WNT信号通路

Wnt catenin信号转导途径 Wnt信号通路 人类Wnt基因家族由19个成员组成 编码具有22或24个半胱氨酸残基的保守糖蛋白 Wnt信号转导途径可以分为决定细胞命运的经典途径和控制细胞运动及组织极性的非经典途径 Wnt途径的发现 Wnt基因于1982年发现 最初是作为小鼠乳腺肿瘤病毒优先整合的位点而被鉴定的 该基因能在细胞间传递增殖和分化信息 是一种癌基因 当时被命名为Int基因 小鼠Int 1和Int 3 随后发现它与果蝇的无翅基因 wingless 属直相同源基因 orthologousgene 从而将二者结合命名为Wnt基因 随着研究的不断深入人们发现Wnt基因家族非常庞大 为多基因家族 其基因结构从低等的无脊椎动物到脊椎动物乃至人类具有高度保守性 其同源序列达27 83 对动物的生长发育起着至关重要的作用 Wnt基因编码的WNT蛋白 可启动细胞内信号传导途径 传导生长刺激信号 参与不同的发育机制 如细胞分化 移行 以及决定细胞命运的增殖等 因其启动蛋白为WNT蛋白 故命名为Wnt信号途径 1996年 Wnt途径的主要成员被相继确定和克隆 研究发现 这一信号途径主要包括三个环节 即由Wnt配体与胞膜受体的特异性结合 引发胞内一系列级联反应 进而调节核内的基因表达 传统的信号途径系统观点认为 信号是从细胞表面到细胞核的线性传递 Wnt信号途径的起点为胞膜 由分泌性信号蛋白Wnt 通过跨膜的受体蛋白 经由多种细胞内蛋白将信号传至细胞核内 这点上看 它是一种与传统观点相一致的信号途径系统 然而许多研究发现 Wnt途径和其他细胞功能 信号传递过程相互交叉 不是直线型的结构 而是一个网络调节模式 具有几个关键调控点 Wnt途径总的框架 1 Wnt cantenin途径 即典型的Wnt cantenin信号途径 canonicalWnt canteninpathway 该途径通过 cantenin的核易位 激活靶基因的转录活性 2 平面的细胞极性途径 planarcellpolaritypathway 涉及RhoA和JunN端激酶以及细胞骨架的重排 目前还没有实验资料证明该途径参与肿瘤的发展 3 Wnt ca2 途径 由Wnt5a和Wnt11激活 增加胞内Ca2 含量 激活蛋白酶C 磷脂酶C和转录因子NF AT Wnt Ca2 途径可以和典型的Wnt cantenin信号途径相互作用 但是该途径在肿瘤发生中是否起作用尚不清楚 Wnt信号途径 Wnt途径的组成和实现 研究Wnt途径的组成 主要运用基因和分子生物学相结合的手段加以分析与认定 Wnt途径候选分子的确定标准为 该分子失去功能显性 则Wnt信号途径的功能即消失 而该分子获得功能时 Wnt信号途径也同时具有功能 经过十多年的研究 目前认为Wnt途径的主要组成为 Wnt信号蛋白 胞膜受体FZD家族 胞浆内 catenin Dsh APC GSK3等蛋白分子 细胞核内LEF TCF转录因子家族等 胞内信号传递 Wnt信号进入胞内后 将信号传递给Dishevelled Dsh 活化的Dsh抑制由Axin APC adenomatouspolyposiscoli 和GSK 3 serin threonineglycogensynthasekinase3 组成的复合物的活性 使 catenin不能被GSK 3 磷酸化 磷酸化的 catenin才可通过遍在蛋白化 ubiquitination 而被胞浆内的蛋白酶体所降解 由于非磷酸化的 catenin不能被蛋白酶体降解 从而导致 catenin在胞浆内积聚 并移向核内 当游离的 catenin进入细胞核内 即可与转录因子TCF LEF T cellfactor Lymphoidenhancerfactor 结合 激活TCF转录活性 调节靶基因的表达 因此 catenin是否磷酸化是该信号传递的关键因素 靶基因 目前已经研究鉴定出多种Wnt途径的靶基因 它们在细胞增殖 分化以及肿瘤形成中起重要作用 主要包括 细胞周期和凋亡相关基因c myc和cyclinD1 生长因子如VEGF vascularendothelialgrowthfactor 胃泌素 gastrin HGF hepatocytegrowthfactor c met等 参与肿瘤进展的基因MMP7 matrilysin MMP26 CD44和Nr CAM 转录因子ITF 2 immunoglobulintranscriptionfactor 2 和Id2 其他靶基因如COX 2等 由于这些因子在细胞增殖 分化以及肿瘤发生发展中分别体现不同的特点 因此Wnt信号传递是一种由多因子组成 涉及多个环节 多种调控的复杂过程 在正常生长的成熟机体中 细胞的生长 增殖和分化等具有一定的规律性和有序性 有限生长的细胞在没有Wnt信号时 Wnt通路呈关闭状态 但当Wnt途径激活时 就可能导致许多细胞出现灾难性的变化 使细胞发生异常的增生和分化 导致肿瘤形成 Wnt途径异常激活主要见于 1 组成Wnt途径的蛋白 转录因子或基因被破坏或变异 导致该途径关闭或局部途径异常活跃 2 过多Wnt信号使整个途径异常活跃 细胞进行不必要的增殖 3 细胞内其他因素通过Wnt途径来刺激或诱发细胞产生异常反应 在Wnt途径中 catenin TCF LEF复合体无疑是Wnt途径的枢纽 如前所述 Wnt途径激活是以 catenin定位变化 