毕业论文--冷胁迫条件下不同玉米自交系 ABA 含量的变化.docxVIP

目录第一章前言11.1低温冷害的不同类型以及对东北地区玉米种植的影响11.2植物响应逆境的激素调节21.3脱落酸（ABA）与低温冷害影响植物的关系31.4 ABA诱导基因及其表达的调控3第二章 ABA的含量检测62.1实验准备与材料处理62.1.1实验材料62.1.2实验试剂：62.1.3实验仪器62.1.4溶液准备：62.1.5玉米材料的前处理：62.2脱落酸（ABA）检测步骤72.3 ABA(脱落酸)含量分析8讨论10结论11致谢12参考文献13II中文摘要 玉米是禾本科一年生草本植物，雌雄同株异花授粉，是全世界产量最高，地位重要的粮食作物和饲料原料，玉米在世界上的产量和种植面积仅次于水稻和小麦。同时，玉米在生物，能源，新材料等高新技术领域是极为重要的原材料。玉米起源于南美热带和亚热带，于明朝时期传入我国。几百年的发展以及玉米在多个领域的重要作用使得玉米在我国国家粮食安全中极其重要，生产生活中对玉米的需求不断增加。因此对于高纬度、寒带地区以及高海拔地区来说，对玉米进行开发种植显得更加具有重要的意义。但是起源于热带、亚热带地区的玉米属于冷敏感植物，也称为喜温植物，在生长周期中表现出对低温冷害敏感，他们的生命活动需要较高的温度才能正常进行，因此玉米在整个生长周期过程中极易遭受低温冷害的影响而减产。所以，研究玉米冷响应信号转导途径、了解玉米冷胁迫条件下的生理变化从而帮助培育玉米抗冷新品种，增强玉米的抗低温胁迫能力具有重要的实际意义。ABA（脱落酸）作为“逆境激素”，对环境因素尤其是逆境反应非常激烈，能够介导环境胁迫和植物抗逆反应，其含量变化能够比较直观地体现出玉米对低温胁迫的反应。本研究从ABA含量变化分析了两个不同耐冷性玉米自交系W9816和B73的特征。关键词：玉米，低温，ABA，耐冷性，自交系Abstract Corn is a one-year-old herbaceous plants, male and female flora pollination plants.Maize is one of the most important food crops and feed crops, but also the worlds highest crop yield and Its planting area and total yield were second only to rice and wheat.At the same time, corn is also an important raw material in biology , energy and medicine.Maize originated in tropical or subtropical regions and was introduced into China in the Ming dynasty.With the development of several hundred years and the characteristics of maize, maize plays an important role in the national food security.Therefore, it is more urgent to develop Maize in high latitude, high altitude and cold regions.But originated in tropical and subtropical regions of the maize plant is sensitive to cold, also known as thermophilic plants during the growth cycle showed sensitive to chilling injury.Their life activities need higher temperature to normal, so the corn is very vulnerable to the effects of chilling injury in the whole growth period