（生物化学与分子生物学专业论文）硫杆菌分离鉴定及无机硫氧化系统研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位淦文中凡引用他人已经发表或未发 表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明 引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研 成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：堡堑=i j 期：坦! ：! ! 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定， 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：坠煎导师签名：盏边! 日 期：和丛八 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 中文摘要 硫杆菌( a c i d i t h i o b a c i l l u s ) 具有以无机态硫化物作为能源物质的能力，能氧化 单质硫、多硫化物、硫酸盐和金属硫化物等，在生物冶金过程中浸出金属硫化矿物、 煤炭中除硫等方面发挥了重要的作用。 本研究从矿山酸性坑水中分离出一株氧化硫硫杆菌，命名为a c i d i t h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s l d 一1 。文中对l d 1 进行形态学研究，确定该细菌为革兰氏阴性杆菌，长 约1 - 1 5 微米，极生鞭毛；生长特性方面，测定了该菌的生长p h 为o5 50 ，最适生 长p h 为2 。3 5 左右；生长温度为2 5 3 s ，最适生长温度为3 0 。c ；l d 1 能以无机态 的单质硫和低价态硫化合物作为能源物质，氨基态氮作为氮源，以空气中的c o ：作 为碳源。通过1 6 sr d n a 和( g + c ) 含量测定，确定l d 一1 为氧化硫硫杆菌( a t t h i o o x i d a n s ) 的一株。为了使l d 一1 更好的适应工业浸出环境，对其进行了重金属离 子耐受驯化，最终得到能够耐受4 0 9 ln i 2 + 的耐受菌株。 从b y - 3 、l d 一1 、a t c c1 9 8 5 9 等菌株中分离出了能氧化四硫化物的四硫化物水 解酶，并对该酶进行了生化指标测定，得到如下结论：在l d 1 中，最适反应p h 为 3 0 ，最适反应约温度为4 0 。c ；在b y - 3 中，最适反应p h 为30 ，最适反应温度约为 4 5 。c 。对于不同菌株的四硫化物水解酶的活性也进行了对比测定，其中，在反应p h 为3 0 ，温度为3 0 。c 时，在培养物和分离纯化后的酶液中，b y - 3 和l d 1 比a t c c1 9 8 5 9 中活性较高。 关键词：氧化硫硫杆菌分子鉴定生物浸矿浸矿机理无机硫氧化四硫化物水解酶 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 a b s t a c t a c i d i t h i o b a c i l l u sg e n e r a l l yh a v et h ea b i l i t yt od e r i v ee n e r g yf r o mi n o r g a n i cs u l f u r c o m p o u n d s ，s u c ha se l e m e n t a ls u l f u lp o l y s u l f i d e , a n dm e t a ls u l f i d et h i sa b i l i t yh a sb e e n a p p l i e dt ot h eb a c t e r i a ll e a c h i n go f s u l f i d eo r e s ，d e s u l f u r i z a t i o no f c o a la n ds oo n i nt h i sp a p e r , as t r a i ni fa c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n sw a si s o l a t e df r o ma c i dm i n e d r a i n a g e ，a n dn a m e da t t h i o o x i d a n sl d 一1b ym o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，l d 一1l e n g t h 1 - 2 u m ，g 一，s i n g l ep o l a rf l a g e l l a f o rt h eg r o w t hf e a t u r e ，i tc a ng r o w t hu n d e rp h0 5 - 5 0 ， a n dt e m p e r a t u r e2 5 3 5 。