（林木遗传育种专业论文）植物铁蛋白基因表达载体的构建及对烟草和杨树的遗传转化.pdf

摘要 摘要 本研究利用反义r n a 技术验证植物铁蛋白的基因功能。用农杆菌介导法将大豆铁蛋白 基因s o y f e r l ( m6 4 3 3 7 ) 和烟草内源反义铁蛋白基因n t f e r 2 ( a y1 4 11 0 5 ) 的e d n a 分 别导入烟草，得到转基因烟草，并采集烟草种子。对t l 转基因烟草的卡那霉素抗性分析 表明，整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡 那霉索抗性的转基因植株进行p c r s o u t h e r n 检测和n o r t h e r n 杂交分析表明，外源基因已 整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。将转基因株系移栽到铁离子不同的培养基中生 长进行比较表明，转大豆铁蛋白基因株系的生长量明显高于非转基因株系和转内源反向铁 蛋白基因烟草株系，而转内源反义铁蛋白基因株系的生长量则明显低于与非转基因株系和 转大豆铁蛋白基因株系。转大豆铁蛋白基因株系和转内源反义铁蛋白基因株系的叶绿素 量、m d a 含量和p o d 活性等生理性状也发生了明显变化。表现为转大豆铁蛋白基因株系 的叶绿素量和p o d 活性明显高于与非转基因株系，而转内源反义铁蛋白基因株系的叶绿 素量和p o d 活性等则明显低于与非转基因株系。运用同样的方法将大豆铁蛋白基因 s o y f e r l 导入杨树基因组中，对转基因杨树进行了p c r 、p c r - s o u t h e m 检测，初步证明 s o y f e r l 整合到杨树基因组中。 关键词铁蛋白基因表达转基因大豆烟草杨树 a b s t r a c t f o rs t u d y i n gt h ee f f e c t so ff a - r i f i ng e n eo v e r e x p r e s s i o na n di n t e r f e r e n c e0 1 1g r o wr a t ei n t r a n s g e n i ct o b a c c o ( n i c o g a n al a b a c u m l 1p l a n t se x p r e s s i n gs o y b e a n ( g l y c i n e 玎蹦m e r r ) f e r r i t i n g e n e ( s o y f e r l ，m6 4 3 3 7 ) a n da n t i s e n s et o b a c c of e r r i t i ng e n e ( n t f e r 2 ，a y1 4 11 0 5 ) ，t h e e x p r e s s i o nv e c t o rh a sb e e nc o n s t r u c t e db yp l a c i n gs o y b e a nf e r d t i nc d n a a n da n t i s e n s ef e r r i t i n c d n au n d e rt h ec o n t r o lo ft h ec a m v3 5 sp r o m o t e rt h r o u g hr e p l a c eg u sg e n eo fp b l l 2 1 ， t r a n s g e n i c t o b a c c ow e r ep r o d u c e d b y c o c u l t i v a t i o no fl e a fd i s k sw i t l l a g r o b a c t e r i u m m m e f a c i e n sc o n t a i n i n gt h ev e c t o r k a n a m y c i nr e s i s t a n c ea n a l y s i so ft 1g e n e r a t i o no ft r a n s g e n i c t o b a c c os h o w st h a tm o s to ft ig e n e r a t i o nh a s3 ：1 s e p a r a t er a t i o s ，o n l yf e wh a s1 5 ：1s e p a r a t e r a t i o s t h i si n d i c a t e dt h a ta b o u t1 - 2c o p ye x o g e n o u sg e n e si n t e r g r a d e di n t ot o b a c c og e n o m e t h e e x o g e n o u sg e n ee x p r e s s i o nw a se x a m i n e db yn o r t h e r n - b l o ta n a l y s e s c o m p a r i s o no f t h eg r o w t h