易位为基础 一旦 catenin易位于细胞核内 与TCF LEF结合 即可启动Wnt途径 因此 Wnt途径的调控可分为两部分 上游各组分结构和功能变化导致 catenin降解障碍 引起 catenin胞浆内积聚 核内 catenin激活TCF LEF引起下游靶基因转录 通过推动细胞周期发展或产生异常蛋白 使细胞发生癌变 catenin是第一个被确定为Wnt途径的成员 在细胞内 catenin具有二个定位池 一个是位于细胞膜 与E cadherin和 catenin形成粘附复合体 参与细胞黏附 另一个则在胞浆 catenin基因定位于3p21 由16个外显子组成 其中外显子3的第37 33 41 45位密码子编码区域构成 catenin蛋白的NH2末端 是GSK3的结合部位 也是致癌活化的位点 该区域的定向突变或缺失可导致 catenin活性过高 致使GSK3对 catenin降解受阻 catenin在胞浆内积聚 Clements对311例胃癌标本进行 catenin的检测 发现29 病例存在 catenin核内易位 19 存在3号外显子突变 研究发现 许多肿瘤中存在着不同程度的 catenin基因突变 如结直肠癌 肝细胞癌 甲状腺癌 卵巢癌和皮肤癌 catenin突变率可达50 以上 前列腺癌 子宫内膜癌和Wilms 瘤等为15 左右 胃癌为26 突变位点多集中在外显子3区域 特别是GSK3的结合部位 catenin的定位改变 除了受其本身基因突变的影响外 Wnt途径上游各组分形态和功能的变化也可影响 catenin的状态 主要包括Wnt APC GSK 3和Axin APC adenomatouspolyposiscoli 是一种与结肠癌发生有关的抑癌基因 定位于5q21 长度10 4kb 编码一组较大的多结构域蛋白 属于胞浆蛋白 具有支架蛋白的作用 APC蛋白 Axin和GSK3 可与 catenin形成复合物 而促进 catenin发生磷酸化 使 catenin得以被蛋白酶降解 在固有的和散在的大多数结直肠肿瘤中 均已发现有APC基因的突变或缺失 APC基因突变可发生于任何外显子 其中以第15外显子 654 2843密码子 最为常见 2000 1020 1169密码子和1323 2075密码子编码区域被认为是 catenin与APC的结合位点 该区域突变即导致 catenin不能与APC结合 进而不能被GSK3磷酸化 以致 catenin降解受阻而积聚于胞浆 因而APC是Wnt途径的负调控因子 在其他癌症如髓母细胞瘤 侵袭性纤维瘤病 乳腺癌等也可见APC异常 Axin具有多个蛋白 蛋白作用域 与APC一样起支架蛋白的作用 是支架蛋白复合体的构建基础 Axin的RGS功能域 regulatorsofGproteinsignalingdomain 能与全长的APC结合 但不能与截短的无活性APC结合 APC Axin GSK catenin形成复合物时 GSK靠近 catenin而促使其磷酸化 因此也是Wnt途径的负调控因子 在肝癌 结直肠癌 乳腺癌等肿瘤中检测到Axin基因突变 目前Axin被认为是抑癌分子 其基因突变可促进肿瘤的发生 GSK serin threonineglycogensynthasekinase3 可使 catenin磷酸化 磷酸化位点为 catenin的4个N端位点 s33 s37 T4 s45 这些磷酸氨基作为 catenin磷酸化的一种标志 表明它将被蛋白酶体通过水解而降解 GSK3是Wnt途径的负调控因子 同时也是候选抑癌分子 在Wnt信号通路发生异常时是否存在GSK3的突变问题尚少探讨 但已有在结肠癌中没有检测到GSK3突变的报道 GSK3是否具有其他功能 以及可能在其他途径中发挥重要的作用还有待研究 DSH Dishevelled 是Wnt途径正调控因子 其N端的DIX域 可结合Axin 中央区的PDZ域 为蛋白 蛋白相互作用的位点 可结合多种蛋白质 如CKI CBP Frat 酪蛋白激酶 等 而其C端DEP域则具有调节细胞的极性及移动的作用 Wnt分泌蛋白及其受体FZD在肿瘤中也可出现异常表达 在结肠癌 胃癌中 可见Wnt2 Wnt5A FZD1 2表达明显高于正常粘膜组织 但Wnt基因的突变和错义表达与人类肿瘤的直接联系迄今尚待阐明 To等对12例胃癌标本 7例为肠型 4例弥散型 1例混合型 检测Wnt受体FzE3及其相关蛋白hsFRP的变化情况 研究发现 75 病例存在FzE3表达上调 同时也观察到 catenin hsFRP和cyclinD异常表达 在胃癌细胞株的研究中发现 FZD2 FZD5 FZD7 FZD8 FZD9在不同的细胞株异常表达 Wnt家族的多个成员在另外一些细胞株也检测出有的情况高表达 TCF是Wnt途径下游组分 属于DNA结合蛋白 包括1个HMG盒子 highmobilitygroup 和 catenin作用域 HMG盒子具有与DNA结合的活性 通过与其它因子发生作用 而激活转录活性 有趣的是 TCF转录因子家族的不同成员具有不同的特性 尽管它们都可结合DNA 但在大部分情况下并不能激活转录 只有与 catenin发生作用后 才可激活转录过程 有报道在结直肠癌中 检测出Tcf 4突变 且同时存在APC或 catenin的突变 推测Tcf 4突变可能是附加突变 Wnt途径激活与肿瘤细胞的侵袭和转移 