ct h eo p t i m a lc o n d i t i o nf o rg r o w t hi sp h17 5 ，3 0 cl d 1i s a b l et od e r i v ee n e r g yf r o me l e m e n t a ls u l f u ra n do t h e ri n o r g a n i cs u l f u rc o m p o u n d s ，u s e a m i n on i t r o g e na sn i t r o g e ns o u r c ea n dc 0 2a sc a r b o ns o u r c e b a s e do n1 6 sr d n aa n d g + cm o l er a t i o l d 一1b e l o n g st oa t t h i o o x i d a n si no r d e rt op r e f e r a b l ea d a p tt oi n d u s t r y l e a c h i n ge n v i r o n m e n t ，h i g h e rc o n c e n t r a t i o no fo r e sw a su s e dt od o m e s t i c a t el d 一1s t e pb y s t e pb yt h i sm e t h o d ，l d 一1c a nt o l e r a t e4 0 9 ln i 2 + at e t r a t h i o n a t e h y d r o l a s et h a tc a t a l y z e st e t r a t h i o n a t eh y d r o l y z e s t oo t h e rs u l f u r c o m p o u n d sw a sp u r i f i e df r o ml d 一1 ，a l s of r o mb y - 3a n da t c c1 9 8 5 9t h ep u r i f i e d e n z y m eh a do p t i m u ma c t i v e t ya b o u tp h3 0a n d4 0 。ci nl d 一1 ，p h3 0a n d4 56 c i nb y - 3 d i f f e r e n t i a t i o no ft h ee n z y m ea c t i v ei nd i f f e r e n ts t r a i nw a sd e t e c t e di nt h ec o n d i t i o no f p h3 0 ，3 0 。c ，l d 一1a n db y - 3h a dh i g h e re n z y m ea c t i v e i t yt h a na t c c1 9 8 5 9e r h e ri nc e l l c u l t u r eo rp u f f f y i e de n z y m e k e yw o r d ：a c i d r h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s , m o l e c u l a rb i o l o g i c a l d e n t i f i c a t i o n ， b i o l e a c h e i n g ，m e c h a n i s mo f b i o l e a c h i n g ，o x i d a t i o no f i n o r g a n i cs u l f u rc o m p o u n d s ， t e t r a t h i o n a t eh y d r o l a s e 4 兰型查兰堡主堕壅竺兰、业堕塞 塾些堂堑堕坌塞竺塞垦堕塑垡墨堑堡塞 一一一黪 崩自x 英文缩写 爿t t a t 。f s d s p a g e e d l a p c r p m s f d m s o t e n d 缩略词表 英文名称 a c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s a c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i c p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h e n y l m e t h y l s u f o s y l d i m e t h y ls u l f o x i d e n ，n ，n 。，n 。