r a t eb e t w e e nn o n t r a n s f o r m a n ta n dt r a n s g e n i et o b a c c op l a n t sg r o w no nm sm e d i u mc o n t a i n i n g h i g hf e 2 + t h ee n h a n c e dg r o w t ho ft r a n s g e n i ct o b a c c oe x p r e s s i n gs o y b e a nf e r r i t i ng e n ew a g o b s e r v e da tt h ee a r l yd e v e l o p m e n ts t a g e s ，r e s u l t i n gi np l a n th e i g h ta n df r e s hw e i g h t ss i g n i f i c a n t l y g r e a t e rt h a nt h o s ei nt h en o n t r a n s f o r m a n t sa n dt r a n s f o r m a n t se x p r e s s i n ga n t - t o b a c c of e r d t i ng e n e s o y b e a nf e r r i t i ng e n es o y f e r lw a st r a n s f e r r e di n t oe d a v i d i a n a x e b o u e a n ab yt h es a m ew a y w i t h 1 o b a c l 7 , o k e y w o r d s f e r r i t i n ，g e n ee x p r e s s i o n ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，s o y b c a n ，t o b a c c o 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅i 垦盎些盘堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：辱瓜4 签字日期：洄9 年6 月移日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解壅i 垦盐些盘鲎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权盔a 垦盎些盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：压琬媚 签字日期：如咿年占月江e l 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 晒d 月 一 ! 奠 晖复岬 师 字 导 签 1 绪论 1 绪论 1 1 课题背景( 或引言) 2 0 世纪8 0 年代初发展起来的植物基因工程技术，使全球生物技术产业取得了较大成 就。据不完全统计，国际上已有3 5 个科的1 2 0 多种植物获得转基因植物，包括一些重要 的农作物、果树和林木等。利用基因工程技术改造植物的品质、提高作物的产量、增强植 物的抗逆性以及缩短植物生长周期等方面都是当前植物改良的趋势。目的基因的分离及功 能的研究是基因工程的基础，因而对已知基因的功能及其表达的分析也成为当前基因工程 研究的热点。 铁作为一种矿质元素，在植物体内含量很少，属于微量元素，大约占植物干重的 o 0 2 ，主要存在于叶片当中。铁元素在植物体内起着很重要的作用。如何提高对铁的利 用，一是提高对铁的吸收能力，二是提高对铁的运转能力【l 】。铁蛋白是一种广泛存在于动 物、植物和微生物中的储铁蛋白，是植物生长发育使用的储存铁的唯一来源，该蛋白的主 要功能是在种子形成、叶片衰老或环境中铁过量时积累铁，在种子萌发或质体绿化过程中 释放铁，从而调节植物对铁的吸收和释放 2 1 。还有研究表明，增强植物铁蛋白基因的表达 会有多种效果，不仅可以增加植物种子和叶片中的铁含量，又能增强植株对逆境胁迫的抗 性，还可以提高植物的生长速度【3 】。 本研究为明确铁蛋白基因过量表达对植物生长的促进作用，将大豆铁蛋白基因及烟草 内源反义铁蛋白基因的c d n a 分别转入烟草，增强和抑制烟草中铁蛋白基因的表达，利 用反向遗传学验证铁蛋白基因的功能。通过对转基因植株后代进行分子检测、遗传表型分 析和生理检测分析，验证铁蛋白基因促进植物生长的功能，为利用铁蛋白基因培育植物新 品种提供依据。并将大豆铁蛋白基因转入模式树种杨树，为培育出具有优良性状的林木品 种奠定基础。 1 2 铁在植物中的作用 1 2 1 铁的生理意义 铁是植物结构组分元素，是微量元素中被植物吸收最多的一种。1 8 4 4 年e g l i s 发现 铁是必需元素。铁的化学性质使其成为氧化还原反应的重要因子，它有不止一种氧化态，能 根据反应物的氧化势接受或提供电子，由二价铁离子变为三价铁离子，或由三价铁离子变 为二价铁离子，达到转移电子的目的。