（制糖工程专业论文）仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究.pdf

广西大学硕士学位论文仙人掌提取物的分离及其抑菌件能的研究 仙人掌提取物的分离及其抑菌性靛的研究 摘要 本文对仙人掌提取物的分离及抑菌性能进行研究，包括抑菌谱及最低 抑菌浓度的确定，通过比较不同提取溶剂对抑菌活性的差异，筛选出最佳 的提取剂，探讨了提取物的稳定性，优化了抑菌活性物质的提取工艺，并 进一步对抑菌活性物质进行分离，最后对仙人掌提取物影响微生物正常代 谢的作用机理进行了研究，结果如下： 1 试验确定了仙人掌提取物的抑菌谱，证明仙人掌醇提取物对细菌有 良好的抑制作用，霉菌次之，酵母菌最弱，特别是对大肠杆菌、金黄色葡 萄球菌的抑制作用最显著，其最低抑菌浓度均低达6 2 5 。以大肠杆菌、 根霉和酵母菌为指示菌，研究了仙人掌提取物的稳定性。结果表明，提取 物的抑菌活性具有较好的热稳定性，对紫外光照射稳定，在中性和酸- 陛条 件下的抑菌效果较佳。 2 不同溶剂的提取物的对同一种菌的抑制作用差别较大，其中以甲醇 和7 0 乙醇最好，实验结果依次排序为：甲醇 7 0 乙醇 乙酸乙酯 正 己烷。在相同的时间内，提取液的浓度越高，抑菌率越高；相同浓度的提 取液，作用时间越长，抑菌率也越高。 3 不同预处理方式对仙人掌提取物抑菌活性有一定的影响，以仙人掌 广西大学硕十学位论文仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 千粉提取物的抑菌活性最好。仙人掌提取物的抑菌活性随着溶剂极性的增 大而增强，其中以7 0 的乙醇为最适提取剂。在单因素实验的基础上，采 用r s a 法试验设计，优化出最佳提取条件为：乙醇浓度7 2 ( v v ) 、提取 温度5 8 、料液比1 ：2 7 ( 鲈i l l ) 。在此最优工艺条件下，仙人掌提取物的 抑菌效果最好。 4 对影响仙人掌黄酮类和皂甙类化合物提取率的相关因素进行了分 析，运用l 9 ( 3 4 ) 正交设计试验得出了仙人掌中黄酮类和皂甙类化合物的最佳 的提取工艺条件。 5 仙人掌提取物抑菌机理研究：通过试验发现仙人掌皂甙类和仙人掌黄 酮类提取物对微生物糖酵解、三羧酸、磷酸戊糖等途径均有不同程度的抑 制作用，导致了a r p 和还原力n a d p h 缺乏从而引起了代谢障碍；绘制出正 常大肠埃希氏菌和仙人掌提取物作用下该菌的对比生长曲线，结果表明提取 物主要抑制了细菌对数生长期的分裂；运用s d s 队g e 电泳的方法检测发 现，在一定浓度仙人掌提取物作用下菌体的表达蛋白谱带比正常菌体的表 达蛋白谱带明显减少，一些特有谱带消失，仙人掌黄酮类和皂甙类提取物比 单纯粗提取物对菌体的表达蛋白正常代谢的干扰更强，可以说明仙人掌提 取物对供试菌的细胞内蛋白表达调控机制有一定的干扰作用；运用透射电 镜对被抑制不同时间段的指示菌进行观察可知，供试菌的形态结构受仙人 掌提取物作用发生很大的畸变。总之，仙人掌提取物扰乱了菌体细胞内正 常的代谢活动，导致细胞不再生长、繁殖，达到抑菌的目的。 关键词：仙人掌提取分离正交试验抑菌作用大肠杆菌金黄色葡萄球菌 广西大学硕士学位论文 仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 s t u d yo fs e p a r a t l o na n da n t i m l c r o b i a la c t i v i t y o fe x t r a c t sf r o mo p u n t i a a b s t r a c t i nt h i sp a p e r 尊( m l c t s 丘d mo p u n t i aw 嬲把咖df o fi 协锄血n i c r o b i a la c t i v i t i e s ，i n c l u d i n g i n v c s t i g a t i o no fi 臼a n t i n i i c r o b i a ls p c c 打哪，m i c 砌u e ，n ef e 髂i b l e l v e n t 、】v i t h 咖n g e s t a c t i v m e sw 髂l e c t e da f t c rc o m p a 五n gt l l ed i 岱玳哩l c 船o f 硼曲胁i c r o b i a l t i “t i e so fd i 仃音r e n t c ) 【仃a c t s 凰吼o p 删a 晰t hd i 触l v e n t sb ym e 舔i l f i n gm e i r 删c r o b i a la c t i v 砸e s 1 1 l e p r o c e s s i l l gc o n d i t i o 鹏o fl e t l i n ga c t i v es u b s t a r l c e s 缸啦o p 删aw e o 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t i o n ( m i c ) ：6 2 5 n l em i d d l ei ss e v e r a lm i l d c w s ，t h cm o s tw e a ki s l 妇阳删岁c e sc g 烨v 括f a p t h ee x 把烈s 丘o mo p u n t i aw a ss 诅b l et 0 托m p e r a t u r e 、u l t r a v i o l c t 硼i a t i o l l 锄t i m i c m b i a la c t i v m e sw e r cb c t t e rw h e np h 7 2 1 1 蟛a n t i m i c m b i a la c t i v i t i e so fe ) 【n t i o n b y d i 伍溯l tl 咖t sw 酗 q i l i t e d i 巧珊n t ，m e t l l 托o lm l d7 伊垃h a n o lg a v et h eb e s t s m tf o l l o w o db ye t t l y l 觚吲a t e n o m a l k 燃i nt l l es 锄ea c t i o nt i m e t l l eh i g h e rt h ec o 小期1 n 锄i o no fe x 仃a c t i ，m el l i g h e ro ft i l e i n t l i b i d o nr a t ei s w i t ht 1 1 e 姗ec o n c e i l n a t i o no fe x 旬嗽i o n ，t l l ei o n g 盯t l l ea c t i o nt i i i i ew i l l m 广西大学硕士学位论文仙人掌提取物的分离及其抑苗性能的研究 b r i n gh i 曲e ri 1 1 l l i b i t i o nr 舭 3 0 p l l n i i a 稍t l ld i 瓤嘲粥恤咖e n ts h o w e d 础f e r e n t 趾t h i c r o b i a la c t i v i t i e s d r i e d p o w d e r h a d t l l eb e s ta i l t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s 1 1 1 ea n t i m i c r o b i a ia c t i v i t i e so f e x 仃a c t so f o p i a i n c r c a s e dw i mt h ea d d i n gp o l 赫移o fs o l v e 咄协w 1 1 i c h7 0 e t h a i l o lw a st h cb e s ts o l v e m 矗泔 e x t r a c t i n g t h eo p t i m 啪e x t r 徼t i o nc o n d i t i o mo fl e a c t l i n ga c t i v es u b s t a i l c e sd e t e l m m e db y r e s p o n s es u r f 如e 锄a l y s i sm e t l l o dw e r ea sf o l l o w s ：t | l ec o n c e n n 瞰i o no fe m 卸o lw 觞7 2 ； t e m p e 珊叫f o re ，【臼a c t i l l gw 硒5 8 埘t 1 14 ht h er a t i oo fm 纳喇a la j l ds o l v e n tw a s l ： 2 7 ( m l ) u n d e rm i sc o n d i t i o n ，t l i ea m i m i c m b i a la c t i v i t i e so fe x t r a c t sf r o mo p u n t i ai st h e b e s t 4 t h eo p t i m 啪e x t r a c 6 n gc o n d i t i o n so fn a v o i l i d s 趾d 邺i l i nf b mo p u n t i aw e r e 咖d i e db yn l e 啪yo fl “3 4 ) e x p e r i m m td e s i 驴柚dt 1 1 em a i l lf ；l c t o f se 疗e c t i n gn l ed i s t i ur a l e w e r ea l s od i s c u s s e d 5 1 1 1 es n l d yo f 锄缸i c r o b i a im e c h a n i 锄o f 湘c 乜鼬no p 吼石a ：m ee 0 1a i l de 0 2 i i i l p o s e dd i s t i i l c ti i l h i b d o no nm e t a b o l i ca p p r o a c ho f e