一t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 5 中文名称 氧化硫硫杆菌 氧化压铁硫杆菌 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 乙二胺四乙酸 聚合酶链式反应 苯甲基磺酰氟 二甲基亚砜 四甲基二乙胺 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 i 生物湿法冶金 第一部分前言 生物浸出( b i o l e a c h i n g ) 是指使不能溶解的金属，通常为金属硫化物，) c u s ， n i s ，z n s 等转化为可溶状态，通常是金属的硫酸盐，如c u s 0 4 ，n i s 0 4 ，z n s 0 4 ，当 这个过程发生时，金属被溶解于水中，所以这个过程成为生物浸出。因为这是一个 氧化的过程，所以，也可以称为生物氧化( b i o o x i d a n s ) 。然而，生物氧化却通常还指 在细菌的侵蚀作用下，是化合态的金属变成为还原态，而金属还原态是不溶的。例 如从砷黄铁矿中得到还原态的金的过程中，金在被生物氧化氰化物氧化之前仍旧在 矿石中。因此生物浸出这个概念对于金的还原( 即使砷，离子和硫被生物浸出) 是 明显不适合的。生物冶金( b i o m i n i n g ) 通常就是对这两个进程的总称。( der a w l i n g s ， 2 0 0 2 ) 生物湿法冶金( b i o h y d r o m e t a l l u r g y ) 与传统冶炼工艺相比，它有能耗低、综合利用 资源、投资和操作费用少、对环境友好等特点，并能够处理用传统冶金方法不能或 难以处理的低品位或难处理原矿、尾矿，在国内夕卜已经被广泛研究并应用于工业实 践。 1 9 4 7 年，c o l m e r 和h i n k e l 首次从酸性矿坑水中分离出一种能氧化硫化矿的细 菌氧化亚铁硫杆菌( z d ( a r c o m l e ra n d me h i n k e l ，1 9 4 7 ) 。1 9 5 4 年lcb r y e r 和j vb e c k 在u t a h b i n g h a mc a n y o n 铜矿矿坑水中发现了相同的细菌一氧化亚铁硫 杆菌和氧化硫硫杆菌( zt h o o x i d a n s ) ，他们的实验结果表明氧化亚铁硫杆菌能浸出 各种硫化铜矿及辉钼矿，但浸出辉钼矿则必须要有黄铁矿的存在( icb r y n e re t a 1 1 9 5 4 ；i cb r y n e r e t a l l 9 5 7 ；icb r y n e re ta 1 1 9 5 8 ) 。1 9 5 5 年，s r z i m m e r l e y ，d gw i l s o n 和j d p r a t e r 首次申请了生物堆浸的专利( s rz i m e r l ye ta 1 1 9 5 8 ) ，并将 改专利委托给美国k e n n e c o t t 铜矿公司，该公司在o t o h 矿首先将细菌浸铜工艺应用 于工业生产中，并获得成功。这是第一个有关细菌浸出技术的专利，从而推动了生 物冶金技术的发展。从这时开始，生物湿法冶金进入现代工业应用。目前生物冶金 技术己在铜、铀、金的提取方面获得成功商业应用。 迄今为止，微生物浸出技术在工业生产中应用最多的是回收铜( gjo l s o ne ta 1 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 2 0 0 3 ) ，所处理的矿石都是贫矿、废矿、或表外矿。矿石中的铜品位一般低于o 5 ， 由于微生物浸铜工艺成本低廉，才使得这部分废弃矿石得以利用。因此，低品位铜 矿石的微生物堆浸工艺目前具有很大的吸引力，对许多老铜矿矿山的生存起着及其 重要的作用。其次是难处理金矿石的微生物预氧化处理工艺。这类难处理金矿石主 要是因为金属硫化矿( 如黄铁矿、砷黄铁矿、毒砂等) 对金颗粒形成包裹。浸出剂 无法与金接触所致。利用微生物对这类矿石进行预氧化处理，可以将硫化矿物包裹 层破坏掉，从而提高金的氰化浸出率。由于利用微生物进行氧化成本低、投资少且 不污染环境，所以这种工艺被普遍认为是一种很有发展前途的新技术( 张永柱， 1 9 9 2 ) 。 近几年来这项技术得到了迅速的发展。有二十多个国家开展了微生物在矿冶工 业中的应用，研究日益深入广泛。继铜、铀、金的生物湿法提取已实现工业化生产 之后，钴、锌、镍、锰也正由实验室研究转向工业化生产过渡( gj o l s o ne ta 1 2 0 0 3 ) 。 国外以南非、澳大利亚、美国和加拿大在工业应用和研究中处于世界领先地位。美 国和智利利用生物湿法冶金提铜分别占本国所产铜总量的1 1 年t l2 0 以上( k i r ke t a l1 9 7 9 ；国家矿产储量管理局，1 9 9 3 ，) 。加拿大已建成堆浸的低品位铜矿和铀矿( g j o l s o ne ta l2 0 0 3 ) ，目前，微生物浸出研究十分活跃，有的已用于生产，有的正由 实验室向工业应用过渡。微生物浸出技术具有巨大的潜力和广阔的应用前景。 在国内，微生物浸矿的专业研究最早起始于二十世纪六十年代，中科院微生物 研究所对铜官山铜矿进行实验研究，取得了突破性的进展( 王淀佐，2 0 0 1 ) 。八十自 九十年代，中科院微生物研究所、中科院化工冶金研究所、昆明理工大学、东北大 学等分别对铜、镍等低品位矿的生物提取及高砷金矿预氧化的理论及工艺进行了广 泛的研究( 雷云等，2 0 0 0 ) 。