铁也能与电子供体或配体结合生成复合物，配体提 供多于一个电子时发生螯合，可与含氧、硫、氮的分子生成稳定螯合物。铁为在有机分子 l 绪论 和铁之间运动的电子提供了酶促转化的势能【4 】。 铁在植物体内的生理生化功能主要有以下3 个方面： 参与叶绿素的合成铁虽然不是叶绿素的组成成分，但铁在叶绿素前体的合成过程 中必不可少。在高等植物中，叶绿素的合成是以a 2 酮戊二酸，谷氨酰胺等五碳糖为底 物，在r 2 氨基已酰丙酮酸合成酶的作用下首先合成叶绿素的前体，即r 2 氨基2 酮戊酸或 r 2 氨基乙酰丙酮酸，然后进一步合成亚铁原卟啉或吡咯环。这一过程与顺乌头酸酶活性 或铁氧还原蛋白的含量都有关。植物缺铁时，该酶的活性显著降低，吡咯环和卟啉环都不 能形成，从而限制了叶绿素的合成【5 】。t e r r y 发现，缺铁条件下生长旺盛的新生组织中铁 与叶绿素的含量有很好的相关性，多数铁均分布于类囊体膜上，植物缺铁时，类囊体解 体，铁与叶绿素含量相应降低。当植物处于缺铁介质中时，铁与叶绿素比值常保持恒定， 进一步证实了上述观点【6 】。 参与光合作用植物体内许多含铁的化合物都参与了光合作用过程中的一些反应， 如细胞色素氧化酶复合体、铁氧还蛋白、血红素、豆血红素等。植物缺铁时，这些物质的 含量及含铁酶的活性都降低，无疑会影响光合作用的正常进行【_ n 。缺铁还会导致类囊体解 体、叶绿素合成受阻，从而极大地抑制光合作用。植物缺铁时还会导致光合作用中电子传 递链的中断，电子不能正常传递，影响了水的光解，阻断了光合作用的进行。植物体内铁 主要通过上述方面来影响光合作用，进而影响到植物体内同化产物的合成。 参与呼吸作用一些与呼吸作用有关的酶中都含有铁，如细胞色素氧化酶、过氧化 物酶、过氧化氨酶等，铁常处于这些酶结构中的活性部位。植物缺铁时，这些酶的活性受 到影响，并进一步使植物体内一系列氧化还原作用减弱，电子不能正常传递，呼吸作用受 阻，a t p 合成减少，植物生长发育受到明显的影响嘲。 1 2 2 缺铁对植物的影响 铁在植物体中是最为固定的元素之一，通常呈高分子化合物，即以铁蛋白的形式储 存，称为植物铁蛋白。铁蛋白流动性很小，老叶片中的铁不能向新生组织转移，因此缺铁 首先出现在植物幼叶上。缺铁植物叶片失绿黄白化，心叶常白化，称“失绿症”。初期脉问 退色而叶脉仍绿，叶脉颜色深于叶肉，色界清晰，严重时叶片变黄，甚至变白，果树等木 本树种容易缺铁。新梢叶片失绿黄白化，称“黄叶病”。失绿程度由下向上依次加重，夏、 秋梢发病多于春梢，病叶多里清晰的网目状花叶，又称“黄化花叶病”。通常不发生褐斑、 穿孔、皱缩等。严重黄白化的，叶缘亦可烧灼、干枯、提早脱落，形成枯梢或秃枝。如果 这种情况几经反复，可以导致整株衰亡。豆科作物如大豆最易缺铁，因为铁是豆血红素和 固氮酶的成分。缺铁使根瘤菌的固氮作用减弱，植株生长矮小。缺铁时上部叶片脉间黄 绪论 化，叶脉仍保持绿色，并有轻度卷曲，严重时全部新叶失绿呈黄白色，极端缺乏时，叶缘 附近出现许多褐色斑点，进而坏死。禾谷类作物水稻、麦类及玉米等缺铁，叶片脉间失 绿，呈条纹花叶，症状越近心叶越重。严重时心叶不出，植株生长不良，矮缩，生育延 迟，有的甚至不能抽穗。果菜类及叶菜类蔬菜缺铁，顶芽及新叶黄白化，仅沿叶脉残留绿 色，叶片变薄，一般无褐变、坏死现象。番茄叶片基部还出现灰黄色斑点【4 】。 1 3 铁蛋白 1 3 1 铁蛋白结构 铁蛋白( f e r n t i n ) 是一种可以储存铁离子的储藏蛋白，在细胞内具有调控铁生物功能的 作用。铁蛋白是由2 4 个同源或异源亚基所结合成的一个蛋白质复合体，壳中央可以储存 o 45 0 0 个铁原子。铁蛋白的三维结构是高度保守的。植物铁蛋白亚基首先形成一种前 体物质，该前体物质一般具有一个超过7 0 个氨基酸残基的n 端伸展肽( e x t e n t i o n p e p t i d e ，e p ) 。伸展肽的第一部分是一个质体定位( p l a s t i dt a r g e t t n g ，p t ) 序列( 大约4 0 个残 基) ，用于铁蛋白在质体中的定位，在蛋白质进入质体后被剪切掉。第二部分伸展肽序列 是植物特异的序列，存在于成熟铁蛋白的n 端，可能是体外蛋白质稳定性调控的一个重 要决定因素。铁蛋白储存铁的过程主要包括f e 2 + 的氧化、f e 3 + 的移动、矿质铁心的形成 和生长f 9 1 。铁蛋白通过对铁元素的吸收与释放来调节细胞内的铁水平含量。铁蛋白一般通 过以下两种方式结合亚铁离子：i 两个亚铁离子结合到铁蛋白中通道附近的位点上，然 后0 2 进攻fc ：2 + ，将其氧化，产生的f e ( o h ) 3 沉淀与空洞之中，f e 2 + 氧化反应不产生毒 性自由基；亚铁离子直接结合到洞中心的表面，表面的其它分子可催化fe ：2 + 的氧 化，随即沉积于氧化部位。二价铁变为三价铁或三价铁变为二价铁的氧化还原作用就是由 于铁蛋白释放和吸收铁离子造成的，这一点非常重要，因为它调节着铁离子的代谢需求， 解决了铁离子不溶解性和毒性的问题u 0 。 1 3 2 植物铁蛋白的分布 最早通过电子显微镜技术，仅在质体的基质中检测到铁蛋白的存在。