m p 、t a 、 玎仰b ym e a s l | r i n g 也e 诫b i t i o nr a t eo f e x p e r i m e n t i 甜l i l i c r o b e sr e l 嘛避t 0e n 巧m a t i ca c t i v i t i e s ，m e i li i l d u c e dt h el a c k o f a r pa t l dn a d p h ；d f a f i e dc o n t r a s lg r o w t hc u r v e so f n o m a l 西拍p r 硼如c d f fa n do f t h e 西砌p r 枷胁c d 席e 彘c t e d b ye o ，s h o w e da n t i m i c r o b i a la c t i o nm a i n l yp r o d u c c da tl o g a 珊l i i i i c p h a s ea n d 锄t i m i c r o b i a lm e c h 锄i s mw a sp o s s i b l et oi n h i b “c e l ld i v i s i o n ；m e s u l to fs d s - 队g es h o w e dm a tt h et o t mp r o “洫c o n 钯i l ti ne x p 耐n l e r 腑dn l i c r o b c sd e c r e a s e d ，s o m eo f t 1 1 e i i ld i s a p p e 盯e do 、i n gt oa 出a c t sd i s t l l r b i l l gt t l en o m l a lm e c h a i l i s mo f c e l l u l a rp r o t e i i l d e v e l o p m e n t ；m ee 胁o f e 0 1 姐de 0 2d i s t w b i n gm en o n n a lm e t a b o l i s mo f e x p c l _ i l i l 咖e d m i c r o b e se x c e e d e dt h a to f o r i 西n a le x 衄c t sf 如mo p 衄t i a ；o b 辩r v a t i o nu n d e r 协m s r i l i s s i o n e l e c n o nm i c r o s c o p er e v e a l e dt 1 1 a tt l l es t m c t i i r eo f c x p e r i m e n t e dm i c r o b e s 、v 勰d e s t r o y e db y t h e “t r a c t s 锄de x p 耐m e n t e dm i c r o b e sc h a n g e ds h a p e s ，l a s t l yc o n s 试c t e di n t ol 硼ep a n i c l e 髓dd i e d i i lc o n c l u s i o i l e x 打a c t s 舶mo p u i l t i ad i s o r d e r e dn o m a lm e t a l ) o l i cp r o c e s ss oa st o t l l ec e l l u l 缸曲n o 彻_ a l 蚵、t t l ee ) p e r i i i l 锄t e dm i c r o b e sc e 嬲i i l gd e v e l o p i i l c m 锄df e p r o d u c i b _ i l 畸，m 妇地l c l ya 出e v e d 峙a n t i 武c r o b i a lp f a p o 1 ( e yw o r d s ：o p 咖t i a ；e x t r a c t i o n 觚ds e p a m t i o n ；o n l l o g o n a le x p e i i m e m ；a t i i i l i c r o b i a l a c t i o n ；e h e r i c l l i ac o l i ；s t a p h y l o c o c c 璐a n l e 璐 鼢警 黔， 广西大学硕士学位论文仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 1 1 论文的选题背景 第一章文献综述 一食品腐败变质主要由物理、化学、酶、微生物四个方面引起，其中微生物的危害最 大，据估算，全世界每年约有l o 2 0 的食品因细菌、霉菌、酵母菌等微生物的侵袭 污染而废弃，造成巨大的资源浪费和经济损失。过去，合成防腐抑菌剂以其使用方法简 便、成本低廉、效果显著等诸多优点而被广泛应用。但随着科学技术的发展，不少合成 化学防腐剂日益暴露出潜在的致癌、致畸作用和易引起食物中毒等问题。