九十年代中后期，低品位铜矿生物提取工艺已在江西铜 业公司德兴铜矿成功应用，并建成年产2 0 0 0 吨电解铜的堆浸厂，是我国建成的第一 个生物提铜工厂( c o r a l ele ta 1 1 9 9 9 ) 。 2 生物湿法冶金中常用细菌 生物湿法冶金中常用细菌在生理上都有一些共同点：他们都是化能自养( 或者异 样) 细菌，能够以f e 2 + 或者无机硫( 或者二者都有) 作为电子供体。由于在硫氧化 过程中，有硫酸作为副产物，因此，这些细菌都能够在p n1 5 - 2 0 下生长。或许是 由于这些细菌生活在矿物富级的环境中，通常这些细菌都具有很强的金属离子耐受 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 能力( de ，r a w l i n g s2 0 0 1 ；de r a w l i n g s2 0 0 2 ：f kc r u n d w e l l2 0 0 3 ) 。 2 1 氧化亚铁硫杆菌 氧化亚铁硫杆菌( a c i d i t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ，简称彳tf 以前称为t h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s ) 是最先发现能够氧化金属矿物的细菌。在营养方面j 氧化亚铁硫杆菌通 常被认为是专性白养细菌，但是，也有人( ed o n a t ie ta l1 9 9 7 ) 提出，在无氧环境 下，氧化亚铁硫杆菌可以在铜蓝中浸出金属钢。 氧化亚铁硫杆菌可以利用亚铁离子以及多种无机硫化物作为电子供体( 伯杰细 菌鉴定手册第八版) ，实际上可以氧化f j + 、元素硫与几乎所有的硫化矿物 ( s c h i p p e r sa e ta l1 9 9 9 ；m a r i ae ta l2 0 0 1 ) 。因此，多年以来，氧化亚铁硫杆菌都被 认为是4 0 以下的生物湿法冶金过程中最重要的细菌。目前已经很清楚的了解到， 铁离子浓度过高是不利于氧化亚铁硫杆菌生长的，因为f e ”本身就是一种重金属离 子，浓度过高会抑制细菌的生长( l gl e d u ce ta l1 9 9 7 ) 。氧化亚铁硫杆菌在2 0 一3 5 摄氏度的温度、p h1 8 - 2 0 以及一定量的亚铁离子环境中，可以快速生长，并且将亚 铁离子氧化成为铁离子。也可以在没有亚铁离子的情况下，氧化单质硫或者无机硫 化物。氧化亚铁硫杆菌引起人类极大兴趣的原因在于其非常原始的生活方式，即： 只需要空气提供其生长所必须的碳源、氮源和氧，就可通过氧化矿石中包含的f e 2 + 离子及还原性硫化物获取能量，生成的f e ”在酸性环境下作为一种强氧化剂，把矿石 中不溶性的金属离子硫化物氧化成水溶性的状态( fkc m n d w e l l2 0 0 3 ) 。a t ，因其 对浸矿和治理环境污染的重要性而倍受关注，它可以从矿石中溶出金属，如铜，铀， 钴等，还可以去除工业废水或土壤中的重金属，进行煤脱硫以避免造成腐蚀和大气 酸沉积( hl e h r i l i c h2 0 0 1 ) 。 2 2 氧化硫硫杆菌 氧化硫硫杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，类似于氧化亚铁硫杆菌，在分类上2 0 0 0 年以前都隶属于硫杆菌属( t h i o b a c i l l u s ) ( 伯杰细菌鉴定手册，第八版) ，1 6 sr r n a 分析表明，硫杆菌属包括氧化硫的一些细菌属于变形细菌( p r o t e o b a c t e r i a ) 的一，6 和v 一分支，最后硫杆菌属分离开成为了个新的属嗜酸性硫杆菌( a c i d i t h i o b a c i l l u s ) ( dp k e l l y ，2 0 0 0 ) ，这个属包括a t f e r r o o x i d a n s ，a t t h i o o x i d a n s 和a t c a l d u s 等， 兰州大学硕士研究生毕业论文 氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 氧化硫硫杆菌是一种严格好氧的自养型细菌，具有非常强的氧化无机硫的能力，它 不但可以氧化单质硫，还可以氧化多种硫酸盐和一些金属硫化物，在生物湿法冶金 中作用非常明显。氧化硫硫杆菌不能氧化二价的亚铁离子，只可以氧化一些特定的 金属硫化矿物( ws a n de ta l2 0 0 1 ) 。但是氧化硫硫杆菌可以和氧化亚铁硫杆菌混合 培养进行浸出实验研究，k s a s a k i 等人提出，两种细菌混合对黄铁矿的浸出率略高 于单一的氧化硫硫杆菌或者氧化亚铁硫杆菌，但氧化亚铁硫杆菌处于绝对主导地位 ( ks a s a k i1 9 9 7 ) ，a g i a v e n o 和ed o n a t i 实验证明氧化硫硫杆菌和氧化亚铁硫杆 菌混合浸出硫化镍矿比单种氧化亚铁硫杆菌有更高的效率( ag i a v e n oe ta 1 2 0 0 1 ) ； 陈泉军等认为，氧化硫硫杆菌的加入，有利于对p h 的控制，并实验证明氧化亚铁硫 杆菌和氧化硫硫杆菌混合比例为2 ：1 时浸出率较高( 陈泉军等2 0 0 1 ) 。 