尽管在叶绿体中 也有铁蛋白，但其主要还是分布在低光合活性的非绿色质体，如前质体、白色质体、有色 体、造粉体以及种子、幼苗、根的顶部d 3 和豆科植物年幼的根瘤中 1 6 】。另外，在植物导 管细胞、维管形成层、生殖细胞和衰老的细胞中也发现有铁蛋白的存在【l ”。 1 3 3 植物铁蛋白的生物学功能 近十几年来，人们对植物铁蛋白进行了一定的研究。铁蛋白无论在动物还是在植物中 都是一种最重要的储存铁的蛋白，而且是迄今为止发现的唯一的一种能控制铁离子从固相 1 绪论 转移到液相的蛋白。 铁蛋白在植物体内的主要作用就是储存铁，作为植物光合作用和固氮的铁源。铁蛋白 通过其亚铁氧化酶活性的改变控制对铁的吸收【1 8 】，主要在种子形成、叶片衰老或环境铁过 量时积累铁，在种子萌发等过程中释放铁，维持铁的动态平衡，在植物发育的早期起重 要作用【1 9 】。由于植物铁蛋白具有高容量的铁储存能力，所以提高作物种子铁蛋白的含 量，增加作物食品的铁营养价值，将对解决全球性的人类缺铁问题起重要作用【2 1 1 。 铁蛋白在植物体内还可以作为一种胁迫反应蛋白，从而避免铁毒害【捌。在正常的生长 条件下，植物铁蛋白天然积累在一些低光合活性的组织中。因此，它们主要在植物的发育 过程和植物对环境胁迫的适应性中起作用。铁过量会导致氧化性胁迫，f e 2 + 能与h 2 0 2 反 应产生羟自由基，其极高的氧化活性可导致细胞死亡。因此，控制细胞中自f h f e 2 + 对植物 防御由氧化胁迫带来的损害非常重要【竭。由于铁蛋白能将高毒性的f e ( i i ) 转化为无毒的 f o ( ) 螫合物形式，所以植物铁蛋白的表达与氧化胁迫和活性氧的产生是密切相关的， 在保护细胞的抗氧化性胁迫中起重要作用【2 3 1 。铁蛋白结合铁的操纵机制也许能提供一种阻 止氧化伤害，增强植物对胁迫耐受性，减轻病害引起损失的新方法。鉴于铁蛋白作为氧自 由基胁迫的缓解因素，我们期待可以用它来培育新的抗性作物。 1 3 4 植物铁蛋白基因的研究进展 1 3 4 1 铁蛋白基因克隆和表达的研究 1 刍h y d e 掣1 1 】于1 9 6 3 年第一次报道铁蛋白以来，植物铁蛋白已在许多植物中得到证 实，如大豆【1 2 1 、豌豆【13 1 、玉米1 4 1 、紫花莒蓿【1 5 1 等。近来已克隆到许多编码铁蛋白的 c d n a 。 w i c k s 和e n t s c h 【2 5 】在豇豆的叶片中发现了3 个编码铁蛋白的基因，每个基因都有特 定的氨基酸序列。w a r d r o p 等还发现了第4 个铁蛋白基因。关于铁蛋白的表达调控问题， 已有研究表明，铁在转录和翻译水平上直接调节着铁蛋白的合成1 2 6 ，这可能包括两条途 径：一是植物激素a b a 参与控制基因的表达，二是不依赖于a b a 的氧化步骤。 f o b i s 掣2 4 】克隆了玉米铁蛋白的基因z mf e r l 和z mf e r 2 ，两个基因均由8 个外显子 和7 个内含子组成，且位置相同，但两者3 端非翻译区和转录起始区及启动子序列有差 异。研究表明，植物铁蛋白基因可能是一个基因家族。而且铁诱导铁蛋白m r _ n a 的积累 是短暂的，在叶中较多，而在根中受铁的影响，则较叶片小。其它一些因素如外源激素和 环境胁迫等也诱导铁蛋白基因的表达瞄】。 而g o t o 等【如认为，由于铁蛋白基因是以基因家族的形式存在，则可能存在一类独特 的铁蛋白，此种蛋白除了能够结合铁以外，还可以较为容易地结合其他重金属元素。采用 绪论 转基因技术将铁蛋白基因转入植物体内，或许可以培育出能忍受重金属元素的植株。这为 利用转铁蛋白基因植物净化土壤和水，从而整治环境污染提供了可能。 1 3 4 2 铁蛋白基因的转化研究 g o t o 等f 1 0 】通过c a m v 3 5 s 启动子，将大豆铁蛋白基因转入烟草，发现其营养组织中 铁含量提高3 0 4 0 。g o t o 等【2 7 】将由3 5 s 启动子驱动的大豆铁蛋白基因通过农杆菌转 入莴苣( l a c t u c as a t i v a ) 后，发现含铁量明显提高，且转基因植物的生长速度也比野生型的 快许多。g o t o 等【2 7 】通过农杆菌介导，将大豆铁蛋白e d n a 转入水稻( o r y zas a t i v a ) ，在水 稻特异性种子存储蛋白谷蛋白启动子g l u b 2 1 控制下，只在谷粒中富集铁，铁含量平均提 高3 倍左右。在转基因植株的其他部位中的铁含量则与正常植株没多大差异。据此，他们 认为，这与g h 酡1 启动子驱动铁蛋白的表达模式是分不开的。并估计这可以满足3 0 6 5 0 0 , 6 成年人每天对铁的需求。 v a nw u y ts w i n k e l 掣2 6 谰c a m v 3 5 s 启动子将大豆铁蛋白基因导入烟草后，发现转基因 植物中铁蛋白过量表达，根中铁还原酶活性提高2 5 倍，叶片中铁含量增加2 3 倍。同时 伴随铁吸收的提高，植物对铁的储存能力也相应增加，对由除草剂百草枯引起的氧化胁迫 的抗性也增强。d e a k 等【2 8 】将紫花苜蓿的铁蛋白基因导入烟草，获得的转基因植物具有抗 由氧化剂如百草枯等引起的氧化胁迫的作用，而且还有抗病毒如烟草坏死病毒( t o b a c c o n e c r o s i sv i r u s ) 、三出交链孢( a l t e r n a r i aa lt e r n a t ej 、灰葡萄孢rb o tr y t i s c i n e r e a ) 的抗 性。 