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全国高等医药院校教材 分子诊断学 第十七章分子诊断的其它应用 生化与分子生物学学科2012 4 全国高等医药院校教材 分子诊断学 第一节分子诊断在移植配型中的应用 HLA的分子生物学分型第二节分子诊断在法医学鉴定中的应用第三节单核苷酸多态性分析 第一节分子诊断在移植配型中的应用 HLA的分子生物学分型 一 HLA遗传学基础Humanleucocyteantigen人类白血病抗原 全国高等医药院校教材 分子诊断学 一 HLA与器官移植 基本概念 组织相容性 histocompatibility 器官或组织移植时供者与受者相互接受的程度 不相容就会出现排斥反应 rejection 诱导排斥反应的抗原称为组织相容性抗原 也称为移植抗原 主要组织相容性抗原 MHA 主要组织相容性抗原Majorhistocompatibilityantigen次要组织相容性抗原人类白细胞抗原HLAHumanleukocyteantigen其中与移植排斥有关的主要为HLA 类和 类抗原 主要组织相容性复合体 MHC 编码MHA 在人为HLA 的基因是一组呈高度多态性的基因群 集中分布于染色体上的特定区域 称为主要组织相容性复合体 majorhistocompatibilitycomplex MHC MHC编码的产物称为MHC分子 抗原 免疫系统抗原肽 MHC 分子复合物 免疫应答CD4 CD8 T细胞 细胞免疫 体液免疫 抗原性异物排除 MHC分子为T细胞分化发育所必需 MHC分子为免疫应答的启动和调节所必需 一 MHC HLA的基因组成人类的MHC又称为HLA基因复合体 位于第6对染色体的短臂6p21 3上 约4000kb HLA基因有七大类 即A B C D DR DQ DP 这七大类座位内又有不同的位点 根据编码分子的功能和分布的不同 可将整个复合体的基因分成三类 类 类和 类基因 全国高等医药院校教材 分子诊断学 HLA基因的分类 分类基因座位 类基因HLA A B CHLA E F G H X 类基因HLA DP DQ DRHLA DN DO DM 类基因位于 和 类基因之间主要编码某些补体和炎症因子 如 C4A C4B C2 Bf等补体组分 HLA抗原分布 HLA I类抗原分布于有核细胞表面 HLA II类抗原主要表达在活化的M B细胞 树突状细胞等抗原提呈细胞 血管内皮细胞及活化的T细胞表面 HLA III主要是一些补体成分 如C2 C4 Bf等 MHCclassIproteinsformafunctionalreceptoronmostnucleatedcellsofthebody Thereare3majorand2minorMHCclassIIproteinsencodedbytheHLA ThegenesoftheclassIIcombinetoformheterodimeric proteinreceptorsthataretypicallyexpressedonthesurfaceofantigenpresentingcells 二 HLA的遗传特点 1 单倍型遗传haplotype由于一条染色体上HLA各位点的距离非常近 很少发生同源染色体之间的交换 因此亲代的HLA以单倍型为单位将遗传信息传给子代 A B a b G H g h A B G H A B g h a b a b G H g h 1 2 3 4 全国高等医药院校教材 分子诊断学 2 共显性遗传共显性 co dominance 是指某位点的等位基因均能同等表达 二者的编码产物都可在细胞表面检测到 多数个体的HLA位点都是杂合子 但当父亲和母亲在某位点上具有相同的等位基因时 其子代的这个位点就成为纯合子 CodominantexpressionofHLAgenes 3 连锁不平衡理论上 一个HLA位点的等位基因与另一个或几个位点的等位基因在某一单倍型出现的频率应等于各自频率的乘积 然而实际情况是 在不同的地区或不同的人群 某些基因相伴出现的频率特别高 这种现象称为连锁不平衡 已经发现某些疾病的发生与HLA复合体中某些特定的等位基因密切相关 二 分子生物学分型法 1 RFLP与PCR RFLP分型法将目的基因片段PCR扩增后 利用多种限制性内切酶对扩增产物进行酶切 不同的基因序列会产生不同的酶切产物 从而产生不同的电泳图谱 它以简单 敏感 准确 无需同位素等优点成为目前较常用的HLA基因分型技术之一 但是无法分辨杂合子 且只能区分有限的多态性 全国高等医药院校教材 分子诊断学 2 PCR SSP分型法 等位基因特异性PCR ASPCR 设计出一整套等位基因组特异性引物 sequencespecificprimer SSP 借助PCR技术获得HLA型特异的扩增产物 可通过电泳直接分析带型决定HLA型别 从而大大简化了实验步骤 优点是简单易行 分辨率可从低到高 成本低 缺点是不易自动化 不能检测新的等位基因 试剂盒需不断升级 3 PCR SSCP分型法如果二个HLA等位基因存在点突变 经PCR扩增后进行聚丙烯酰凝胶电泳 因其序列的差异形成不同的空间构象 则电泳迁移率也不一样 如此可将它们区别开 PCR SSCP作为PCR SSO的补充 有助于新的HLA等位基因或突变体的发现 在区分纯合子和杂合子基因方面有其独到之处 4 SBT分型法SBT分型法 基于序列的HLA分型法 Sequence BasedHLATyping 是通过对扩增后的HLA基因片段进行核酸序列测定 从而判断HLA型别的方法 