氧化硫硫杆菌为圆头杆状，大小为0 6 1 0 0 5 微米。菌体单个或成对，很少有 成链状排列，菌体二端圆形，无芽孢，革兰氏阴性，运动活泼，在石炭酸复红中易 着色。单生鞭毛，最适生长p h2 0 3 5 ，最低可达到1 以下，最适生长温度2 8 3 0 。c 。 属于自养微生物，碳源为大气中的c o ：，n 源为氨态氮，可以氧化硫磺和其他硫酸 盐、硫代硫酸盐以及多硫化物。该菌菌体两端各有一油滴，可以将培养基中的硫溶 入油滴之中在吸入体内进行氧化，该菌氧化元素硫的能力比氧化硫化物的能力强， 可以产生较多的酸，并有较强的耐酸性能，可耐5 的硫酸( 郑士民等，1 9 8 3 ) 。氧 化硫硫杆菌和氧化亚铁硫杆菌d n a - d n a 杂交分析显示它们同源性约2 0 。目前对 氧化硫硫杆菌的硫氧化途径有一定的研究，通常认为氧化硫硫杆菌和氧化亚铁硫杆 菌氧化硫的途径都为多硫化物途径( d pk e l l y1 9 9 7 ) 。 a c i d i t h i o b a c i l l u sc a l d u s 有人称为喜温硫杆菌( 刘缨等，2 0 0 4 ) 。通常认为a t c a l d u s 和氧化硫硫杆菌非常相似，能够氧化硫化物，但不能氧化亚铁离子，并且a t c a l d u s 可以在非常低的p h 环境下生长。生理生化习性和氧化硫硫杆菌非常相似，以前也曾 经被错误的认为和氧化硫硫杆菌是同一细菌( de r a w l m g s ，2 0 0 1 ) 。1 6 sr d n a 分 析也表明，a t c a l d u s 和氧化硫硫杆菌有很高的同源性，a t c a l d u s 和氧化硫硫杆菌 最大的不同就是在于a t c a l d u s 的最适生长温度是4 5 * ( 2 左右。在3 5 5 0 v 环境中，4 c a l d u s 对硫和硫化物的氧化处于决定性地位。由于a t c a l d u s 耐高温到特性，所以在 生物浸出中具有广泛到应用前景( de r a w l i n g s ，2 0 0 2 ) 。 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 2 4 氧化亚铁钩端螺旋菌( l e p t o s p r i l l u m f e r r o o x i d a n s ) 氧化亚铁钩端螺旋菌不能氧化元素硫和无机硫化合物，只能氧化亚铁，但是纯培 养却能降解黄铁矿，而对其它硫化矿，如黄铜矿精矿缺少氧化能力。它在黄铁矿或 亚铁培养基中最大生长率只有氧化亚铁硫杆菌的一半左右：然而其对亚铁的亲和力 比氧化亚铁硫杆菌更高。对大多数菌株来说，其最佳温度仍未确定，但有些菌株明显 超过3 0 。c ，甚至在4 5 有氧化活性。这类菌能同氧化硫细菌如a t f e r r o o x i d a n s 、a t c a l d u s 和a t t h i o o x i d a n s 一起起间接浸出作用，对硫化矿细菌浸出有促进作用( a s c h i p p e r se ta 1 1 9 9 9 ) 。 3 细菌浸矿机理 对于生物浸出机理的争论目前仍然很多( ws a n de ta 1 2 0 0 1 ；mb o o n2 0 0 1 ：d er a w l i n g s 2 0 0 2 ；fkc r u n d w e l l2 0 0 3 ) ，目前所认识到的是，由于不同的金属硫化 矿物有不同的晶体结构，因此细菌对于不同的金属硫化矿物浸出机理是不同的，在 浸出过程中有不同的中问产物产生；并且，不同的细菌对于不同金属矿物的氧化也 会采取不同的策略( ws a n de ta 1 2 0 0 1 ) 。细菌，比如舭，或者l 肛寸于矿物如黄铁矿 的表面有很强的亲和力( r h a l l m a n ne ta 1 1 9 9 2 ) ，e p s 莅4 t 衍i l l ，吸附矿物过程中 有重要的作用。e p s 提供了个反应空间，在这个空间中充满了铁离子，三价的铁离 子攻击金属矿物的化合键，从而达到浸出的目的，细菌在这个过程中介导了亚铁离 子的再氧化作用( 工g e h r k ee ta 1 1 9 9 8 ；m r o d r i g u e z - l e i v ae ta 1 1 9 8 8 ；j r o j a se ta 1 1 9 9 5 ) 。他们发现氧化不同的金属硫化矿物会产生不同的中问产物，有两种氧化途径， 一种是硫代硫酸机理，这种机理适合酸性环境不溶的金属硫化矿物如黄铁矿f e s ：，、 m o s 2 、w s 2 等，一种是多硫机理，适合与酸性可溶的矿物，女 1 z n s 、c u f e s 2 、p b s 等。细菌在浸出金属硫化物过程中的作用是，提供硫酸以增加质子攻击作用以及保 持氧化态的三价铁离子，以保证对金属硫化矿物的氧化攻击。细菌吸附会加快浸出 速度或许是因为在金属硫化矿物表面吸附的e p s 提供了高浓度的三价铁离子、局部较 高的p h 、以及有c y s 存在的分子中的巯基- - s h 的共同作用( as c h i p p e r se ta 1 1 9 9 9 ； a s c h i p p e r s e ta l2 0 0 1 ) 。 