如用于肉类防 腐和着色的亚硝酸盐在消化过程中可与脯氨酸形成强致癌剂亚硝胺，防腐和抗氧化剂b h a ( 丁基径基茵香醚) 在动物实验中证明有致癌性，苯甲酸盐也会引起食物中毒。而 另有一些合成防腐抑菌剂究竟对人体有无危害至今尚无定论。而且合成防腐抑菌剂的使 用效果受p h 值影响大，当p h 值大于4 时，效果明显降低。因而目前科技工作者对合 成防腐抑菌剂持谨慎的科学态度，消费者则对非天然的食品防腐抑菌剂非常忌讳。此外， 合成的防腐抑菌剂对生态环境也会产生一些不利的影响。这就需要人们发现和研究一些 具有良好防腐作用的天然防腐抑菌剂，这种防腐抑菌剂不但要求能抑制腐败微生物的污 染和繁殖，还要对人体健康无害，同时不能破坏食品的风味及营养成分。随着人类对自 身健康和环保问题认识的不断提高，健康、绿色食品越来越受到欢迎，天然植物防腐抑 菌剂因其安全有效性而日益受到人们的青睐。而且，许多植物源防腐抑菌剂还有一定的 营养价值和其它的功能特性，如作为着色剂、风味调节剂等，有些还具有一定的生理活 性因子，同时它也顺应着绿色食品发展的潮流，因而从植物中寻找和提取具有一定营养 价值、安全性高的天然食品防腐抑菌剂成为当前天然食品防腐抑菌剂研究的主流【l 。 1 2 天然植物抑菌剂的研究现状 目前，在食品中应用的食品防腐剂有合成防腐剂和从植物中提取的天然防腐抑菌 剂。天然防腐剂按其来源可分为植物源防腐抑菌剂、动物源防防腐抑菌剂及微生物源防 腐抑菌剂。 其中研究较多的包括香辛料、海藻类、树木、中草药及食药用菌等。香辛料的有效 ， j 以 ij i 广丽大学硕士学位论文仙人掌提取物的分离及其抑菌件能的研究 抑菌成分大多存在于精油中【卯。o l l l ik 等研究发现，很多树叶及木材不完全燃烧产生 的物质中含有大量具有杀菌和抑菌作用的脂肪酸、醛及酚类化合物等多种抗菌成分，具 有良好的防腐效果，对常见的多种致病菌有强烈的抑制作用，一些树木的精炼树脂也能 明显延长食品的货架期【s 9 j 。对食品中常见的腐败菌如大肠秆菌、枯草芽抱柯菌等菌的 生长均有不同程度的抑制作用，且抑菌p h 范围广，热稳定性良好。r e i c h e l 发现，海藻 类对多种食品腐败菌具有明显的抑制作用，尤其对革兰氏阳性细菌抑制效果显著【6 ”。 一般认为海藻中的抗菌活性物质是结构特异的卤化物、胆碱、酚类化合物、菇烯类化合 物、单宁和多烯有机酸等【1 0 “i 。常继东等报道，目前至少己发现2 7 属、2 2 2 种食( 药) 用菌中含有抗菌性物质，对几十种常见的食品微生物有明显和广泛的抑菌作用【1 2 l 。许多 中草药不仅具有营养保健功效，还含有多种抗菌成分，对多种常见食品腐败菌具有较强 的抑制能力，且活性p h 范围较宽【1 3 1 4 1 。 1 3 天然植物防腐抑菌剂的应用研究 植物源防腐抑菌剂来源广泛，目前世界上大约存在2 0 0 0 0 种药用植物具有抑菌作用。 我国的中药大词典中收录传统中草药4 7 7 3 种【3 】，其中具有抗菌防腐作用的植物至少 有2 0 0 0 种左右，而且它们的药效和安全性较明确，无毒性。近年来，国内外对植物源杀 菌剂的研究倍受重视，并取得了较大的进展，发现了很多具有开发潜力的抑菌、杀菌或 抗菌的化学成分。 植物提取物中的抗菌物质的有效成分结构类型较多，几乎涉及各类植物成分。在化 学组成上分属于多类化合物，大致可以分为以下几类【1 5 l ：萜类( 如倍半萜类、皂甙类等) 含氧或含硫组分( 生物碱、胺和酰胺) 、脂肪族化合物( 尤其是长链烯烃和脂肪酸) 和 芳香族化合物( 如酚类、联苯甲酰、咕吨酮和苯醌) 。在一种植物中，可能含有多种不 同的抗菌成分，发挥着不同的抗菌作用，包括酚类、生物碱类、皂甙类等，其中每一类 结构又包含多种不同的结构。而在不同的植物中也可能含有同一种抗菌物质，如黄连、 黄柏和三颗针中都含有小蘖碱【1 6 1 。黄连所含的小檗碱且i ； 已人工合成其它化合物对人畜 无毒，并能被细菌同化而不污染环境，因此具有广阔的前景【m 。 植物皂甙有多种多样的生物效应，也包括具有很强的抗菌活性。据中国应用药理学 记载，萨酒皂甙具有广谱抗菌作用，它对溶血性金黄色葡萄球菌，溶血性链菌、肺炎双 球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、百日咳杆菌及其常见的致病性皮肤 2 f t ； 。 ，岔 ； 广西大学硕士学位论文仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 真菌均有较强的抑制性【l s1 9 1 。a m i c o 等从植物扁豆中分离得到三种有抗菌活性的皂甙， 它们对瓜枝孢霉的最小抑菌量分别为5 o 、2 5 、5 opg 【2 0 1 。金继曙等从油菜籽饼中成功 分离出一种抗真菌活性成分油茶皂甙a ，被鉴定为齐墩果烷型的血环三萜皂甙，其对红 色毛癣菌、石膏样癣菌、断发癣菌的最小抑制浓度( m i c ) 为0 1 2 5 1 0 0 0 m 札，对白色 念珠菌的m i c 为o 0 6 2 5 - o 2 5 0 0 m g ，m l 。