机械设计、硬件的设 置以及控制软件的编写。 ( 3 ) 设计并制作超快速混合装置的混合器部分。该部分根据湍流混合原理，由混合沟道及流动 池组合成一个t 型混合器，实现进样液体的快速混合。 ( 4 ) 搭建超快速混和装置的光学检测部分。该部分包括检测光路与成像光路。 ( 5 ) 利用荧光光谱法，采用罗丹明6 ( 3 荧光染料与水混合的方法，对整台装置的性能进行检测。 9 东南大学硕士学位论文 第二章进样控制系统 2 1 进样控制系统的机械装置 本节主要介绍快速混合装置中进样控制系统部分的机械设计，包括图纸设计、各个零部件的选 用，组合安装等。 2 1 1 机械装置的c a d 设计 运动控制是- - f - j 有关如何对物体位置和速度进行精密控制的技术。典型的运动控制系统由三部 分构成：控制部分、驱动部分和执行部分。一个典型的运动控制系统如图2 1 所示。 广= = 二：= = = ：= 蓬确控麓第件 运动援纠器， 运葫镗锈莒 驱动舒件 驱动器) 1门坐! f 1 一一- - _ - - - 一- - _ - - m i n e | 图2 1典型的运动控制系统的结构框图 论文中对于这一进样控制系统中的机械装置采用a u t o c a d 2 0 0 7 进行二维绘图设计。进样控制系 统的机械装置部分的设计思路为：这是一个三轴的进样控制系统，以便满足多种实验的进样需要。 每个进样轴之间相互独立，由各自的步进电机驱动滚珠丝杠转动，从而带动精密平移台在垂直方向 上运动，滚珠丝杠的正转( c l o c k w i s e ，c w ) 与反转( c o u n t e r c l o c k w i s e ，c c w ) 决定平移台在线速 度方向上的前进与后退。精密平移台连接微型注射器的活塞，带动活塞运动。微型注射器的接头处 连接一个三通阀，这样注射器可以完成进样动作，也可以方便向注射器中填充样品。原始设计的示 意图如图2 - 2 所示。详细参数的进样装置图纸见附录a 。 l o 第二章进样控制系统 2 1 2 滚珠丝杠及导轨 进样注射器 _ 滚珠丝杌_ - 步进i 乜机 图2 2 进样机械装置的设计示意图。 a 一 上 j 1 妇倒 l l 熏 i - 萎 ： i w 论文中进样装置采用南京工艺装备制造有限公司的f f z d l 6 0 5 3 型内循环浮动式垫片预紧滚珠 丝杠副及g g b l 6 a a 四方向等载荷型滚动直线导轨副。 l 、滚珠丝杠副 滚珠丝杠副是由丝杠、螺母、滚珠等零件组成的机械元件，其作用是将旋转运动转变为直线运 动或将直线运动转变为旋转运动，它是传统滑动丝杠的进一步延伸和发展。滚珠丝杠副冈优良的摩 擦特性使其广泛的运用于各种工业设备、精密仪器、精密数控机床等。尤其是近年来，滚珠丝杠副 作为数控机床直线驱动执行单元，在机床行业得到广泛运用，极大的推动了机床行业的数控化发展。 这些发展都取决于其具有以下几个方面的优良特性：传动效率高、定位精度高、传动可逆性、使用 寿命长及同步性能好等。f f z d 型内循环垫片预紧螺母式滚珠丝杠副具有径向安装尺寸小、安装简 便、双螺母预紧的特点，适用于各类负荷、各种精度定位，应用范围最为广泛1 2 8 l 。其1 6 0 5 3 型结构 及实物图如图2 3 所示。 东南大学硕士学位论文 规格 公称公称 坎杠獬丝杠 基本 直径 导程 外径直径 底径 循环 额定负荀 眺窆螺霸黜尺, - j - k 代号固数动载荷 静载萄 d o d t d id 2 i ，pd l c 9 5 )砣渤kbbd 4 d 5n 5 h 卫7 一 d 8k c a 衄)c o t a f f z i l l 6 0 5 31 6s1 5 53 51 2 93t 61 3 2 4 0 0 绉绉 1 0s 2 1 03 8 5 81 06髭嵋趁 ( a ) 图2 3 f f z d l 6 0 5 3 型内循环浮动式垫片预紧滚珠丝杠副尺寸结构及实物图( 单位m m ) 。 注：( 1 ) k c 是在预紧力f p 为o 1 c a 时的理论计算值；当轴向载荷f 不等于0 3 c a 时， k c = k ( 二一) 3 、0 3 c a 。，( 2 ) 式中k 是表中的刚度值，f f z d 型滚珠丝杆副正常工作环境温度范围6 0 。 为使滚珠丝杠副能充分发挥机能，在其工作状态下，必须润滑。润滑可以采用润滑脂或润滑油 皆可。同时滚珠丝杠副在其工作环境中要注意防尘，如果污物及异物进入就会很快使它磨耗，成为 破损的原因。可以采用丝杠护套等将丝杠轴完全保护起来，或者在滚珠螺母两端增加防尘圈以防止 浮尘。 2 、直线导轨副 滚动直线导轨副是由导轨、滑块、钢球、返向器、保持架、密封端盖及挡板等组成( 如图2 4 ) 。 当导轨与滑块做相对运动时，钢球就沿着导轨上的经过淬硬和精密磨削加工而成的四条滚道滚动， 第二章进样控制系统 在滑块端部钢球又通过反向装置( 返向器) 进入返向孔后再进入滚道，钢球就这样周而复始地进行 滚动运动。返向器两端装有防尘密封端盖，可有效地防止灰尘、屑末进入滑块内部【2 引。 保持架钢球 图2 - 4滚动直线导轨副基本组成结构剖视图。 滚动直线导轨副是在滑块与导轨之间放入适当的钢球，使滑块与导轨之间的滑动摩擦变为滚动 摩擦，大大降低二者之间的运动摩擦阻力，从而获得：( 1 ) 动、静摩擦力之差很小，随动性极好，即 驱动信号与机械动作之后的时间间隔极短，有益于提高控制系统的响应速度和灵敏度：( 2 ) 驱动功率 大幅度下降，只相当于普通机械的十分之一；( 3 ) 与v 型十字交叉滚子导轨相比，摩擦阻力可下降约 4 0 倍；( 4 ) 适应高速直线运动，其瞬间速度比滑动导轨提高约1 0 倍：( 5 ) 能实现高定位精度和重复定 位精度。滚动直线导轨副能实现无间隙运动，提高机械系统的运动刚度。成对使用导轨副时，具有 “误差均化效应”，从而降低基础件( 导轨安装面) 的加工精度要求，降低基础件的机械制造成本与 难度。导轨副滚道截面采用合理比值的圆弧沟槽，接触应力小，