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 3 1 直接一间接作用机理 3 1 1 直接作用机理 所谓细菌直接浸出是指细菌与矿物表面接触，将金属硫化物氧化为酸溶性的二 价金属离子和硫化物的原子团( mb o o n2 0 0 1 ) 。 在有水和空气( 氧气) 存在情况下，在氧化铁铁杆菌、氧化硫硫杆菌、以及氧化亚 铁硫杆菌等细菌及其复合细菌的作用下，许多金属硫化矿会发生如下直接浸出反应： 以黄铁矿为例 2 1 7 c s 2 + 7 0 2 + 2 h 2 0 + 2 f e s 0 4 + 2 h 2 8 0 4 2 f e 2 + + o5 0 2 - t - 2 h + 一f e 3 + + h 2 0 细菌浸矿过程中由于存在f e 2 ( s 0 4 ) ，通过f 矿的氧化作用上述许多反应也能发 生，所以很难说明反应是由细菌直接作用的，通常认为直接作用机理中不涉及f e ” 的作用，但ws a n d 等认为，不论在直接作用机理和问接作用机理中f e “都发挥了 重要作用( ws a n de ta 1 1 9 9 5 ) 。 3 1 2 间接作用机理 在多金属的硫化矿床中，通常含有黄铁矿，黄铁矿在自然氧化下缓慢氧化生成 f e s 0 4 和h 2 s 0 4 。在有细菌条件下，反应被催化快速进行，最终生成f e 2 ( s 0 4 ) 3 和h 2 s 0 4 ( mb o o n2 0 0 1 ) 。f e 2 ( s 0 4 1 3 是一种很有效的金属矿物氧化剂和浸出剂，铜及其他多 种金属矿物都可以被f e 2 ( s 0 4 ) 3 浸出，这就是细菌浸出间接作用机制的观点，凡是利 用f e 3 + 为氧化剂的金属矿物的浸出都是间接浸出( 童勇，1 9 9 7 ) 。 f e s 2 十7 f e ( s 0 4 ) 3 + 8 h 2 0 + 1 5 f e s 0 4 + 8 h 2 s 0 4 m s + 2f e ”一h p + s o + 2f j + s o + l5 0 2 + h 2 0 - - - 2 h + + s 0 4 2 3 2 接触和非接触机理 目前看来，在生物湿法冶金中，单用直接作用机理和间接作用机理来描述金属 硫化物的浸出是不足的，接触- t k 接触机理是目前比较完善的r a w l i n g s2 0 0 2 ) 。 亚铁离子在这个过程中被细菌氧化成铁离子： 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 1 4 f e 2 + + 3 5 0 2 + 1 4 盯一1 4 f e 3 + + 7 h 2 0 整个过程如图1 所示： n o n - c o n t a c tl e 啦e h n g 日 m i e x t e 2 t c t i o t l d u et o f 静a t t a c k a c i d - i ：f l s 0 1 i u b ks u l f i d e so h i o s u l f a l ei n t c m k d i a t e s ) 何r 才- p r o t o n 撕a e k 锄i d 郴1 嘲蛐l f i d 憾 咖l 州槲i n 嘲n e d i a t e s ) c o n t a dt e a c h l a g i , o n - o x i d i z i n go r g m i m m e 、l e c t r o ne x t r a c t i o na s 衙 i l i o n - - , o l l l l t c | l e , 劬i a g w i me p s l m g 鹅煳：t j m i 神峨1 n o r o a 3 c dr e a c t i o n am i 蝣e h a n g e a i t ，i , h ， r 砷c 棚l c e 璀馏西椰h a 日们刨o ( p t , t e m i a v d i t h i ne p 患， k a c h i n g a l s o - d u et oe t 0 0 a o e h c m i c a l 删i r i z 崩o n a th i 和m 穗瞬p o w m i a l s 随耙a 簖胁删如酗g i l l s 国瞎l 螂r $ 娃p s u l e r e a c t i 0 1 s ；，a 罐 , 9 t l f t t r - c i x m i z i n go r 磐d n i s t c y s l e i n e - - c o n l a i n i n g s 州栅c m - r k i p m t 。i 雌f o r b 蕊i l i 批a k d a g ，r c s u 赫n g 讥 r a l 删q e o f , g u l f u r 口1 l o i d sa n d o t l m r i 难嘲神i a 把s c o o p e t a f i e el e a c h ! 