1 4 验证基因功能的新方法一反义r n a 技术 1 4 1 反义r n a 的发现 随着分子生物学技术的发展，在2 0 世纪8 0 年代人们陆续从细菌、病毒乃至真核生物 中发现了反义r n a 。它们是一些较短的、散布的转录产物【2 ”，本身缺乏编码能力，但可 以通过碱基配对的方式与靶r n a ( 通常是m t n a ) 的特定互补区域结合，参与基因表达的 调控。通常把转录产生反义r n a 的基因称为反义基因，它与转录产生靶r n a 的基因是 反义的。参与基因表达调控的反义r n a 首先在原核生物中被发现。1 9 8 4 年i z a n t 和 w e i n 仃a u b 掣3 1 】首次用重组d n a 技术设计和制备出反义h s v t k m r n a 的表达载体，注 入细胞后观察到它明显抑制了t k 酶的活性。1 9 8 6 年w i l i a m s t 5 0 1 发现真核生物中也存在天 然的反义r n a 。如在大麦、玉米、水稻以及人和其他动物中都发现有反义r n a 存在。发 现真核生物中反义r n a 后，人们更是广泛应用人工构建的反义r n a 抑制真核细胞基因 的表达。 1 绪论 1 4 2 反义r n a 的作用原理 不同的反义r n a 其功能和作用方式不尽相同，它们可以在基因的复制、转录、翻译3 个水平上发挥功能p 2 l 。 1 4 2 1 原核生物中的反义作用 在d n a 复制水平的调控 c o l e l 等质粒复制的前提是合成适当的鼢_ a 引物，它可以折叠形成一定的构像，与模 板恰当地结合。而反义r n a 在一些蛋白质分子的作用下，与r n a 引物及其前体互补结合，阻 止了适合引物的产生，因此抑制了d n a 的复制。 在转录水平的的调控 反义r n a 可与l n i l n a5 端互补而阻i e r n a 的转录。在此，反义r n a 的作用方式与衰 减子的作用方式相似，以反式作用对转录过程本身进行调控。 在翻译水平的调控 反义r n 诳翻译水平的的调控主要表现在3 个方面： ( 1 ) 直接作用于其靶m r n a 5 端的s d 序列和( 或) 编码区，直接抑制翻译； ( 2 ) 与m r n a 的s d 序列的上游非编码区结合，引起m r n a 构像变化，抑制翻译； ( 3 ) 与1 1 1 】哺a5 端编码区，主要是与起始密码子结合，抑制翻译起始。 1 4 2 2 真核生物中的反义作用 在真核细胞中反义r n a 除在上述3 个水平发挥作用外，在下列阶段也发挥功能： n 作用于m r n 崃端，影响5 端和3 端的正常修饰，如阻止“帽子”结构的形成等； o 作用于外显子和内含子的连接区，阻止前m r n a 的剪接； o 作用于p o l y a 形成位点，阻凸n r n a 的成熟及其向胞浆中的转运。 1 4 3 反义r n a 技术的应用 反义r n a 技术是借助基因重组技术，根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成的 特定r n a 片段( 或其化学修饰物) 抑制或封闭基因表达的技术。 植物病毒病是影响作物产量与品质的重要因素之一。应用反义r n a 抑制病毒基因的表 达与复制有可能成为预防病毒感染的有效途径。目前对番茄花叶病毒( t m v ) 、马铃薯x 病 毒( p v x ) 等病毒构建了反义r n a 转基因植株。1 9 9 1 年，d a y 等t 3 3 1 首次报道了反义r n a 抑制 d n a 病毒的实验结果。研究中番茄金黄色花叶病毒( t g m v ) 的a l l 基因的反义基因有效地 抑制了t g m v 的复制。他们用转反义t g m v 基因的植株做了进一步的抗同组病毒实验，发 现转基因植物对甜菜顶卷叶病毒( b t c v ) 有相当的抗性，而对另一种g e m i n i v i r u s 属病毒非 洲木薯花叶病毒( a c m 则没有抗性【3 4 1 。 l 绪论 本文在研究铁蛋白基因功能时的策略是将烟草内源铁蛋白基因反向连接在真核启动子 后导入植物。植物细胞中表达的反义r n a 与转入的外源铁蛋白基因的r n a 互补，从而 抑制外源基因m r n a 的翻译，在此基础上研究铁蛋白基因的功能。 1 5 杨树基因工程 1 5 1 林木基因工程模式植物一杨树 杨树属杨柳科( s a l i c a c e a e ) ，杨属( p o p u l u s ) ，雌雄异株，落叶乔木。 杨树作为林木基因工程模式植物的优点： ( j 杨树在全世界栽培面积广而深受重视 杨树无性繁殖容易，轮伐期短 圆杨树利于离体操作，许多种建立了离体繁殖再生系统 固杨树还是根癌农杆菌的天然寄主，可利用根癌农杆菌街道进行遗传转化 杨树基因组小，容易鉴定分离和克隆基因，并且构建了杨树遗传图谱，对重要性 状进行了基因定位【3 5 】 杨树组培工作较系统，组织培养技术较成熟，一旦获得转化植株便可迅速繁殖， 较易实现商品化 目前，杨树( p o p u l u s t r i c h o c a r p a ) 全基因组框架图已经完成，并且杨树功能基因组学， 基因的表达研究、转录组学、蛋白质组学和代谢组学也在相继开展，都为转基因林木的研 究提供了坚实的基础。 