in the process of production.Therefore,to study on the molecular mechanism of maize cold response to cold stress and to understand the physiological changes of Maize under the conditions so as to help the development of new germplasm for cold resistance of new maize varieties, has important practical significance to improve the ability to adapt to cold corn.ABA (abscisic acid) as the stress hormone, the environmental factors especially the stress response is very intense and it can mediate the environmental stress and plant resistance reaction. The change of ABA content can intuitively reflect the response to low temperature stress in maize.In this study, the characteristics of W9816 and B73 of two maize inbred lines with different cold tolerance were analyzed based on the change of ABA content.Keywords: Corn , Low-temperature ,ABA , Cold resistance, Inbred line第一章 前言玉米（拉丁学名Zeas mays L.）是禾本科玉蜀黍属一年生草本植物，雌雄同株异花授粉植物，是重要的粮食作物和饲料作物， 也是全世界总产量最高的农作物， 其种植面积和总产量仅次于水稻和小麦。同时，玉米在化工，能源，医药方面也是重要的原材料。在我国，玉米已于2008年超过水稻成为我国最大种植面积的粮食作物。我国玉米种植主要分布于北方春玉米种植区和黄淮海种植区。由于北方玉米种植地区秋霜早，气温低，籽粒脱水缓慢，使得该地区玉米经常受到冷胁迫伤害。以及黄淮海地区常有风，雹等自然灾害发生，因此也会受到冷胁迫伤害。东北地区是我国玉米生产基地之一，也是世界著名的三大黄金玉米带所在地，该区域玉米播种面积近6.0106 hm2，约占粮食作物总面积的一半，正常年景年产玉米 7.01010 kg左右，约占全国玉米总产量的40%1。但是，由于东北大部分地区常年气温较低，积温不足，加之中、晚熟品种播种面积比例较大，因而经常发生玉米延迟型低温冷害，如1954、1957、1969、1975、1976、1985和1995年等年份，低温冷害导致东北大部分地区玉米单位面积产量减于10%以上，严重年份减产 15-20%甚至更多，同时造成玉米含水率高，品质下降1。低温寒害是全球性的，全世界每年因低温寒害造成各种农作物的损失高达数千亿美元，因此本文从ABA角度来探究冷胁迫对不同玉米自交系的影响以及植物对低温的响应。1.1 低温冷害的不同类型以及对东北地区玉米种植的影响低温是限制植物生长和地理分布的重要环境因子之一，根据对低温的反应，可以将植物分为冷敏感植物和抗寒植物，冷敏感植物又叫喜温植物，这类植物原产于热带和亚热带地区，他们的生命活动需要较高的温度，一般在10到12摄氏度以下的温度就会对生命活动造成伤害。而低温冷害(low temperature, chilling or cold damage)是影响我国东北地区玉米生产的主要灾害之一，一般指高于0而低于20的温度2。它简称冷害，指农作物在生育期间遭受低于其生长发育所需的环境温度，引起农作物生育期延迟，或使其生殖器官的生理机能受到损害，导致农业减产的现象。玉米，大豆以及棉花都属于这类植物。