癌细胞最为重要的生物学特征是具有侵袭和转移的能力 这是造成恶性肿瘤患者预后不佳和导致死亡的主要原因 癌细胞的侵袭和转移包括以下几个过程 癌细胞粘附性改变 从原发灶脱落 突破基底膜 与细胞外基质作用 侵入周围基质和邻近组织 然后侵入淋巴管或血管 随血流或淋巴 在远部器官或组织建立新的癌细胞集落 在此过程中 涉及到细胞粘附性的改变 细胞外基质的降解 细胞增殖的改变及肿瘤血管形成等 随着对Wnt途径研究的深入 发现Wnt途径异常激活后 其靶基因中有些是与癌细胞的侵袭转移相关的基因 因而推测Wnt途径也可参与肿瘤的侵袭和转移 细胞间粘附的破坏可促进癌细胞的迁移和浸润 导致侵袭和转移 catenin在细胞中起着双重作用 除了参与Wnt信号转导外 还与E cadherin形成复合物定位于细胞膜 维持细胞间的粘附 在结肠癌研究中发现 在肿瘤侵袭前缘 癌细胞膜上E cadherin表达基本消失 然而胞核内可观察到 catenin表达 因而Wnt途径可能影响E cadherin的表达 利于癌细胞的侵袭 APC的突变也可通过激活Asef 降低E cadherin介导的细胞间的粘附 靶基因Nr CAM为免疫球蛋白类粘附分子 参与细胞间的连接 可转化成纤维细胞 肿瘤的侵袭和转移与该靶基因活动性增加亦密切相关 CD44基因编码合成的CD44属于细胞粘附分子 主要参与细胞 细胞 细胞 基质之间的特异性粘连过程 影响细胞的生长 浸润和迁移 在癌症的生长 淋巴结转移和远距离器官种植方面起着重要的作用 其拼接变异体CD44在正常粘膜上皮不表达 在转移性结肠癌中表达明显增强 且与不良预后有关 在胃癌等肿瘤中也观察到类似情况 有研究表明CD44可明显促进肿瘤细胞的分裂增殖和循环肿瘤细胞在继发器官的定位 并能通过促进ras基因的表达增加迁移蛋白的产生 是肿瘤转移的促进基因 另外 CD44表达阳性的癌细胞可产生免疫逃避 因而容易经淋巴道引起肿瘤细胞的侵袭和转移 虽然CD44在肿瘤转移过程中起作用 在肿瘤侵袭和转移过程中 细胞外基质的降解是重要的步骤 癌细胞只有破坏细胞外基质才可侵入血管 随血流转移到其它器官 蛋白水解酶可使细胞外基质降解 其中最为重要的是基质金属蛋白酶 MMP 7是蛋白溶解酶家族成员 通过降解基底膜和细胞外基质 促使肿瘤细胞的侵袭和转移 在转移性结肠癌的研究中 应用细胞系 动物模型或人癌标本 均观察到MMP 7的高表达 作为Wnt途径的靶基因 MMP 7不仅在结肠癌中与 catenin共表达 而且在侵袭前缘 可观察到MMP 7与胞核内 catenin共存 Wnt途径的靶基因COX 2可增强MMPs的表达 促进肿瘤的侵袭转移 肿瘤的生长和扩散与血管生成密切相关 启动血管生成是肿瘤增殖的先决条件 目前已发现有十数种促进肿瘤血管生成的生长因子 如VEGF EGF TGF FGF Angiopoietin等 而Wnt途径对血管的生成具有调节作用 其靶基因VEGF参与血管的生成 COX 2也可增强一些生长因子如PDGF等的表达 APC的突变可提高COX 2的活性 Holnthoner等研究表明Wnt途径可部分介导成纤维细胞生长因子 2 FGF 2 促进肿瘤的血管生成能力 虽然没有确切的资料证明Wnt的非典型途径Wnt Ca2 和平面的细胞极性途径参与肿瘤的发生发展 但它们的激活可间接影响典型Wnt途径中的成分 如Wnt Ca2 途径可激活PKC PKC的活化可使GSK3失活 进而抑制 catenin的磷酸化 使胞浆内 catenin含量升高 有研究发现PKC活化也可激活JNK 因为PKC是多基因家族 每个成员具有不同的组织表达特异性 因此与典型Wnt途径间的相互关系和影响错综复杂 许多的机制还有待研究 平面的细胞极性途径也可涉及Jun的活化 应用多种分子生物学方法 通过研究Wnt途径主要组分的基因表达情况 观察有无突变 缺失等改变 例如基因芯片 DNA测序分析 SSCP分析等 通过RT PCR技术 检测Wnt途径相关基因的mRNA水平 特别是实时PCR技术的出现和发展 使研究的精确性大大提高 传统的Northern杂交因其高敏感性也常用于Wnt途径的研究 在Wnt途径中最终发挥生物效应的是蛋白分子 因而检测其蛋白表达水平和分布具有重要意义 免疫组化染色即可定量分析 又可定位观察各因子的表达情况 是最常用的方法之一 已经克隆的抗体主要有 catenin抗体 APC抗体 TCF4和TCF3 4抗体 Wnt1 Wnt2和Wnt10抗体等 结合western印迹杂交 可以为更加深入研究Wnt途径的作用机制提供条件 胞外分泌蛋白和受体 Wnt基因编码长度为350 400氨基酸的分泌型糖蛋白 含有22 24个半胱氨酸残基 在哺乳动物有16个Wnt家族成员 通过与细胞表面 细胞外基质的联系而体现信使的作用 Wnt的受体分为两种 一是FZD Frizzled 受体家族成员 是具有7个跨膜片段的受体 其N端富含半胱氨酸 是Wnt蛋白的高亲和力结合位点 目前已发现11种 另一种是低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP5和LRP6 为Wnt配体的共受体成员 经典WNT信号转导通路 经典信号转导通路是Wnt蛋白通过Frizzled FZD 家族特异受体和LRP5 LRP6辅助受体结合 触发细胞内的信号转导 使 连环蛋白 catenin 聚集的级联反应过程 在经典Wnt信号转导缺乏时 