1 5 2 杨树基因工程研究进展 杨树世界上三大速生树种之一，也是世界上中纬度地区广泛栽培的重要用材树种之 一，具有很多用途。它不仅是重要的速生用材林，城市绿化和生态防护林的树种，还是制 造纸浆、胶合板、包装材料等的重要工业原料【3 7 。我国现已成为世界上杨树人工林面积最 大的国割3 6 1 。由于杨树生长周期长、树体高大，用常规育种法培育良种不仅时间长、见效 慢，而且可操作性差。利用植物基因工程技术，可以打破物种间的界线，从各种生物材料 中分离提取到有用的抗性基因，通过合适的基因转移技术改良现有杨树品种。这不仅可以 大大缩短育种周期，而且有望提高杨树抗性改良效果。 植物基因工程技术已在杨树抗性改良中得到了应用，培育出一批具有一定抗除草剂、 抗虫、抗病毒能力的转基因植株口6 1 。f i l l a t t i ( 1 9 8 7 ) t 3 8 】首先将除草甘膦抗性基因通过根癌农 杆菌导入银白杨大齿杨无性系n c 5 3 3 9 中，所获得转基因植株具有抗除草剂效应。随后 又成功地将抗除草剂基因转入美洲黑杨，这是杨树抗性基因工程研究的开端。1 9 9 1 年 i 绪论 m c o w nb h 等人【3 9 】利用电激法将抗虫b t 基因导入银白杨大齿杨和欧洲黑杨毛果杨杂种 中，获得抗虫转基因植株。c o o p e r 【柏】研究j f l l ( 1 9 9 3 ) 成功克隆到杨树花叶病毒的外壳蛋白 基因( p m v 2 c p ) 并导入杨树，在杨树体内所产生的c p 蛋白对杨树p m v 的侵染起到一种类 似疫学的交叉保护效应。1 9 9 5 4 h 年法国森林育种实验站g i l l sp i l a t e 领导的研究小组将切 割蛋白( p r o t e i nc u t t i n g ) 酶基因转入杨树，所得转化植株使食其叶片的昆虫致死率达4 0 。 中国林科院( 1 9 9 3 1 9 9 7 ) 【杞4 3 】成功地将苏云金杆菌b t 杀虫蛋白基因导入欧洲黑杨、欧美 杨和美洲黑杨，获得对舞毒蛾有毒杀作用的杨树转基因植株，并进入田间试验。1 9 9 8 年 a r i s i i “】等将拟南芥的f e s o d 基因导入杨树，增加了转基因杨树的抗氧化能力和耐冻性。 郝贵霞掣4 习( 1 9 9 9 ) 已成功将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因( c p t i ) 导入毛白杨，并 获得转基因植株，现已进入大田检测。加拿大研究者从杨树中分离出4 - 香豆素- 辅酶a 连接酶( 4 c l ) 基因，再反义构建到载体中转化杨树，研究木质素合成中该基因的反义效 应，并获得转化植株】。法国科学家进行了查尔酮合成酶( c h s ) 基因转化杨树的研究，获 得了成功【4 7 1 。用遗传转化技术可以改变杨树中木质素的组成，甚至降低木质素的含量，但 这些改变对于杨树的正常生长有什么影响，尚待进一步研究。 除上述基因遗传转化外，一些实验室还开展了杨树其他方面的基因转化研列4 84 9 ， 如雄性不育基因、抗逆( 低温、干旱、盐碱) 基因等。2 0 0 1 年，东北林业大学又将耐盐基 因( b e t n 导入小黑杨【删。美国等研究工作者已将控制油菜开花的基因导入欧洲黑杨，转基 因植株开花时间大大提前，这项研究的成功为转基因杨树在育种领域的应用开辟了新途 径。k a ji a 【5 1 】等用载体l b a4 4 0 4 转化杨树杂种( p s i e b o l d i x p g r a d i o d e n t a t a ) ，将过氧化酶基 因c a m v 3 5 p r x a l ) 导入杨树，提高了过氧化酶的表达量和活性。 杨树抗性基因工程研究虽然取得了一些突破性进展，但同农作物相比，仍然还处在一 个初级阶段，还存在着许多问题有待于去研究和解决。由于目前基因转化及再生水平的限 制，还不能生产出大量的基因工程植株，因此转化频率低、实验重复性差仍是杨树基因工 程育种过程中的突出问题。这就需要根据转化植株的生理特点，结合特定的转化方法，从 技术因素到环境因素多方面创造条件，提高转化频率及重复性。同时还必须不断开发新 的、有效的基因源，保持林木基因的多样性【5 2 】。 2 铁蛋白基冈植物转化载体的构建及时烟草的遗传转化 2 铁蛋白基因植物转化载体的构建及对烟草的遗传转化 2 1 实验材料 2 1 1 菌株和质粒 大豆铁蛋白基因s o y f e r l ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e rm 6 4 3 3 7 ) 由本实验室根据前人 已发表的序列信息克隆获得，烟草铁蛋白基因( n t f e r 2 ，g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r a y l 4 1 1 0 5 ) 是作者前期研究获得的【“。 