冷害的分类主要有两种分类方法，一种分类方法根据在农业气象学中，低温对作物危害的特点及作物受害的症状来划分，将冷害类型分为三类，即延迟型冷害、障碍型冷害和混合型冷害(指延迟型与障碍型冷害在同年度发生)3。延迟性冷害是指作物生长发育期间(主要是营养生长期、有时也包括生殖生长期)遇到低温，消弱了生理活性而使生育期显著延迟，作物不能正常成熟而减产的现象。障碍性冷害是指作物在生殖生长期(主要从颖花分化期到抽穗开花期)遇到短暂而强烈的低温，生殖器官受破坏而减产的现象3。另一种对冷害的分类方法是从灾害角度按照冷害发生的时间将冷害分为三类，即春季低温冷害、秋季低温冷害、东北夏季低温冷害三类。比如在春天播种时，常因春寒使得农作物受到伤害。随着农业生产的发展，单粒点播技术应用越来越广，单粒点播对玉米的出苗率要求很高。早春低温冷害影响玉米种子的萌发，使出苗整齐度下降，严重时甚至可使种子丧失生活力，出现烂种和粉种等现象，降低成苗率。我国北方地区尤其是东北玉米产区春季冷害现象十分严重，春季低温冷害发生频繁，而此时又正值玉米的播种-出苗期，因此，低温对玉米的出苗保苗和幼苗生长带来严重的影响，最终经常导致玉米产量的降低，冷害类型可归为延迟性冷害。玉米苗期如果遭受长时间低温冷害，叶鞘和中胚轴变成褐色，严重时叶片萎蔫呈水渍状，不利于幼苗的生长发育。 1.2 植物响应逆境的激素调节对于植物来说，逆境能够促使植物体内激素的含量和活性发生变化，并且通过这些变化影响生理过程，使植物对逆境的适应性增强。近年来研究较深入的是有关ABA在植物逆境适应中的作用。ABA也称为胁迫激素，它主要通过调节气孔运动，保持组织内的水分平衡，增强根的透性，提高水的通导性等来增强植物的抗逆性。植物的抗逆性的形成是一个极其复杂的适应过程，除了ABA（脱落酸）外，其他激素也参与植物抗逆性的调控。例如，在多种逆境条件下，植物体内的乙烯含量均大幅度增加，当胁迫解除时则恢复正常水平。乙烯可促进器官衰老，引起枝叶脱落，减少蒸腾面积，有利于保持水分平衡；乙烯还可以提高与酚类代谢有关的酶类的活性，间接地参与植物对伤害的修复或逆境的抵抗能力。另外各种激素的相对含量对植物的抗逆性更为重要。研究表明，同一品种的植物在抗寒锻炼期间，随着ABA/GA（赤霉素）的比值升高，抗寒性逐渐增强4。 1.3 脱落酸（ABA）与低温冷害影响植物的关系脱落酸（ABA）有着“逆境激素”的别称，ABA在植物的抗寒，抗旱和抗盐的生理过程中具有重要的调节作用。在植物体中，ABA在从从根尖到茎尖的所有部位均有存在，而且几乎所有含叶绿体或淀粉质体的细胞中中都可以合成ABA。已知ABA是对环境因素反应最激烈的激素之一，叶片中的ABA浓度在水分胁迫条件下短时间内迅速上升5,所以ABA是一个环境介导因子，特别是逆境因子的信号物质。水分胁迫条件下叶片内ABA水平的升高促进了气孔的关闭，减少了蒸腾，维持了叶片的水分平衡。其实实际上，叶片的气孔关闭开始时间要早于叶片中ABA浓度的升高时间。对于ABA合成缺陷突变体，其通常表现为萎蔫突变体，这是因为这些突变体丧失了正常的气孔关闭功能。外源ABA处理会恢复这些突变体的气孔关闭，同时会恢复这些突变体的气孔关闭，同时恢复叶片细胞的膨压6。植物体内的脱落酸水平不仅在水分胁迫条件下升高，而且在低温胁迫等逆境条件下也会升高。这是因为几乎所有逆境条件都会直接或间接地诱导植物水分状态的变化，如使细胞的膨压下降，而细胞的膨压变化会诱导脱落酸合成的增加。ABA通常被认为是一种生长抑制型激素，可以抑制种子萌发，促进休眠以及促进叶片衰老脱落。但研究表明，使用外源脱落酸处理完整健全植株所获得的实验结果与这种表述完全相反，例如在较低浓度处理可以促进玉米幼苗发芽和生根7。脱落酸的这种生理促进性质与其抗逆激素的性质是密切相关的。因为其生理促进作用在低温等逆境条件下的作物表现最为显著。脱落酸改善了植物对逆境的适应性，增强了生长活性，所以在许多情况下表现出有益的生理促进作用。ABA的这种特殊的生理性质，对于正确理解脱落酸的生理意义十分重要，同时对脱落酸的实际应用也具有启发意义。1.4 ABA诱导基因及其表达的调控脱落酸(ABA,Abscisic Acid)是多种非生物胁迫信号传导交叉适应因子8,9。ABA 在多种环境胁迫条件下迅速积累，而且 ABA合成缺陷型植物胁迫响应过程被改变。ABA也可以诱导Ca2+离子增加从而影响低温信号转导。