catenin与Axin APC GSK 31等形成降解复合物 结合后的 catenin发生磷酸化 进而与泛素化蛋白结合被泛素化降解 在经典Wnt信号存在时 catenin将不再被CKI和GSK3 磷酸化 而是在胞浆中聚积并进入细胞核 核内的 catenin与T细胞因子 淋巴增强因子 TCF LEF 等转录因子和Legless蛋白 BCL9和BCL9L 及PYGO剖结合形成复合物 TCF LEF catenin Legless PYGO复合物启动靶基因FGF20 DKK1 WISP1 MYC andCCND1等的转录 非经典wnt信号转导通路 非经典wnt信号是通过fzd家族受体和辅受体ROR2和RYK转导的 在该通路中 小G蛋白 RHOA RHOU RAC 和CDC42 和c junN端激酶是DVL依赖的效应分子 而Nemo样激酶 NLK 和活化T细胞核因子 NFAT 则是钙依赖效应分子 NLK磷酸化TCF LEF转录因子去抑制经典的wnt信号通路 NFAT转录因子早期胚胎发生和致癌作用转移过程中起作用 非经典Wnt信号被转导到DVL 或者Ca2 依赖的级联反应 并与细胞极性信号通路重叠 Wnt基因家族成员的wnt 1 wnt 3和wnt 10b都是由MMTV诱发小鼠乳腺癌的过程中活化的痛基因 小鼠wnt 1 wnt 2 Wnt 3a wnt 5a wnt 7基因在体外均具有转化细胞的能力 目前研究表明 wnt基因及其受体异常与人类肿瘤的发生可能相关 例如 wnt 2和wnt 5a可能与大肠癌发生 发展有关 DKK 1失活在大肠癌进展中也可能起重要作用 Wnt信号转导通路中与肿瘤发生相关的靶基因 一旦经典Wnt信号转导通路被激活 将会使靶基因过度表达 从而影响细胞的增殖 分化 促进肿瘤的发生 第一个被确定Wnt信号转导通路的靶基因是原癌基因c myc 人们在结直肠癌细胞中发现 因APC突变而形成的p连环蛋白 Tcf4复合体 通过与c myc基因启动子上Tcf4的结合位点作用 使之活化表达 从而解释了为什么c myc在结直肠癌许多阶段都处于过表达状态 cyclinD1是调节细胞进入增殖期的主要因子 目前已被证实为原癌基因 1999年 Osamu等发现 p连环蛋白 Tcf4复合体可与cyclinD1启动子作用 引起其高表达 他们还发现活化的Ras也能通过上述的cyclinD1启动子上不同于Tcf Lef结合位点的区域来加强cyclinD1转录 此后 在实验性毒物诱发的大鼠结直肠癌中发现cyclinD1过度表达 并与B连环蛋白基因突变有关 反义cyclinD1cDNA的表达 可使结直肠癌细胞生长明显抑制 并能阻止裸鼠中SW480结直肠癌细胞生长 结果表明cyclinD1在肿瘤发生中起着关键作用 抗凋亡基因survivin在正常结肠上皮隐窝的基部表达 并激活Wnt信号 此外 在结直肠肿瘤中survivin表达增加 表明survivin是Wnt信号转导通路的靶基因 与肠道肿瘤发生密切相关的基因即环氧酶2 cyclooxygenase 2 COX 2 可能也是p连环蛋白 Tcf复合物的转录靶基因 Dolmetsch等发现 Wnt 1在小鼠乳腺上皮细胞中的表达 能上调COX 2基因的转录 其mRNA和蛋白水平均升高 前列腺素E2 PGE2 生成增多 研究表明 catenin是一个多功能蛋白 它存在于内皮细胞的细胞连接处 当有血管内皮生长因子存在的情况下 catenin会发生酪氨酸磷酸化 之后细胞连接松散 细胞活动能力增强 因此 在抑制肿瘤新血管生成方面 血管内皮生长因子则被认为是最主要的抗肿瘤治疗靶点 内皮抑素 endostatin 是X 型胶原的羧基末端片段 是一种特异的血管生成抑制因子 它能直接作用于内皮细胞 通过抑制血管内皮生长因子阻断细胞连接处 catenin的作用 来抑制内皮细胞的迁移 另一方面 通过使细胞质中 catenin降解 来干扰它对基因表达的调节作用 从而达到抑制肿瘤血管的生成 Wnt信号转导通路的组成 Wnt基因属于原癌基因 其编码的Wnt蛋白是分泌性蛋白 在脊椎动物中已发现至少20种 其中人类有l6种 长度大约为350 380个氨基酸 起始为疏水信号序列 其后包含着几个糖基化位点 并且富含半胱氨酸 wnt受体蛋白佛力子 FZ 位于细胞膜上 由FZD基因家族编码 是一族反复7次穿越细胞膜的跨膜蛋白 连环蛋白 catenin 是Wnt信号通路中有调控转录活性的关键成员 能在细胞核内与Wnt通路另一成员TCF结合从而激活靶基因的转录 糖原合成激酶3 GSK3 是一种丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 起到破坏APC复合体的关键作用 在无Wnt信号时有活性 将磷酸根加到 catenin的四个N端位点使这些磷酸氨基酸作为 catenin上的一种标志 在wnt信号存在时 磷酸化 catenin促使 catenin降解 APC是一种与结直肠癌发生有关的抑癌基因 能结合wnt途径中的多种成分 如AxinGSK3 catenin APC能刺激 catenin被GSK3 磷酸化 在调节 catenin的稳定性中起负性作用 促进 catenin的降解 轴蛋白 Axin 起支架蛋白的作用 可使GSK3 靠拢 catenin而促进 catenin被GSK3 磷酸化 并促进 catenin的降解 Dsh使Wnt信号的正调节物 