嵫 s u l f u r c o l l o i d s s 证缸rh 撕l 删 m 口a n dr m n g r a l r a 舯e l l 聃i t s e d b y p l m k t o n i c i r o n - a n ds t d f u 十 , o x i d i z , i n go r g a n i s m g t og e n e r 妣f 萨a n dp r o t b n s f 醯n o 肿e 锄“i c cl e a c h i n g 图1 细菌浸出机理示意 虱( g a w l i n g s ，2 0 0 2 ) f i g1s c h e m a t i cd i a g r a mi l l u s t r a t i n gt h em e c h a n i s m so f b i o l e a c h i n g 3 2 1 非接触机理( n o n c o n t a c tl e a c h i n g ) 非接触浸出作用和通常说的间接作用机理相似，都是利用三价铁离子对金属矿 物进行攻击，这个过程涉及铁离子同时也有酸性的可溶的多硫化物。( 如图1 ) 这个 过程中，可以有细菌的存在，也可以在无菌环境中，通过三价铁离子发生f dr a w l i n g s 2 0 0 2 ) 。 这个过程对于硫的氧化，还可以分为硫代硫酸途径( t h i o s u l f i l d em e c h a n i s m ) 和多硫化物途径( p o l y s u l f i l d em e c h a n i s m ) ，硫代硫酸途径过程大致如下( as c h i p p e r s & ws a n d1 9 9 9 ) ： f e s 2 + 6 f e 3 + + 3 h 2 0 _ s 2 0 3 2 - 十，r e 2 + + 6 h + s 2 0 3 2 - + 8 f e 3 + + 5 h 2 0 - - 。2 s 0 4 2 - + 8 f e 2 + + 1 0 h + 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 多硫化物途径： m s + f e 3 + + 矿一m 2 + + 05 h 2 s n + f e 2 + ( 佗2 ) o5 h 2 s n + f e “_ o1 2 5 s 8 + f e 2 + + l + 01 2 5 s 8 + 1 5 0 2 + h 2 0 - - - s 0 4 2 + 2 h + 在整个过程中，细菌产生硫酸，提供质子使铁能保持高氧化能力的3 价状态， 以持续对硫化矿物发挥浸出作用。 3 2 2 接触作用机理( c o n t a c tl e a c h i n g ) 与接触作用机理有关的非常重要的一部分是细菌的胞外复合物( e x t r a c e l l u a r p o l y m e r i cs u b s t a n c e ，简称e p s ) ( 或者称为e x t r a c e l l u a r p o l y s a c c h a r i d e s ) ，e p s 是在细 菌细胞外周一些多糖，蛋白质以及脂类物质构成的一个复合体，对于细胞吸附，并 且浸出金属硫化矿具有重要作用( c p o l i a n ia n ded o n a t i1 9 9 9 ：kk i n z l e re ta l 2 0 0 3 ) 。 如图2 中所示，细菌在e p s 的作用下，吸附在硫化金属矿物表面，e p s 作为一个 反应空间，这个空间有合适的p h ，酶系统三价铁离子和二价的亚铁离子在这个空间 发生氧化还原反应，浸出金属离子，三价铁离子被还原成二价亚铁离子；同时在细 菌作用下，二价亚铁离子又不断的氧化成三价铁离子继续发生反应( tr o h w e r d e re t a l2 0 0 3 ) 。 图2e p s 作用下细菌浸出示意图( r o h w e r d e r e ta 1 2 0 0 3 ) f i g 2s c h e m eo f t h em e c h a n i s m so f b i o l e a c h i n gb yt h ef u n c t i o no f e p s 细菌利用半胱氨酸c y s 的一s h 侵蚀金属硫化矿物，最终放出胶体硫和其他中间产 物。这些中间产物可以被浮游生物等一些有机体利用，最终用于三价铁离子的循环， 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 从而实现非接触浸出( ht r i b i t s c he ta 1 2 0 0 0 ) 。 窘 图3c y s s h 作用下对黄铁矿的浸出循环( t r i b i t s e he ta l2 0 0 0 ) f i g3s c h e m eo f t h em e c h a n i s m so f b i o l e a c h i n gp y n 把b yt h ef u n c t i o no f c y s s h 4 细菌对金属铁离子的代谢 常见的用于生物湿法冶金的细菌中，只有氧化亚铁硫杆菌代谢三价铁离子和二 价亚铁离子。