ABA醛氧化酶的钼辅助因子缺陷型拟南芥突变体名为aba3/freezing sensitive 1 (frs 1) 10，也被称为los5(low expression of osmotically responsive genes 5) 11，表现出对冻害敏感的症状。los5突变体植株中的低温胁迫表达基因和渗透胁迫表达基因显著下降11。phy A和phy B在田间冷适应时起到完全不同的生理作用，当远红光诱导激活了phy A基因的表达进而诱导ABA信号通路和随后的茉莉酸JA信号后，导致了西红柿中CBF通路的激活并产生抗冷表型12。MYB96-HHP模块的表达整合了ABA依赖和ABA不依赖的信号通路，并激活了CBF通路表达，使拟南芥抗冷表型得到加强13。相应地，胁迫诱导下植物体内积累柠檬酸、苹果酸和琥珀酸以及-氨基丁酸(GABA) 也不依赖于ABA14, 15。相反，积累一些胁迫诱导的渗透调节蛋白包括脯氨酸等，依赖于ABA的出现14, 15。ABA响应基因的启动子区域包含有保守的顺式作用元件名为ABRE (Py ACGTGG/TC)，控制了相关基因的表达。研究表明ABA响应基因的表达至少需要一个以上ABRE 或一个ABRE和CE作为启动元件16-18。综合分子分析表明在渗透胁迫条件下ABA调节了大量基因的表达，而ABRE则是关键的顺式作用元件19。AREB/ABFs是调节ABA依赖的基因表达的bZIP类转录因子，是拟南芥中胁迫条件下的最主要的转录因子16, 17。在AREB/ABF家族转录因子的九个成员当中，AREB1/ABF2在营养生长期间控制了ABA信号和环境胁迫响应。AREB/ABF转录因子被非生物胁迫所诱导，它们的转录激活受ABA依赖的磷酸化所控制。完全激活AREB1必须用ABA诱导20,21且其活性受ABA依赖的磷酸化调节保守结构域多个位点22。转基因拟南芥过表达有活性的AREB1提高了耐旱性并对ABA超敏感20。过表达AREB1还提高了水稻和大豆的耐旱性23,24。SnRK2、A型PP2Cs和RCAR/PYR/PYL等ABA受体控制了ABA信号通路以及陆生植物的AREB/ABFs的表达25-27。SnRK2s磷酸化调节AREB/ABFs对于ABA依赖的信号网络十分关键28,29。最近的研究还表明A型PP2Cs参与了陆生植物早期干旱响应如小立碗藓30。在低温胁迫下，植物的冷响应基因被诱导表达，有些冷响应基因的表达依赖于上游CBF基因的表达，这条冷信号途径被称为依赖于CBF的信号转导途径，但是依然存在一些冷响应基因的表达独立于CBF的调控，即在冷胁迫诱导冷响应基因表达时并未诱导CBF表达，这条途径被称为不依赖与CBF的信号转导途径。对于不依赖于CBF的信号转导途径的植物体可能是其某个基因发生突变导致抗寒物质积累，从而缓解了植物低温伤害，但是却不影响CBF及其下游基因的表达，有研究表明，拟南芥中一个MYB基因HOS10的突变增强了冷诱导的COR基因的表达，影响了植物对低温的敏感性，但没有影响CBF的表达模式，这说明植物中存在着不依赖于CBF的低温信号转导途径。第二章 ABA的含量检测2.1 实验准备与材料处理2.1.1实验材料：在本次实验中将会使用B73和W9816这两种玉米材料，即W9816玉米自交系，和B73玉米自交系。2.1.2实验试剂：上海朗顿生物技术有限公司生产的植物激素ABA(abscisic acid，脱落酸)ELISA Kit试剂盒，液氮，蒸馏水，NaCl等。2.1.3实验仪器：紫外分光光度计，水浴锅，光照培养箱，锥形瓶，研钵，移液枪，37恒温箱，标准规格酶标仪，一次性试管，试管架，加样器以及吸水纸。2.1.4溶液准备：0.2M磷酸缓冲液(调节pH至7.4) ：A液：配置0.2M Na2HPO4溶液：先在容量瓶中加入NaH2PO49H2O为17.81g，再加双蒸水，定容至500mL。B液：配置0.2M Na2HPO4溶液：先在容量瓶中加入NaH2PO4H2O为13.8g，再加双蒸水，定容至600mL。使用时需要将A液40.5 m L和B液9.5mL搅拌混匀然后配成实验中所需要的0.2M磷酸盐缓冲液并调节pH至7.4。2.1.5玉米材料的前处理：分别在两个锥形瓶用蒸馏水浸泡B73和W9816种子24小时过夜。然后按照都分为对照组和处理组种于营养钵中，营养钵中的基质按照蛭石：珍珠岩：草炭土=1：1：10的比例混合。