是Wnt途径最上游的细胞内成分 有Wnt信号时被激活起支架蛋白作用 有三个高度保守的结构域在其功能中起重要作用 Dix域通过与Axin的相互作用在拮抗破坏APC复合体中起直接作用 DEP域通过在细胞中的定位与微管细胞骨架的关系而调控Wnt途径的活性中起重要作用 酪氨酸激酶 cKk 是一种丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 对Wnt途径起正调节作用 CKIs的表达使 catenin稳定 T细胞因子 淋巴样增强因子1 TCF LEF1 是序列特异的DNA结合蛋白 能将 catenin定位于靶基因的启动子的部位 MYC基因位于wnt途径的末端 属于即刻早期反应基因 是调控细胞周期的主要基因 在正常情况下MYC不仅与细胞增殖有关 与最终阻止细胞增殖的细胞程序化死亡也有很大关系 Wnt途径的实现 Wnt通路是通过调节TCF LEF1家族的DNA结合蛋白转录性质来调节细胞的行为的 其核心是胞质内 catenin的稳定性 catenin水平低下时 wnt通路关闭 当其水平较高时 wnt通路开放 catenin在细胞内水平受两组蛋白质的功能竞争调节 一组为降解蛋白类 APC蛋白复合体 由GSK3 Axin及APC蛋白组成 另一组为拮抗蛋白类 包括 Dsh CKIs GSK3 结合蛋白 GBP 在正常未受刺激的细胞中无wnt信号 胞质内 catenin大部分与细胞膜上钙黏着蛋白结合使之附着于细胞骨架蛋白肌动蛋白上 介导同型胞间黏附 对于少部分的 catenin APC复合体中Axin使GSK3 向 catenin靠拢并与APC一同促使 catenin氨基末端ser thr位点被磷酸化进而泛素化 最终被蛋白水解酶所降解 同时TCF LEF与多种转录抑制蛋白 如GRO家族成员c末端结合蛋白 ctBP 等结合而阻止Wnt靶基因的表达 当Wnt通路活化时 Wnt与受体FZ结合激活细胞内的CKIs CKIs使Dsh磷酸化 释放GBP 结合与Axin联系的GSK3 从而抑制GSK3 对 catenin的磷酸化降解的作用使未磷酸化 catenin在胞质中积累并转运到核中 破坏LEF TCF家族与GRO GBP抑制蛋白形成的复合蛋白 从而激活转录因子 进一步激活MYC基因开始进行转录 刺激细胞增殖 Wnt通路的信号活性 各种组织器官的发育过程中 都存在Wnt信号的传递在造血系统中Wnt信号对于造血干细胞的自我更新起着重要了的调节作用 将编码 catenin IRES GFP的逆转录病毒以及不含 catenin的空病毒载体分别感染造血干细胞 发现转有空载体的造血干细胞34 处于细胞周期的S G2 M期 而表达 catenin的造血干细胞有58 处于同一期 1 Wnt通路对造血干细胞及造血微环境的调节 转染 catenin的造血干细胞在体外无血清培养条件下 添加一定量的SLE 经过8 9代的培养 细胞可扩增为原来的100倍 而对照组却无明显增加 完全去除SLE后 转染空载体的细胞75 80 出现定向分化标志 而转染 catenin的细胞中仅5 10 出现分化标志 这表明有活性的 catenin可维持造血细胞处于非成熟状态 同时促进造血干细胞的扩增 转染 catenin的造血干细胞在体外培养1周后 植入非致死剂量照射的小鼠体内 8周后发现 植入125个造血干细胞 就可以完全达到重建造血 而且每只小鼠均达到粒系 T系及B系的重建造血 而植入125个转染空载体的造血干细胞却不能重建小鼠的造血功能 另外 catenin的抑制子Axin的表达可抑制造血干细胞的增殖 降低非致死量射线照射小鼠造血系统的重建能力 此外 在造血干细胞及其微环境中发现了Wnt受体的表达 人类造血干细胞表达 基质细胞也表达FZ 6家族的一些成员 在体外Wnt5a可促进造血干细胞扩增 撤除Wnt5a则造血 祖细胞扩增明显减少 原始细胞形成减少 转染wnt1 Wnt5或Wntl的293细胞条件培养基联合一些细胞因子 如KL IL 3等可刺激造血干细胞扩增7倍 8倍或11倍 这些证据表明 造血干细胞及其造血微环境可以接受wnt信号并对其作出反应 而且wnt信号对造血干细胞微环境中各细胞成分的维持有调节作用 以维持造血微环境的稳定 2 Wnt通路对神经前体细胞的调节 在CNS catenin信号能控制神经前体细胞的生长以及细胞增殖与分化的平衡 研究者利用两个条件性的 catenin突变型等位基因来改变CNS组织中的 catenin信号 一个剔除 catenin 另一个过表达有活性的 catenin 在剔除 catenin以后 小鼠大脑和脊髓的神经组织成分减少 神经前体细胞群也不能维持 而过表达 catenin小鼠的大脑和脊髓组织成分则大量增加 神经前体细胞群体增大 说明 catenin信号对神经前体细胞池的维持 神经前体细胞的增殖与分化至关重要 神经嵴是脊椎动物神经系统发育过程中一个由多潜能细胞群体构成的迁移性结构 Wnt蛋白参与神经嵴发生 Saint Jeannet等发现正常情况下表达于神经管背侧域的Wnt 1和Wnt 3a 在爪蟾外植体中通过与noggin和chordin的协同 能诱导神经嵴的形成 表现为神经嵴标志物Krox 20 AP 2及slug的表达 Wnt 1和wnt 3a的过表达将导致神经嵴细胞增多 而GSK 3 的过表达由于抑制了Wnt catenin途径 