从三叶草中亦分离出种植物皂角甙能有效防治 一种疫病( p h ”o p h - t l l o r a c i m 啪o i i l i 胁l d s ) ，其作用机理主要在于影响细胞膜的蛋白质、 磷脂及甾体f 2 ”。 从植物中开发天然防腐抑菌剂进行复配抑菌效果的研究当前研究的热点。刘晓蓉用 大蒜、生姜、桔皮提取液以相同体积复配对某些细菌、酵母和霉菌的抑菌效果进行研究 表明抑制效果较好，比苯甲酸钠的抑菌作用强，而且抑菌浓度低，p h 作用范围广，热稳定性 较好，这三种提取液复配具有协同效应( 增效效应) ，可以增强抑菌效果和扩大抑菌谱。 与传统的化学防腐抑菌剂相比，这类天然防腐抑菌物质来源广泛，加工低廉，且可作为 辅助成分改变产品的风味，如在牙膏中添加蜂胶、甘草等已经成为天然产物提取制剂产 业化应用的典型例子。 香辛料是另一种有开发潜力的天然抑菌资源。香辛料作为天然调味料，不但能够满 足消费者对食品添加剂安全性的要求，而且对食品中常见污染菌如大肠杆菌、枯草芽饱 杆菌、绿脓杆菌等都具有较大的杀伤作用。当归、甘椒、潇香、薄荷、肉桂、月桂叶等 对食品中常见的腐败菌和致病菌具有一定的抑制和杀菌效果，其中房香、薄荷、月桂叶 的乙醇提取物对m r 如p 彻| l z m d 缈f c 螂的抑菌效果较好植物中最有效的抑菌成分多存 在于其风味成分中。c a v a l l i t o 等对大蒜中的风味成分进行研究，发现蒜素是其最有效的 抑菌活性物质。实验证明，丁香油对食品中常见的腐败菌和产毒素菌有较强的抑制作用。 苹果中的多种风味成分如己烯醛、酚酸等具有很强的抑菌活性。s e n i is a k 锄a l 【a 通过研 究认为，绿茶中的茶多酚对耐热性饱子的形成有一定的抑制作用。 1 4 天然抑菌物质抑菌效果的微生物测定法 抑菌成分抑菌效果的测定方法，按性质来说可以分为三大类即物理方法、化学方法 及微生物方法。对于那些已经知道成分化学结构的物质，可以用定性定量的化学分析方 法求知其抑菌效力。但对于天然植物提取来讲，其成分多数是未知的，无论是作为医疗 还是添加剂应用，都迫切需要知道这些物质的抑菌或杀菌能力，微生物学法恰能够满足 一0 j t 广西大学硕士学位论文 仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 这个要求。从目前的研究成果来看，微生物学法大致可以分为扩散法、比浊法、稀释法 三大类。 1 扩散法 扩散法是在固体培养基融化凝固前接种试验菌待凝固后，将待测品用不同的方法放 在培养基上，待测样品在某一溶剂的带动下在培养基内呈放射状扩散。抑菌物质在培养 基中的浓度，随离开扩散原点的距离增大而降低，离扩散原点越远处，培养基中抑菌物 质的浓度越低。当培养基中抑菌物质的浓度恰好高于该抑菌物质对实验菌的最低抑菌浓 度时，试验菌的生长破抑制，形成透明的抑菌圈。从理论上讲，抑菌范围的大小可以作 为抑菌物质生物效价评定的依据。管碟法和滤纸片法是扩散法的典型代表。 2 比浊法 比浊法如同稀释法中所提到的那样，将不同量的被检样稀释液加入到液体培养基 中，根据浊度的变化观察试验菌的生长情况。由于少量抑菌物质的存在，使试验菌的生 长受到不同程度的抑制，而产生不同程度的浑浊。因而比浊法终点的观察不是根据试验 菌生长与否作为终点的判断，而是借助其抑制试验菌生长的速度不同而定。 3 稀释法 稀释法是将含有不同剂量抑菌物质的培养基，依次分装在容器中，并于各个容器内 加入对该抗菌物质有高度敏感性的试验菌，经过一定时间和温度的培养，观察其对菌体 生长的抑制情况，确定其最低抑菌浓度。作为稀释法的终点有以下两种情况：( 1 ) 试验 菌的生长被抑制；( 2 ) 试验菌的某一生理功能被阻碍。 1 5 天然植物提取物抑菌机理 抗菌机制是国内外医药、生化等领域研究的重大课题之一，各种抗生素、抗菌药物、 抗菌中草药以及某些食品防腐抑菌剂都具有一定的抗菌活性，能通过某一途径作用于微 生物的某些特殊靶位，达到抑制或杀灭微生物的目的。这些特殊靶位主要是：细胞壁、 细胞膜、蛋白质、核酸等。g o l l l d 根据大量的试验观察，把抗菌机理归纳为三个方面：( 1 ) 作用于细胞壁和细胞膜系统，破坏其屏障作用，使细胞不能生长繁殖；( 2 ) 作用于遗传物 质或细胞微粒结构，阻碍遗传信息的复制；( 3 ) 作用于酶或功能蛋白，使细胞丧失生长繁 殖的物质基础。 很多植物以及食用香料提取物的抑菌作用已得公认。但提取物与其他因素结合时对 4 毒 。 一 i 广西大学硕士学位论文 仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 微生物生长的效果报道并不多。它们能否完全或部分取代普通的防腐抑菌剂来抑制腐败 和致病菌还需要单独评价并与其他传统保藏因素如保藏温度、p h ，水分活度、其他防腐 抑菌剂、气调结合起来考虑。这些研究结果将有助于产品开发研究人员快速确定这些保 藏因素的影响。 c o e r 和b e u c h a t 提出，香精油对霉菌的抑菌活性是打乱很多参与能量产生和结构 成分合成酶系统的结果。当酚类物质与细胞膜交互作用时，与膜上的酶和蛋白质相互作 用，导致质子的反方向流动，影响细胞活性1 2 2 1 。j u v e n 等发现百里香香精油、庸香草酚 或香芹酚浓度与抑菌效果无直接联系。