植物表达载体p b i l 2 1 、农杆菌( a t u m e f a e i e n s ) 为e h a l 0 5 ，均为本实验室保存，转化 用大肠杆菌( e c o l i ) j m l 0 9 购自t a k a r a 。 2 1 2 植物材料 本项研究的烟草品种为s r 1 ( n i c o t i a n at a b a c u ml “p e t i th a v a n as r - 1 ) ，首先将烟草 种子用1 0 的n a c i o 浸泡5 1 0m i n ，用无菌水清洗4 5 遍，接种到m s 固体培养基 上萌发，获得无菌苗。挑选长势较好的组培苗单株进行扩繁，作为遗传转化的受体材料。 2 1 3 培养基 本实验中使用的培养基如表2 - 1 、2 - 2 所示。 表2 - 1 细菌培养基成分含量表 固体培养基加1 5 琼脂，液体培养基不加琼脂，p h7 0 2 铁蛋白基因植物转化载体的构建及对烟草的遗传转化 表2 - 2 烟草组织培养培养基表 培养基成分 船 m s + i 0m g l6 - b a + 0 1m g l n a a m s + 0 im g l n a a + 1 0m g l6 - 队+ 5 0m g li 缅+ 6 0 0m g lc e f m s + 0 1m g l n a a + i 0m g l6 - b a + 1 0 0m g lk m + 6 0 0m g lc e f m s + l o om g lk m + 6 0 0m g lc e f 继代培养 分化培养基 抗性芽筛选 抗性芽分化 抗性芽生根 2 1 4 酶和试剂 限制性内切酶x b a ，和s a c ，、r t a q 酶、胶回收试剂盒、p c r 产物纯化试剂盒、d n a m a r k e r d l 2 0 0 0 和九h i n d h i 等购自t a k a r a 公司、t 4 d n a l i g a s e 购自t o y o b o 公司，质粒 ( 小量) 提取试剂盒购白p r o m e g a 公司； 卡那霉素( k a n a m y c i ns u t f a t e ，k m ) 购自d u e h e f a 公司、利福平( r i f a m p i c i n ，r i f ) 购自s i g m a 公司，头孢噻肟钠( c e f o t a x i m es o d i u m ) 购自北京鼎国生物技术有限责任公 司；激素类及其它化学试剂等均购自国内生产厂家。 2 1 5p c r 扩增引物序列 根据大豆铁蛋白基因和烟草铁蛋白基因的e d n a 序列分别设计含有酶切位点砌i 和鼬c i 的引物：大豆铁蛋白基因的引物为： s o y f e r - f l ( 5 - g c g t c t a g a a t g g c t c t t g c t c c a t c c a a a g t t - 3 和 s o y f e r - r l ( 57 一g c g g a gc t c g g c t a t t c a a g a t t aa g c a t c - 3 3 烟草内源铁蛋白基因的反义引物为： n f e r 2 - f i ( 5 - g c g t c t a g a t c a t g c a a c a a c r i c t c 一3 1 和 n f e r 2 - r i ( 5 - g c g g a g c t c g t c 戌r j c r r i m a a a 兀a g c - 3 1 2 2 实验方法 2 2 1 铁蛋白基因植物表达载体的构建 2 2 1 1 目的基因的p c r 扩增 用大豆铁蛋白基因和烟草铁蛋白基因的e d n a 序列为模板对目的基因s o y f e r l ， n t f e r 2 进行p c r 扩增。 p c r 反应体系( 2 0p 1 ) ： 1 0 x b u f f e r2p 1 1 0 2 铁蛋白基因植物转化载体的构建及对烟草的遗传转化 m q l l pf 2 5 m m 0 1 ) 0 4g l t a q 酶0 2 肛l 引物l1 儿1 引物2 1g l c d n a 1 i t l 加水至2 0 “1 p c r 反应程序：9 4 预变性2m i n ，9 4 c 变性3 0s e c ，6 0 退火3 0s e c ，7 2 c 延伸1 v a i n ，3 0 个循环，7 2 保温7m i n ，扩增产物纯化后备用。 2 2 1 2p b l l 2 1 质粒和目的基因p c r 产物的双酶切 用x b ai 和s a c1 分别对p b i1 2 1 质粒( 去g u s 基因) 和扩增得到的目的基因进行双酶 切。 x b ai 的识别位点：t , l c t a g a s a ci 的识别位点：g a g c t 【c 酶切反应体系( 2 0 1 ) ： $ c a i 1u 1 x b a i1u 1 1 0 b u f f e r ( m ) 2 肛1 模板d n a p b i 1 2 1 1 0 p l 补水至2 0 “l 3 7 过夜。采用胶回收试剂盒纯化回收酶切片段。 