能导致上述神经嵴标志物分子表达的明显下调 Ikeya等通过抑制Wnt 1和wnt3a的表达 也发现会导致小鼠神经嵴衍生物明显不足 同时背外侧神经管中的神经前体细胞显著减少 3 Wnt通路对其他细胞增殖分化的调节 Wnt信号除了对造血干细胞增殖分化有调控作用时 对其他干细胞也有作用 在对胚胎干细胞的研究中发现 如果APC基因突变则可抑制胚胎干细胞向三胚层组织分化而维持其增殖状态 这一效应主要是通过胞内 catenin浓度的升高来实现的 间充质干细胞是来源于骨髓的多潜能干细胞 在体外可分化为骨 软骨 脂肪细胞 小剂量的Wnt可以扩增未分化的间充质干细胞 而大剂量的Wnt则抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化 增加碱性磷酸酶的表达 表明其有促进成骨形成起始的作用 Hussain等通过实验证明 Wnt catenin信号通路对胚肝细胞的增殖分化起作用 将取自小鼠胚胎的肝组织在含有Wnt3无血清的条件培养基中培养 对照组中培养的肝细胞出现结构及增殖能力的丢失 细胞凋亡增加 而在含Wnt3的胚胎肝细胞条件下则表现出细胞数量的增加合类管组织的重排 此外 wnt信号对表皮干细胞 毛囊干细胞等均有不同程度的影响 4 wnt信号通路与肿瘤的发生 癌基因或抑癌基因的突变均可导致正常调控细胞增生的调节途径不恰当的活化 使细胞增生失控而致肿瘤生成 在Wnt通路中任何一步发生障碍都可致癌 其异常情况大致可分为3类 一是组成wnt信号途径的蛋白 转录因子或基因被破坏或变异导致该途径关闭或局部途径异常活跃 二是过多的Wnt信号使整个途径都异常活化 细胞进行不必要的增殖 三是没有wnt信号时 细胞内其它的活动也会通过Wnt途径来刺激或诱发细胞乃至机体不正常反应 已发现wnt信号途径的成分在多种人类癌症中发生突变 如APC catenin等 这些突变使细胞无能力 catenin至恰当水平 突变 catenin会产生功能增加的 catenin蛋白也可逃避破坏复合体的调节 这些突变的最终结果是Wnt靶基因的组成性激及细胞增生的失控 当 catenin氨基末端的磷酸化位点被除去后 catenin对GSK3 的负调控就不敏感了 人类多种肿瘤的产生与这些磷酸化位点的突变有关 其可能的原因丝磷酸化位点的突变导致 catenin不能被有效降解 在胞质内过量积聚后进入胞核 无限制地激活下有基因 产生肿瘤 而过度的Wnt信号将破坏抑癌基因 激活重要的原癌基因 并通过wnt途径导致癌症 Wnt信号途径 Wnt信号转导途径是目前已知的胚胎发育所必须的信号转导途径 同时在肿瘤的发生 发展中该途径也占据着重要的位 现已经证实 该通路的过度激活与多种人类肿瘤的发生有密切的联系 尤其在大肠癌的发生 发展上 目前研究表明 约90 的大肠癌发生与该通路过度激活有关 大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一 其发病呈上升趋势 严重威胁人民生命健康 目前主要采取以手术和放化疗为主的综合治疗 传统的化疗药物对患者的预后也只能起到有限的作用 因此新的分子靶向治疗迫在眉睫 Wnt catenin信号途径在胚胎发育过程以及多种肿瘤的发生 发展中起重要作用 由于其在人类不同肿瘤中的广泛激活 调节细胞的生长 迁移和分化 已被公认为肿瘤发生过程中关键的信号通路之一 尤其在大肠癌的发生 发展上 目前研究表明 约90 的大肠癌发生与该通路过度激活有关 近年研究发现 一些非甾体抗炎药 植物类化合物 酪氨酸激酶抑制剂和血管生成抑制剂等能抑制 Wnt catenin信号途径过度激活 以及针对该途径重要信号分子的小分子抑制剂和基因治疗等分子靶向治疗均显示了很好的抗癌前景 Wnt catenin通路是高等动物胚胎组织发育分化所必需的关键信号通路 主要参与细胞的增殖 分化 极化 凋亡与抗凋亡等 研究表明 Wnt catenin通路在卵巢发育过程中起到了关键性的作用 同时 对正常卵泡的发育以及卵巢的功能产生影响 Wnt信号途径的异常激活也与肿瘤的发生密切相关 有十几种目前已知的高发性癌变源于Wnt信号转导途径的失调 catenin catenin在wnt通路中处于一个中心位置 catenin基因位于人染色体3p21其蛋白质一级结构包括3个重要的功能性区域 含150个氨基酸的N端 550个氨基酸的中间重复区域 和含100个氨基酸的e末端 catenin的突变主要位于外显子3的33 37 4l 45位密码子 区域末端正是是GSK 3B的结合位点而这些密码子编码的 catenin蛋白NH2其突变或缺失会导致 catenin不能与GSK3 结合 而不被降解中间重复区域是 catenin与多种配体如TcffLEF Axin E 钙粘蛋白等结合的重要部位 C末端则和中间重复区域共同参与Tcf LEF的活化 catenin基因结构见图 catenin是一种多功能蛋白 通过形成catenin E cadherin复合物 参节细胞 细胞黏附以及细胞 ECM间的相互作用 胞浆内游离的 catenin可被遍在蛋白化 进入蛋白酶系统而降解 胃癌时 常由于E cadherin的下调而使cadherin catenin复合体减少 使癌细胞更易于呈现侵袭性 经典Wnt信号转导途径致癌的关键是该途径任何一个信号分子异常致 catenin在胞质中累积 继而进入核内激活Tcf 4转录因子 