在恒温25光周期16/8h，光强度450mol m2 s1条件下生长到三叶一心期。再从两种自交系中分别拿出相同数量的玉米幼苗（也与剩余幼苗数量相同）置于温度4摄氏度下培养，光照以及光照强度保持不变。 2.2 脱落酸（ABA）检测步骤在本实验中使用上海朗顿生物技术有限公司生产的ABA试剂盒对脱落酸含量进行测定。该试剂盒使用的方法是用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法测定冷胁迫条件下不同玉米自交系中玉米幼苗体内激素ABA的含量。这种方法的原理是在适宜温度下利用脱落酸和其单克隆抗体结合后，再加入能与链霉亲和素HRP形成免疫复合物的且有生物素标记的抗脱落酸抗体从而形成免疫复合物，要保证在适宜温度下反应，在一段时间内对酶标孔进行洗涤，去除没有与待测样品结合的酶，然后再加入显色剂A和显色剂B，将会出现溶液先变为蓝色然后再变成黄色的现象。待测样品中脱落酸的含量越高，溶液的颜色就会越深即呈现出一种正相关的关系。首先称取0.1克经去中脉处理后的玉米叶片，然后加入0.9mL的pH为7.4的0.2M磷酸盐缓冲液。用匀浆器将处理后的玉米幼苗叶片充分研磨至匀浆状态后使用离心机3000rpm离心20min后收集上清液小心放置保存。实验步骤：1.梯度稀释：在试管架上放置五个试管分别设置为1号到5号。在1号试管中加入240微升标准品原液，再用精密移液枪从1号试管中吸取120微升溶液加入到2号试管中，同时在2号试管中用精密移液枪加入相同体积的标准品稀释液，混匀使其充分混合。按照这种梯度依次梯度稀释出3号，4号以及5号标准品，每次稀释后都要震荡使溶液混合均匀。2.加样：首先在包被板的标准品孔加入已事先整合好生物素抗体标准品50微升与链霉素-HRP50微升；然后在待测样品孔中加入40微升的待测样品，然后按照抗脱落酸抗体,链霉亲和素HRP的顺序依次分别加入10微升50微升，接着在孔上盖上封板膜小心振荡从而使其充分混合。然后放置在37下温育60分钟。每个样品重复5次。最后要在空白对照孔加入终止液以及显色剂A和显色剂B，不加链霉亲和素-HRP以及经生物素标记的ABA抗体，也不加样品，其他的操作步骤不变。3.配液：精密吸取2ml的浓缩洗涤液，然后加入58ml蒸馏水将溶液稀释至30倍，储存备用。4.洗涤：慢慢揭掉封板膜，小心甩掉酶标板内的液体；使酶标板面朝下，然后用力拍，拍打时要先在试验台上铺上吸水纸避免污染。吸取0.5ml稀释后的洗涤液注入孔中，水平放置浸泡2min。重复5次，最后拍板时要保证孔内无液体。5.显色：每孔先加入50l的显色剂A，再加入50l的显色剂B，轻轻摇晃使其混合均匀，在37摄氏度条件下，避光显色10min。6.终止：用精密移液枪吸取50微升的终止剂，使反应停止，此时会观察到孔中先变蓝色，接着立刻变为黄色。7.测定：在分光光度计中用空白组进行调零，然后在450nm波长下依序测量每孔的OD值（吸光度）。测定时一定要保证测量不能超过加终止液后的10分钟。8.计算：根据标准品的浓度以及测得的相应的吸光度求出对应的数值关系，再根据求出的数值关系计算出样品的吸光度对应的样品浓度。9.注意：(1)每次枪头使用完都应避免再次使用，防止交叉感染的产生。(2)从冰箱中取出试剂盒后，要先在室温条件下解冻30min，未用完的板子要密封保存。(3)加样过程中要保证准确性从而避免产生误差。2.3 ABA(脱落酸)含量分析 ABA(脱落酸)作为植物体中已知的天然植物激素在植物体内具有广泛且重要的应对植物逆境的生理作用。促进气孔关闭以和抑制气孔张开是脱落酸重要的生理作用，在多种逆境胁迫条件下，如低温，干旱等恶劣环境都能使植物体内的ABA含量发生变化从而激活CBF信号转导途径改变植物抵抗外界恶劣环境的能力。正是因为ABA作为信号物质在冷响应过程通过影响植物表达改变植物抗逆性的作用，在本次ABA提取实验中，我们使用试剂盒分析了经不同时间冷处理后的B73和W9816玉米幼苗叶片中ABA的含量变化与植物抵抗低温胁迫的关系。以未冷处理植株作为空白组，以经4条件处理处的玉米幼苗为对照组，对对照组进行2,6,12的低温处理。由图2.3.1可知，在B73中ABA含量随冷处理的时间增加而逐渐增加，并且在6h时达到最大值，而在经12h冷处理后对照组脱落酸含量却是出现下降的趋势，但是每个处理条件下的B73中ABA的含量却未出现显著的变化。