但经过一个特定的浓度( 临界浓度) 后， s 卯 砌“r f 删的活细胞有快速而剧烈的下降。酚类物质可以使细胞膜敏感化，当作用点 饱和后，细胞膜整体会严重损伤，快速瓦解，从而减少细胞质体的组分田堋。b 瑚e n 等使用电子显微镜，发现没有经过酚类物质处理的细胞比较光滑，而酚类物质处理2 4 h 后的细胞粗糙并有不规则的表面结构【2 5 】。k 她唿和e l 1 硼d 报道酚类物质的效果有两水 平的，在细胞壁和膜水平结构上，以及在微生物的生理反应上。酚类物质可以使负责抱 子发芽的酶令性或与袍子发芽过程必要的氨基酸相互作用【2 仉。砒c o m u z 等发现橄榄 中的酚类物质对s d “愆淞在细胞膜水平上没有作用，由此推断酚类物质抑菌并不是单一 机理，而是很多种作用的综合。与袍子发芽过程必要的氨基酸相互作用。融c om u n o z 等发现橄榄中的酚类物质对s 口埘p 搬在细胞膜水平上没有作用，由此推断酚类物质抑菌 并不是单一机理，而是很多种作用的综合【2 7 。 k n o b l o c h 等报道了萜类的抑菌机理，通过研究了多种萜类对菌类的初生能量代谢、 n a d h 及丁二酸脱氢酶( s d h ) 活性、呼吸过程的电子传递过程的影响作用，发现在5 1 旷3 m o l l 浓度下，所有供试萜类都能抑制上述反应，可能影响菌类的呼吸作用及细胞膜 功能，从而起到抑菌的作用嗍。k n o b l o c h 等对植物芳香型精油的抗菌性能进行了研究， 提出在水相中的溶解度与精油中有效成分透过细胞壁而进入菌体的能力直接相关，而抗 菌性则基于抗菌剂在菌体细胞膜双磷脂层中的溶解度；精油中的类萜类降低生物膜的稳 定性，从而干扰了能量代谢的酶促反应的观点1 2 9 3 0 1 。n i k a i d o 等则报道毛桃和杏核精 油是通过抑铝4 磷酸二酯酶活性而起作用【3 1 】。 g o c h o 对来源于植物的2 6 种芳香族化合物的抗菌效果进行了研究，根据对湿孢子 有效而对干孢子无效的试验结果，提出桂醛、茴香脑等有效芳香抗菌成分的抗菌性是基 于孢子对抗菌剂的吸收而起作用的看法。y 0 r k 等发现山梨酸的抗菌作用主要是基于抑 制微生物细胞中的各种酶，如烯醇酶、天冬氨酸酶等，利用双键与酶的硫氢基形成共价 5 广西大学硕士学位论文 仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 键，使酶中的硫氢基失去活力。如苯甲酸也能以各种方式干扰细菌细胞中酶的结构，阻 碍柠檬酸循环路线中的代谢作用，尤其是阻碍a 一酮戊二酸与丁二酸的脱氢酶循环。中 草药黄连中的有效成分小蘖碱( b e r b e 血e ) 主要是抑制酵母和细菌糖代谢中间环节的丙酮 酸氧化脱羧过程，从而抑制微生物的生长【3 23 3 1 。王理达等办发现2 4 ( r s ) 2 5 e p i m i n 0 1 a n o s te r o i 具有抑菌活性，其作用机理主要在于抑制甾醇生物合成途径口】。新制绿茶或茶 叶提取物均有一定的抗菌性能，主要成分是香叶醇、芳樟醇、正辛醇。其抗菌机理主要 是抑制微生物电子传递链从而抑制能量代谢，抑制微生物酶，特别是半胱氨酸中巯基、 组氨酸中咪唑基等电子中继系统的酶的活性【3 53 6 】。 1 6 仙人掌的成分及其抑菌作用 1 6 11 山人掌简介 仙人掌属植物( 印埘蚴属于热带及亚热带植物，多生长于美洲及墨西哥干旱荒漠或 半荒漠地区，其中以墨西哥分布最多，享有“仙人掌王国”之美誉。本属植物全世界约有2 5 0 种，在中国野生的仅有两种，仙人掌( 叩“n ，蛔击妇 甜脚刑) 及绿仙人掌( 印堋砌m 伽口c 鲫胁口 吼聊) ，分布于福建、广东、云南、广西、四川、贵州等地。此外，我国各地还引入了多种 供观赏用的仙人掌1 3 7 3 引。 在本草中，最早记载仙人掌的为群芳谱，后来的植物名实图考一书亦有较详 细的记载，其异名有龙舌( 桂平县志) ，老鸦舌( 南安府志) ，神仙掌、霸王( 本草 求原) ，观音掌、观间刺( 贵州民间方药、广西兽医药用植物) 。 仙人掌在我国做为药用首载于我国清代赵学敏所著的本草纲目拾遗。据该书记 载，仙人掌味淡性寒，入心、肺、胃三经功能行气活血，清热解毒，消肿止痛，健脾止 泻，安神利尿，可内服外用治疗多种疾病，如心胃气痛、痞块、痢疾、痔血、咳嗽、喉 痛、肺痈、乳痈、疔疮、烫火伤、蛇伤等3 9 1 。由于仙人掌属植物具有资源极为广泛， 栽培简单、省力，而且适于干旱荒漠地区生长，基本上无病虫害，种植过程中无需施用农药 加之可供食用、营养丰富，还具有较强的药理作用，所以备受人们青睐，人们对仙人掌的研 究也日益增多。 6 广西大学硕士学位论文仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 1 6 2 仙人掌的生理活性 仙人掌水提物是仙人掌茎水提液经乙醇除多糖和减压浓缩后的乙醇沉淀物的水溶 液，主要含有机酸和小分子糖类：仙人掌的乙醇粗提物主要含有生物碱、黄酮甙、皂甙 等甙类，其中皂甙可能为三萜类皂甙，也可能为甾体皂甙，仙人掌的乙酸乙酯粗提物主 要含有黄酮类物质，皂甙类等物质。