启动靶基因转录 因此经典wnt信号转导途径又称为wnt catenin信号转导途径 我们对wnt catenin信号转导途径与大肠癌发生 发展的关系 以及针对该信号途径的治疗策略做一概述 经典Wnt B cafenin信号途径 经典Wnt catenin信号包括胞膜 胞质 胞核信号3部分 可概括为 wnt蛋白与胞膜上的卷曲蛋白 frizzled Frz 受体及低密度脂蛋白受体相关蛋白 10wdens时lipoproteinreceptorrelatedprotein LRP 5 LRP 6辅助受体结合 同时wnt和Frz受体的结合被wIF 1 cerberus和FrzB竞争性抑制 而Dickkof家族 DKK 1 DKK 2 通过间接减少可利用的辅助受体LRP的数量来间接抑制Wnt与膜受体的结合 3圳 胞膜上的Wnt信号活化后使胞质内散乱蛋白 dishevelled Dsh 激活 Dsh被磷酸化 抑制 catenin降解复合体降解B catenin catenin降解复合体包括大肠腺瘤息肉蛋白 adenomatouspolyposiscoli APc 轴蛋白 axin 糖原合成酶激酶 glycogensynthasekinase 3B GSK 3B 和酪蛋白激酶1 8 caseinkinase cKlCc 等 catenin降解复合体异常 如APC或axin突变等 和 catenin基因本身突变均可致 catenin降解障碍 在胞质内积累继而进入细胞核 激活转录因子Tc LEF 启动靶基因转录 如c myc cyclinDl MMP 7 FGF 18 EGFR等 Wnt catenin信号途径在大肠癌发生 发展中的作用 wnt基因及其受体异常wnt基因家族至少包含19个富含半胱氨酸的糖化蛋白 wnt蛋白在胞膜上和Frz的7次跨膜受体相结合 同时结合LRP 5和LRP 6 这是Wnt信号通路活化的重要起始信号wnt途径抑制剂wIF 1 Cerberus FrzB等竞争性抑制wnt与Frz结合 而Dickko镓族通通过过问问接接减减少少叨可利利用用的的辅辅助助受体LRP的数量来间接抑制wnt与膜受体的结合 catenin基因异常 catenin基因 CTNNBl 定位于人染色体3P21 P22 该区域是人类基因组经常发生恶性改变的区域 基因全长23 2kb 共有16个外显子 其mRNA长度为3362个核苷酸残基 catenin基因外显子3的第33 37 41 45位密码子编码区域构成的 catenin蛋白的NH2末端 他是与复合体结合后发生磷酸化的位点 其缺失或突变会导致 catenin不与复合体结合而免于降解 导致 catenin在胞质的积聚 游离的 catenin进入核内与Tcf 4结合 促进相应的靶基因转录 则可促使肿瘤的发生 在大肠腺瘤和大肠癌中有相当比例的肿瘤有 catenin基因突变 且以外显子3最为常见 在APC基因完整的大肠癌中 catenin基因外显子3的突变率高达50 在实验性毒物诱导的动物大肠癌中也可频繁检测到 catenin基因突变 catenin降解复合体异常 catenin降解复合体的功能在于使 catenin磷酸化 而后被泛素 蛋白酶体系统降解 APc基因最初是从家族性多发性息肉腺瘤综合征 FAP 患者中发现并克隆的 现在公认为是一个典型的抑癌基因 APC基因与结肠癌发生的关系极为密切 其突变后可导致结肠上 皮细胞过度增生 形成息肉 最终导致肿瘤的形成 大约80 散发性结肠癌中可检测到APc基因缺失突变或失活 而APC基因的缺失或失活被公认为是结肠癌发生的早期axin基因也和APC基因一样起抑癌基因作用 研究发现 一些没有APC和 catenin基因突变的大肠癌中出现了axin的突变 导致 catenin的核累积 并与错配修复缺陷密切相关 catenin降解复合体任何一个信号分子突变 缺失或功能异常等均可致 catenin降解受阻从而在胞质内累积 随即游离的 catenin进入核内 激活靶基因的表达 Tcf 4及其靶基因异常 Tcf家族包含4个不同的蛋白Tcf l Tcf 2 Tcf 3 Tcf 4 Lef在大肠正常上皮及肿瘤细胞中表达的主要是Tcf 4人Tcf 4 hTcf 4 是人结肠上皮主要的家族成分 其基因编码定位于染色体10q25 包括17个外显子和许多选择性结合位点 Duval在24株大肠癌细胞中发现有12株细胞Tcf 4发生突变 其中有半数发生在基因的3 末端 这些突变基因产物可能减少C 末端结合蛋白的结合 从而增强基因的转录活性 说明Tcf 4基因在结肠癌的发生中起重要作用 且各种原因过渡激活Wnt信号途径后均可致 catenin在胞质内累积 游离的 catenin进入核内与Tcf 4结合形成复合物 启动下游靶基因的异常转录从而促进肿瘤发生及细胞周期进程 这些靶基因多与细胞凋亡 细胞生长 血管生成及肿瘤侵袭转移有关 如c myc cyclinDl MMP 7等 我们通过对 catenin与c myc cyclinDl蛋白在大肠癌的表达情况进行相关分析 结果显示 catenin与c myc cyclinDl表达均呈明显正相关 提示 catenin异位表达可能是原癌基因c myc和cylinDl激活的原因之一 并在大肠癌发生 发展中起重要作用 Wnt catenin信号途径 Wnt catenin信号途径目前是公认的与大肠癌等多种肿瘤发生 