对于自交系W9816,经6h和12h的冷处理后的ABA含量变化则与B73相似。但是对于W9816来说经冷处理6h后的ABA含量与其他处理条件相比变化较为明显，同时经12h冷处理后的ABA含量相对于对照组变化也比较明显。而由图2.3.2可知对于能够调节冷相应基因的上游CBF基因来说，经冷处理24h后的B73的转录因子CBF1相对表达量变化更为显著。图2.3冷胁迫下脱落酸含量比较以未进行冷处理的玉米幼苗叶片为空白对照，横坐标代表冷处理的时间。图2.3.2 冷胁迫下CBF1相对表达量以B73冷处理0h为0.5进行相对定量，横轴为冷处理时间讨论：脱落酸(Abscisic Acid)是植物六大天然激素之一。ABA在植物体内具有极其广泛且重要的生理作用，脱落酸具有抑制胚芽鞘、嫩枝、根和胚轴等器官的伸长生长的作用。影响植物组织或器官的脱落以及抑制整株植物或离体组织器官的生长是脱落酸最显著的生理作用。脱落酸对植物生长的抑制作用正好与生长素，赤霉素以及细胞分裂素相反，脱落酸的该抑制作用主要体现在抑制细胞的分裂与伸长。有研究表明在植物体中，脱落酸促进气孔关闭和抑制气孔张开来适应冷胁迫31。在一般情况下，在各种胁迫条件下，植物体内 的脱落酸含量出现迅速升高，同时抗逆性加强的态势32。通过ELISA试验发现W9816和B73这两个玉米自交系中的脱落酸含量在经低温处理6h和12h后相比存在着明显的变化。对于W9816这一玉米自交系，经6h低温处理后ABA含量明显高于未处理幼苗和经2h冷处理的幼苗，经12h低温处理后ABA含量则更为明显高于未处理幼苗和经2h冷处理的幼苗。而在另一个玉米自交系B73中ABA含量虽然在冷处理后有所增加，但是变化还未达到明显程度。但是在B73和W9816这两种自交系中ABA含量的变化趋势相似，两个自交系中ABA含量都是经4处理6h后达到最大值而在经12h4处理后脱落酸含量则是相对降低。在低温胁迫下，植物的冷响应基因被诱导表达，有些冷响应基因的表达依赖于上游CBF基因的表达，这条冷响应信号途径被称为依赖于CBF的信号转导途径，但是依然存在一些冷响应基因的表达独立于CBF的调控，即在冷胁迫诱导冷响应基因表达时并未诱导CBF表达，这条途径被称为不依赖与CBF的信号转导途径。而CBF1和ABA在B73和W9816中相对表达量的变化趋势不一致，这可能是因为在W9816中存在着不依赖CBF的信号转导途径，在B73和W816这两种自交系中冷响应的过程存在着两种机制来响应低温胁迫。所以，对于不同玉米自交系，低温逆境都会引起这些自交系玉米幼苗体内ABA含量升高，这也符合ABA作为“逆境激素”能够调节植物对逆境条件的适应性的生理作用。因此，对于植物应对冷胁迫环境，提高作物产量以及降低低温造成的损失方面，脱落酸存在着极为广阔的应用前景和很高的市场价值，同时也使得去了解冷胁迫与植物体内ABA的关系变得意义深刻。结论： 对于具有不同耐冷性的玉米自交系来说，低温逆境条件下其内源ABA的含量变化是不一样的。但是在合适的温度变化范围和适宜的冷处理的时间里ABA含量都是呈上升趋势以刺激植物体适应外界环境变化，确保植物生理生化活动的正常进行。 尤其是耐冷玉米自交系相对于正常自交系，其体内的显著的ABA含量变化更是对ABA是介导环境胁迫和植物抗逆反应的调节物质一个佐证。15致谢在这次的毕业实验中，我整个实验都离不开李世鹏老师的指导和帮助。能够在李老师的帮助下顺利完成实验，并且学习到老师对实验的热情和态度以及实验过程中的一些小技巧是我这次毕业实验最大的收获。李老师在实验中严格要求，态度严谨，仔细认真的态度是我必须要学习的。在本科毕业马上要到来之时，非常感谢老师对我的教导与帮助。此外，还要感谢薛英杰学长在实验中对我的帮助以及室友在实验过程中对我不足的指出和关怀。感谢室友陈昊，吕岱岳，李渊以及宋文浩在生活中对我的帮助与支持。谢谢大家的帮助与关怀！谢谢！参考文献：1马树庆,刘玉英,王琪.玉米低温冷害动态评估和预测方法J.应用生态学报, 2006, 17(10): 1905-10. 2Chinnusamy V, Zhu J, Zhu J K. 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