上述物质都是些具有强烈的或特殊的生理作用的生 理活性物质。因此，仙人掌主要的生理活性有以下几个方面： 1 消炎作用：仙人学提取物对会黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢 杆菌、蜡状芽孢杆菌有抑制作用。民m 用仙人掌治疗乳腺炎、腮腺炎，都有较好的疗效。 国内对仙人掌抗炎活性作了很深入的研究，实验证明，新鲜的仙人掌水煎液给小鼠p d 或 给药，均有抗炎作用。能抑制炎症过程中毛细血管通透性增加和减轻水肿，又能降低棉球 诱发的小鼠肉芽组织增生，且对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能有明显的促进作用，对急 性炎症和慢性炎症均有明显的抑制作用【帅l 。 2 镇痛作用：仙人掌三萜皂甙对小鼠有明显的镇痛作用，镇痛率为1 0 0 ，比颅痛 定( 镇痛率为7 8 ) 的效果好【4 “。 3 免疫作用：仙人掌水提取鲜液和熟液分别垃给药，对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功 能均有明显促进作用。仙人掌提取液对唾液淀粉酶有激活作用，是因为其中含有胰淀粉酶 激活剂氯离子【4 2 j 。仙人掌提取物具有促进抗体生成，增强网状内皮系统功能，明显提高机 体的体液免疫功能的作用表明其对细胞免疫的作用不明显。采用高效液相色谱法测定仙 人掌提取物的主要成分为槲皮素，含量为o 4 8 5 9 伥g 【4 3 1 。 4 降血糖作用：早在1 9 2 5 年，s h e l l s h e a r s 等发现仙人掌果实的水提物能降低血糖浓 度。1 9 3 7 年，( 加w e l l 等也报道了该水提物中含有能降低糖尿病人血糖的活性物质。1 9 6 2 年，以色列人报道了仙人掌全株的水和有机溶剂混合提取液能降低血糖。1 9 9 4 年，南非 专利中收载了仙人掌水浸提物治疗糖尿病。国内临床药理研究表明，仙人掌提取物具有明 显的降血糖作用，能有效地改善i i 型糖尿病患者的糖代谢【州。本实验条件下仙人掌能明 显降低s t z 致糖尿病小鼠的空腹血糖和餐后2 h 血糖，特别是仙人掌能使空腹血糖降低 至正常水平，多种仙人掌属植物可作食用，在美洲和墨西哥的传统医药中用于治疗糖尿 病，国内外一些学者研究发现，仙人掌及其不同配伍，剂型能缓解糖尿病l f 每床症状，控制 和降低某些糖尿病人的血糖，胆固醇和甘油三酯郴l ，仙人掌提取物能保持糖尿病大鼠 经胰岛素降至正常水平的血糖值。 7 广西大学硕士学位论文 仙人掌提取物的分离及其抑苗性能的研究 5 抗胃溃疡作用：仙人掌提取物给大鼠加对应激型、消炎痛型、结扎胃幽门型胃 溃疡皆有明显的治疗作用，并且可明显提高胃液中前列腺素e 2 的含量【绷。 6 抗脂质过氧化作用：仙人掌有很好的临床抗炎作用。对小鼠的实验表明，仙人掌 水提液能明显促进巨噬细胞吞噬功能，用药后吞噬百分率是对照的2 2 0 ；能降低醋酸所 致的小鼠皮肤毛细血管通透性增高以及二甲苯引起的小鼠皮肤毛细血管通透性增高，其 作用强于氢化可的松1 4 8 4 9 1 。 7 仙人掌抑菌作用：仙人掌中的多种成分，如生物碱、简体化合物、黄酮类、皂 甙类、酸性物质( 如芥子酸、异阿魏酸、咖啡酸、果酸等) 等都有抑制微生物生长的作 用。仙人掌的抑菌作用可能是上述多种抑菌组分综合作用的结果。赵声兰等以新鲜仙人 掌和仙人掌干粉为原料研究对腐败菌和致病菌的抑制作用。结果表明，仙人掌提取物对 几种常见腐败菌和致病菌有明显和广泛的抑制作用。其中仙人掌乙醇提取物、乙酸乙酯 提取物对巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、青霉菌、枯草芽孢杆菌的抑制效 果比较好【地扎5 2 】。m i m u m 从仙人掌中提出了对细胞损伤有保护作用的八肽化合物【5 3 1 。 意大利人报道了仙人掌提取物能抑制细菌繁殖的第四期，而对宿主细胞无任何损割铷。 人们还发现仙人掌有抗病毒活性【s 5 】。仙人掌提取液也能抑制d n a 和r n a 病毒的复制， 并使细胞外病毒失活惭l 。可被抑制的病毒包括流感病毒、呼吸道合胞病毒和免疫缺陷病 毒。 1 6 3 仙人掌抑菌活性成分的提取方法 1 溶剂浸提 固液浸取是用溶剂从固体原料中提取有效成分，浸取的原料多数是溶质与不溶性固 体组成的体系，所用的溶剂必须具备与所提取的溶质互溶的特性。固液浸提所选用的溶 剂首先要能有选择地溶解提取物质，这样有利于后续的纯化分离；其次，溶剂对溶质的饱 和溶解度要大，这样可以得到高浓度的浸提液，若溶质在所选的溶剂中的溶解度小，就 需要消耗较多的溶剂，在进行溶剂回收时，就需要消耗较多的能量；第三需要考虑溶剂的 物性，从溶剂回收的角度来看，沸点应该低一些，因为如果在常压下进行操作，沸点将 成为浸取温度的上限，而且粘度和密度对扩散系数、固液分离、搅拌的动力消耗均有影 响另外，还必须考虑溶剂的价格、毒性、燃烧、爆炸、腐蚀性、对环境的污染等有关 问题。若提取物应用于医药和食品行业，则溶剂的无毒、无色、无味等是至关重要的方 8 广西大学硕士学位论文 仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 面。 