以上各个方法都存在一些缺陷 如能配合使用 则能大大提高分型能力 5 基因芯片技术 我国生物芯片技术获得重大突破 由军事医学科学院放射与辐射医学研究所王升启研究员领导的课题组 与深圳益生堂生物企业有限公司联合研制的HLA DRB1分型基因芯片试剂盒 于2005年9月获得了由国家食品药品监督管理局 SFDA 颁发的新药证书和生产文号 这是在国家自然科学基金重点项目和863计划的资助下 基因芯片技术应用的又一里程碑式的重大成果 移植配型 又称为HLA配型 组织配型 指在器官移植中检验供受者之间移植抗原 HLA 是否相配的一系列措施 目前主要检测的是ABO抗原系统和HLA抗原系统 HLA抗原系统主要进行HLA A HLA B和HLA DR三对位点的配型 只有两个个体的HLA配型完全相同才能进行造血干细胞移植 否则会发生移植排斥反应 全国高等医药院校教材 分子诊断学 三 HLA配型在器官移植中的应用 理论上说 同胞兄弟姐妹中有1 4的机会HLA配型完全相合 子女与父母之间只有一半HLA抗原相同 医学上叫做半相合 通常不能相互移植 所以骨髓移植主要在同胞兄弟姐妹之间进行 常见的HLA分型 在300 500人就可以找到相同者 少见的HLA分型可能是万分之一的机率 而罕见的就要到几万甚至几十万的人群中寻找 HLA抗原系统可通过血清学方法 细胞学方法 分子生物学方法来检测 血清学分型借助的是微量淋巴细胞毒试验或称补体依赖的细胞毒试验 取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞 作用后加入兔补体 充分作用后加入染料 着染的细胞为死亡细胞 依据特异性抗体介导的补体系统对靶细胞溶解的原理 待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原 细胞学分型技术指的是通过纯合分型细胞及预致敏淋巴细胞试验对HLA分型 二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原决定簇后发生的增殖反应 由于分型细胞来源困难以及操作繁琐 细胞学分型技术正逐渐被淘汰 流式细胞术取之分子生物学分型法利用PCR技术将少量目的DNA大量扩增 然后再进行产物鉴定的方法 特点是灵敏度高 应用范围广等特点 第二节分子诊断在法医学鉴定中的应用 提要 一 PCR技术在法医鉴定中的应用二 DNA指纹图谱技术三 STR位点分析四 DNA数据库的建立与DNA数据交换五 性别鉴定与Y基因检测 全国高等医药院校教材 分子诊断学 分子生物学的优点 1 检材广泛 稳定性高 2 方法灵敏 3 高概率认定 全国高等医药院校教材 分子诊断学 一 PCR技术在法医鉴定中的应用 亲子鉴定 指在对父母和子女之间的亲生关系 或称为生物学关系 有所怀疑时 进行遗传关系方面的检查 以便确定亲子关系是否存在 又称为亲权鉴定 个体识别 又称个人同一认定 虽然二者的鉴定目标不同 但使用的方法是一样的 全国高等医药院校教材 分子诊断学 图15 1生物物证分析中HLA基因分型鉴定流程图 全国高等医药院校教材 分子诊断学 二 DNA指纹图谱技术 一个DNA指纹能同时检测十几个甚至几十个位点的变异 反映的基因组信息非常丰富DNA指纹图谱由多个高变位点上的等位基因形成 具有更高的特异性严格遵循孟德尔遗传规律 遗传性简单稳定DNA指纹图谱具有体细胞稳定性 全国高等医药院校教材 分子诊断学 三 STR位点分析 STRs是首选的群体遗传学和法医学研究的遗传标志物美国联邦数据库 CombinedDNAIndexSystem CODIS 公布的13个STR位点 D3S1358 VWA FGA D8S1179 D21S11 D18S51 D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 THO1 TPOX CSF1POAMEL 性别确定基因 全国高等医药院校教材 分子诊断学 AMEL 性别确定基因 Thegeneforamelogenin 牙釉蛋白 canbeusedinsexdeterminationofsamplesfromunknownhumanoriginthroughthePolymeraseChainReaction PCR Usingprimersspecificforintron1ofthegene thegenesequencefortheintroncanbeamplified TheXchromosomegene AMELX givesrisetoa106bpamplificationproduct amplicon andtheYchromosomegene AMELY a112bpamplicon Hence theAMELXcontainsa6bpdeletionintheintron1 优势 CODIS已经广泛地应用于法医DNA分析STR等位基因可以采用商业化试剂盒进行快速检测其数字化信息适于建立计算机资料库全球化的实验室可以促进分析不同人群的STR等位基因频率可以用很微量的DNA进行STR分析 STR位点分析的检测方法 直接荧光标记后进行毛细管电泳PCR RFLPPCR 单链构象多态性 PCR SSCP 探针杂交等多种方法 四 DNA数据库的建立与DNA数据交换 全国高等医药院校教材 分子诊断学 五 性别鉴定与Y基因检测 Y基因检测试剂盒同时检测7个多态性位点 DYS390 DYS389 DYS385 DYS19 DYS389 DYS391 DYS392操作简单方便更科学地识别人种和族