发展密切相关的信号途径 因此近年国内外学者从多方面研究了针对该信号途径的干预策略 包括多种非细胞毒性药物 如非甾体类抗炎药物 植物类化合物等 对该途径的调控作用 以及针对该途径重要信号分子的小分子抑制剂 分子靶向治疗和基因治疗等 Wnt catenin信号转导通路 图1 在生物进化中极为保守 从低等生物果蝇至高等哺乳动物 其成员都具有高度的同源性 它调节转录辅助因子 catenin的稳定性并依赖 catenin基因的表达 Wnt catenin信号转导通路异常与人类疾病有关 包括肿瘤 骨质疏松 衰老和退化障碍等 因此 对wnt catenin信号转导通路的研究不仅有助于理解人类疾病的发生机制 而且可以为疾病的治疗提供一系列新的靶点 目前研究证实 至少有6种Wnt蛋白 Wntl Wnt2 Wnt3 Wnt3a Wnt8和Wnt8b 可以激活wnt catenin信号转导通路 Wnt catenin信号转导通路的活化由细胞质中 catenin蛋白水平决定 正常情况下 细胞质中 catenin由泛素蛋白酶体介导呈降解状态而维持低水平表达 泛素蛋白酶体是由轴蛋白 axin 大肠腺瘤息肉 adenomatouspolyposiscoli APC 蛋白 糖原合成激酶3 glycogensynthesiskinase 3 GSK 3 和酪蛋白激酶l caseinkinaselct CK1 等组成的多蛋白复合物 包括泛素激活酶 E1 泛素结合酶 E2 和泛素连接酶 E3 GSK 3 通过磷酸化Ser33 Ser37和Thr41标记蛋白 CK1 通过磷酸化Ser45标记蛋白 使其被E3亚基6 转导素重复蛋白 transducinrepeatcontainingprotein TrCP 识别 介导 catenin分子的降解 26S的蛋白酶体也随之被降解 Wnt蛋白通过与细胞表面受体复合物跨膜蛋白 共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白 LRP 结合启动细胞内 catenin的聚集 但是 目前对于Wnt蛋白结合Fz LRP受体后引起细胞信号转导的机制还不十分清楚 多数学者认为 2者结合后 受体复合物下游蛋白即细胞质散乱蛋白 disheveled Dv1 被磷酸化 抑制GSK 3 和CK1 的活性 并通过固定axin蛋白 破坏多蛋白复合物的形成 最终导致非磷酸化 catenin在细胞质中聚集 并逃脱 TrCP的识别 避免了被降解的过程 进而转位到细胞核 在细胞核内 catenin与TCF形成复合物 当没有 catenin存在时 TCF与Groucho相互作用形成复合物抑制转录活性 当 catenin存在时 则干扰TCF与Groucho的相互作用 与TCF和其他转录辅助因子如CREB结合蛋白 CREBbindingprotein CBP 共同启动下游靶基因的转录 非甾体类抗炎药物NSAIDs NSAIDs在大量的流行病学和临床研究资料表明 现有的许多非细胞毒性药物显示良好的抗癌前景 研究最多的是非甾体类抗炎药物 其中包括选择性COx 2抑制剂 许多肿瘤均高表达C0 x 2 大量研究表明 NsAIDs抗癌作用机制主要与其抑制肿瘤细胞COx 2表达有关 但同时也有较多研究表明 NsAIDs对不表达COx 2的肿瘤细胞也有较强的抑制作用 因此认为NSAIDs可能通过C0 x 2依赖和非依赖机制同时发挥抗癌作用 目前研究表明 Wnt catenin信号途径是多种NSAIDs作用的分子靶点 Dihlmann研究表明 消炎痛 indomethacin 和阿司匹林 aspirin 均可抑制大肠癌细胞 catenin Tc蹒录活性和靶基因cyclinDl表达 对 catenin Tc复合物形成无影响 Dihlmann研究也表明 阿司匹林可增加大肠癌细胞 catenin蛋白磷酸化 从而促进 catenin降解 在人体试验研究也发现 舒林酸 sulindac 的抗癌活性与其抑制FAP患者腺瘤组织 catenin核表达有关 多种NSAIDs在预防致癌剂诱发的动物大肠肿瘤发生上也起了重要作用 其机制多与其抑制 catenin核表达密切相关 植物类化合物 流行病学调查显示 大肠癌的发病与饮食结构有关 西方发达国家人群中其发病率明显高于那些以素食为主 进食较少肉类和动物脂肪的人群 如东南亚地区的居民 许多植物多酚化合物 抗氧化剂 脂肪酸等对大肠癌有明显的预防和治疗作用 并能提高放化疗敏感性 减轻放化疗对正常组织的毒性反应 已有研究证实 姜黄素 curcumin 可抑制大肠癌HCTll6细胞的 catenin Tcf转录活性和 catenin Tcf与DNA结合活性 促进caspase介导的 catenin降解 并下调靶基因c myc表达 绿茶和白茶均可抑制转基因小鼠c57BL 6JAPC Min 小肠肿瘤发生率 其机制与下调 catenin cyclinDl和cc myc蛋白表达密切相关 绿花椰菜 broccoli 的成分之一莱菔硫烷 sulforaphane 可抑制大肠癌Sw480细胞的 catenin和cyclinDl表达 下调cyclinDl启动子活性 并诱导细胞生长受阻和凋亡 植物类化合物拉帕醌呈剂量依赖方式诱导大肠癌HcTll6细胞生长受阻和凋亡 与其激活caspase 3 促进 catenin降解密切相关 咖啡酸苯乙酯 CAPE 是一种酚类抗氧化剂 广泛存在