在有氧及酸性条件下( p h2o ) ，4 ：厂氧化f e 2 + 以获得能量，一系列呼吸 链组分的发现，逐步构建并完善了4 ：厂的f e 2 + 电子传递系统( 图4 ) 。早期的研究分 离并鉴定出了蓝铜蛋白( r u s t i c y a n i n ，c o x j ce ta 1 1 9 7 8 ) ，铁硫蛋白( 亚铁氧化酶，) ， 两种细胞色素氧化酶( i n g l e d e w ，k a ie ta 1 1 9 8 9 ) 和一些细胞色素c 。根据各组分的 氧化还原电势能，体外氧化f e 2 + 的能力，提出了多种呼吸链模式。例如：f e 2 + - - + c y t c 叶c y ta 一0 2 ；f e 2 + _ c y tc _ c y ta l 叶0 2 ；f e 什呻r u s t i c y a n i n - - - * c y tc _ c y ta 1 一0 2 ( c o xj c ，1 9 7 8 ) ；f e 2 + - - - + f e ( i i ) c y tc 氧化还原酶一c y tc 5 5 2 一c y tc 氧化酶一0 2 ( t y a m a n a k ae ta 1 1 9 9 5 ) ：f e 2 + - - - , c y c 2 m s t i c y a n i n - - - , c y tc 1 一a a 3 细胞色素c 氧化酶一0 2 ( a y a r z h b a le ta 1 2 0 0 2 ) ；f e 2 + 一c v c 2 _ r u s t i c y a n i n c v tc 1 一a a 3 细胞色素c 氧化酶一0 2 ( c a p p i a - a y m ee ta l 1 9 9 9 ) 。 由于氧化硫硫杆菌在生物浸出中的主导性作，对于其铁氧化过程的研究显然是 很重要的，而且f e ”和f e 2 + 的循环利用在非接触机理和接触机理中都是非常重要。 因此，对于三价铁离子的氧化还原过程的研究具有重大意义。 1 4 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 墨“： n印h* 图4a t ，铁氧化电子传递链( a p p i a - a y m e1 9 9 9 ) f i g4 e l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y b e t w e e n f e r r o u s i r o n a n do x y g e n i n a t f 3 丫一2 “ s u l f i t e ：c y t o e h r o m ec e n z y m e a o x i d o r e d u e t a s e ( m r1 6 ，o o o ) ( m r4 4 ，0 0 0 ) c y t o c h r o m e b i n d st h i o s u l f a t e o x i d e s e 【a - - s s o s ( a a 3 ) c y t o e h r o m ee 5 5 1 l e n z y m e b ( m r2 6 0 ，0 0 9 ) 8 e ( m r6 0 ，5 7 3 ) t 钾or e d o xc 锄虹b s s o xbg o n ep r o d u c t c y t o c h r o m e d i m e r i em n ( i i ) c l u s t e r 夫 e 5 5 2 厂f n 、 i f0 2 s 0 4 2 。 1 0 h + c y t o e h r o m ee 5 5 2 5 ( m r5 6 ，0 0 0 ；s u b u n i t sm r2 9 ，0 0 0 ) a tl e a s tt w or e d o xe e n t r e s a t e r m e m b r a n e p e r i p l a s m q 怕p l ”“i c m e m o r a n e 图5p s o 途径示意图( 根据k e l l y d p ，1 9 9 7 改绘) f i g 5p a t h w a yo f p s o ( m o d i f i e df r o mk e l l yd p ，1 9 9 7 ) 1 5 8 h 2 0 2 4 h 2 0 兰州大学硕士研究生毕业论文氧化硫硫杆菌分离鉴定及硫氧化系统研究 细菌对于无机硫的氧化作用 目前认为，至少有两种主要的氧化无机硫化物的生物化学途径，一种称为 p a r a c o c c u s 硫氧化途径( p a r a c o c c u ss u l f u ro x i d a t i o n ) ，简称p s o 途径，另一种称为“四 硫化中间物( s 4i n t e r m e i a t e ) ”途径，简称$ 4 1 途径0 3rk e l l ye ta 1 1 9 9 7 ) 。 5 1p s 0 途径 p s o 途径最先发现在a p a r a c o c c u sv e r s u t u s n p d e n i 护i f i c a