2 2 1 3 中间表达载体的构建 用t 4d n al i g a s e 对p b l l 2 1 质粒酶切产物和目的基因p c r 条带酶切产物进行连接， 构建植物表达载体p s f l ，p n f 2 连接反应体系( 4 1 ) ； t 4d n a l i g a s c2p 1 目的基因1 儿1 p b i l 2 1 1 “1 t o t a l 4 肛1 1 6 连接一小时。 2 2 1 4 连接产物转至大肠杆菌感受态细胞 连接产物转化至宿主菌y m l 0 9 中，将构建的重组质粒分别命名为p s f l ，p n f 2 ，并经 过p c r 检测以对重组质粒进行筛选鉴定。具体步骤如下： 。t 1 2 铁蛋白基因植物转化载体的构建及对烟草的遗传转化 1 ) 在感受态细胞中加入连接反应物，温和混匀，冰上放置3 0m i n ； 2 ) 4 2 c 热激9 0s ，然后迅速在冰上放置l 3m i n | 3 ) 在管中加入8 0 0p 1l b 液体培养基，于3 7 ( 2 培养箱中1 5 0n n p m i n 摇4 5 6 0r a i n ； 4 ) 取2 0 0p 1 转化反应液，接种于含抗生素l b 平板培养基上，涂匀； 5 ) 待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于3 7 ( 2 恒温培养箱内培养1 2h ；待菌生长 良好，挑出单菌落提质粒，通过p c r 检测对重组质粒p s f l ，p n f 2 进行筛选鉴定，并且 对阳性克隆进行测序。 2 2 2 电击法将中间表达载体导入农杆菌e h a l0 5 2 2 2 1 农杆菌e h a l 0 5 感受态的制备 1 ) 划平板：将受体农杆菌e h a l 0 5 在含r i f ( 5 0r a g l ) 的l b 固体培养基上划线，于3 0 ( 2 培 养1 6 2 0 h ； 2 ) 挑单菌落，接种于含有r i f ( 5 0m e l ) 的l b 液体培养基中，于3 0 0 ，2 2 0r p m m i n 震荡培 养至o d 6 0 0 达到0 2 o 4 之间； 3 ) 将菌液倒入1 5l i l i 的无菌离心管中，6 0 0 0g m i n ，4 1 2 ，离心1 0r a i n ； 4 ) 弃上清，倒置离心管1m i n ，流尽剩余液体，加入1 0 的甘油1 0mm l ，悬浮细胞，6 0 0 0 g m i n ，4 ，离心1 0 m i l l ； 5 ) 弃上清，倒置离心管1m i n ，流尽剩余液体，加入1 0 的甘油1 0m l ，悬浮细胞，6 0 0 0 g m i n ，4 ，离心1 0 m i n l 6 ) 弃上清，倒置离心管lm i n ，流尽剩余液体，加入1 0 的甘油4 5m l ，悬浮细胞，6 0 0 0 g m i n ，4 0 ，离心1 0m i n ； 7 ) 弃上清，倒置离心管1r a i n ，流尽剩余液体，加入1 0 的甘油l m l ，悬浮细胞，按每份 5 0 1 1 1 分装细胞，置于7 0 ( 2 冻贮。 2 2 2 2 电击法将中间表达载体导入农杆菌e h a l 0 5 1 ) 将e h l 0 5 及质粒d n a ( p s f l ，p n f 2 ) 放入冰中进行冰浴，取4 此的质粒d n a ，加入 5 0 p l 的e h l 0 5 感受态中，混匀。 2 ) 将混合物放入预冷的电槽中，1 8 0 0v 电击，待听到声音后( 约5 8s ) ，加入1m ls o c 培养 基，转移到离心管中，3 0 ，1 5 0r p m m i n ，摇菌l 小时； 3 ) 涂于含k i n ( 5 0r a g l ) 和r i f ( 5 0r a g l ) 的l b 培养基上。3 0 ( 2 培养2 天，4 保存； 4 ) 挑取单菌落接种在含有r a n ( 5 0m g l ) + r i f ( 5 0m e l ) 的l b 液体培养基上，2 8 1 3 摇菌。 5 ) 用小量质粒抽提纯化试剂盒提质粒d n a ，以铁蛋白基因两端特异序列作为引物进行 p c r 扩增，确定重组质粒是否转入农杆菌e h a l 0 5 中。 2 铁蛋白摹困植物转化载体的构建及对烟草的遗传转化 2 3 铁蛋白基因对烟草的遗传转化 2 3 1 无菌苗的获得 取非转基因烟草种子播种于m s 培养基上，于2 5 + 2 c 、2 5 0 0l u x 、1 2l g d 光照下培养 一周，取长出子叶的小苗接种于培养瓶中，待无菌苗长出4 - 5 片叶时即可作为遗传转化的 受体材料。 2 3 2 根癌农杆菌介导的烟草的遗传转化 1 ) 农杆菌培养：于超净工作台中，将工程菌菌液( o d 6 0 0 = 0 5 左右) 转入离心管中，3 0 0 0 g ， 离心5m i l l ，去除上清液，将收集到的菌体用灭菌m s 液体培养基稀释至终浓度为 o d 6 0 0 = 0 1 ，即可作为侵染用菌液。 2 ) 侵染：于超净工作台中，将无菌叶片切成l x l 锄2 的小块，浸泡到菌液中5m i n ，取出 叶片用无菌滤纸吸去多余菌液。 3 ) 共培养：将浸染过的叶片接种在不含抗生素的