2 微波助提 微波的快速高温处理可以将细胞内的某些降解有效成分的酶类灭活，从而使有效成 分在药材保存或提取期间不会遭受破坏。从细胞破坏的微观角度看，微波加热导致细胞 内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热量，使细胞内温度迅速上升， 液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，从而利于生物活性成 分的提取，如从薄荷中提取精油。 3 超声波助提 利用超声波产生的强烈振动、较高的加速度、强烈的空化效应、搅拌等特殊作用， 可以破坏植物细胞，使溶媒渗透到材料细胞中，促使待提取原料中的化学成分溶于溶媒 中，再通过分离提纯得到所需的化学成分。 4 酶法提取 将纤维素酶、果胶酶等作用于原材料，可以使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤 维素等物质降解，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分向提取介质扩散的传质 阻力，从而可有效提高活性成分的提取率。 1 6 4 仙人掌抑菌剂开发意义 仙人掌提取物不仅具有良好的防腐性能和抗氧化性能，而且还具有医疗、生理保健 功能，是一种十分理想的天然绿色食品及添加剂。对仙人掌的抑菌功能人们早已有所认 识，特别是在研究得知仙人掌中富含类黄酮化合物等多种有效成分后，许多国家加大了 对仙人掌资源的开发力度。关于仙人掌的抗菌活性的研究受其器官发育、生长期、加工 方法、提取条件等多种因素制约从而表现出其抗菌活性在不同的实验中略有不同。但迄 今为止，对仙人掌提取物的抗菌、抗氧化作用报道较多，而对于确定提取条件、检测方 法等涉及生产的问题报道较少，国内外对仙人掌抗菌防腐性能的研究大多局限于仙人掌 提取混合物的抗菌性能上，对仙人掌中抗菌活性的机理的研究不多，这都不利于仙人掌 抗菌资源的开发利用。本研究在前人研究的基础上，对影响仙人掌抗菌作用的因素及仙 人掌提取液的抑菌机理进行了深入的研究。并将仙人掌提取液进行初步分离、纯化得到 两种活性成分，为仙人掌抗菌资源的合理开发利用提供一定的理论基础和科学依据。 9 广西大学硕士学位论文仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 第二章仙人掌抑菌作用及其稳定性分析 本章选用食品中具有代表性常见的细菌、霉菌、酵母菌等腐败菌，通过确定仙人掌 提取物的抑菌谱和测定其最低抑菌浓度，筛选出对仙人掌提取物抑制作用敏感的菌，作 为试验的指示菌。研究各种物理、化学条件下提取物的稳定性及对抑菌能力的影响。 2 1 材料和方法 仙人掌：由广西农业高新技术展示园提供； 菌种和培养基：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，根霉、曲霉、青霉、 毛霉、酿酒酵母。以上菌种由广西大学生命科学与技术学院微生物实验室提供； 细菌培养基；牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l 5 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 o 7 2 ： 霉菌培养基：马铃薯( 切碎成块) 2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ，水l 0 0 0 1 1 ：l l ，p h 自然； 酵母菌培养基：葡萄糖2 0 9 ，蛋白胨l o g ，酵母膏1 0 9 ，琼脂5 2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ， p h 自然； 液体培养基：培养基中不添加琼脂即可；l b 培养基： 试剂：石油醚、苯、乙醚、甲醇、乙醇、正丁醇、浓硫酸、香草醛、乙酸、6 苯 甲酸钠、生理盐水( o 9 n a c l ) 、o 1 m o l lh c l 、o 1m o l l n a o h 溶液； 3 0 丙烯酰胺( a c r y l 锄i d c ) 甲叉双丙烯酰胺( 3 0 ：0 8 ，2 7 c ) 、甘氨酸( g l y c i n e ) 、三 羟甲基氨基甲烷( 喇s ) 购自b i o r a d 公司，n ，n ，n ，n - 四甲基乙二胺( t e m e d ) 、c h a p s 购自s i g m a 公司； 仪器： 电热鼓风干燥器上海实验仪器厂有限公司 生化培养箱l r h - 2 5 0 a广东省医疗器械厂 数显恒温水浴锅h h 2 国华电器有限公司 旋转蒸发器r e 5 2 9 8上海亚荣生化仪器厂 1 0 广西大学硕士学位论文 仙人掌提取物的分离及其抑菌性能的研究 循环水式多用真空泵s h b b 8 8 高速组织捣碎机d s 1 超声波清洗机s b 5 2 0 0 d 超净台( a i rt e c h ) 立式压力蒸汽灭菌器l s b 5 0 l 电子天平p l 2 0 0 2 微型螺旋混合仪、阳- 2