（农产品加工及贮藏工程专业论文）泰山蜂胶化学成分研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 摘要 蜂胶( p r o p o l i s ) 是蜜蜂从植物的叶芽采集分泌物、树脂，并混入蜂蜡 和唾液咀嚼加工形成有芳香味的胶状物，由树脂、蜂蜡、挥发油和花粉等 组成，化学成分非常复杂。到目前为止，已从各类蜂胶中鉴定出黄酮类、 芳香酸与芳香酸酯类、酚类、醇类、醛类、酮类和萜类等化合物3 0 0 多种。 蜂胶所含有的化学成分很大程度上取决于蜜蜂所采集树脂的植物，由于不 同地区的植物种类存在明显差别，所产生树脂的化学成分相差很大，造成 不同产地的蜂胶在化学成分上可能完全不同。因此，蜂胶化学成分具有十 分明显的地域性，对某一产地蜂胶成分的研究结论往往不适用于其它产地 的蜂胶，实现对某一产地蜂胶产品的质量监控，必须对此地蜂胶成分进行 研究。本文对泰山蜂胶的化学成分及含量进行了研究，分离并鉴定出了1 5 种化合物，并以其中7 种为对照品，测定了在泰山蜂胶和广州蜂胶中含量 的差别，为进一步的活性评价及建立蜂胶的指纹图谱提供依据。结果如下： l 、使用乙醚浸提和s p m e 法提取泰山蜂胶挥发性化合物，通过g c m s 技术对挥发性化合物进行分析鉴定，两种方法共鉴定出化合物7 4 种。发现二种提取方法获得的化合物在种类和含量上都有区别，经比较分 析得出s p m e 法更适合蜂胶挥发性成分提取。 2 、研究了蜂胶超声提取的工艺参数，建立了比色法测定蜂胶中总黄 酮的方法，在此基础上研究了影响蜂胶有效成分提取率的因素，得出最优 提耿条件为，乙醇浓度9 5 ，超声提取1 0 m i n ，提取温度3 5 。将此工 艺与工业提取法做比较得出超声提取法效率较高。 3 、蜂胶原胶经超声提取，减压浓缩得到提取物，使用正己烷、乙酸 乙酯、水进行逐级溶剂萃取，通过硅胶柱粗分离，重结晶法、高速逆流色 谱( h s c c c ) 、葡聚糖凝胶色谱进行纯化，分离得到1 5 个化合物。通过 紫外检测、质谱解析、标准品比对定性，共鉴定出黄酮类化合物5 个，有 机酸和有机酸酯1 0 个。 4 、建立了蜂胶中7 种代表性化合物的h p l c 测定方法，并依照此方 法对产自泰山和广州的蜂胶进行检测，发现这在7 种成分的含量上二者有 明显差别。 关键词：蜂胶；分离纯化：黄酮；有机酸 泰山蜂胶化学成分研究 a bs t r a c t p r o p o l i si san a t u r a lr e s i n o u sh i v ep r o d u c tc o l l e c t e db yh o n e y b e e sf r o m l e a fb u d sa n de x u d a t e so fv a r i o u sp l a n ts o u r c e s i ti sc o m p o s e do fc o l o p h o n y ， b e e s w a x as i n a i lq u a n t i t yo fv o l a t i l eo i la n dp o l l e n t h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t s o f p r o p o l i sa r ev e r yc o m p l i c a t e d u pt on o w ，r e s e a r c h e si n d i c a t et h a tt h em a i n a c t i v ec o n s t i t u e n t s o f p r o p o l i sa r ef l a v a n o i d s ，a r o m a t i ca c i da n da r o m a t i ca c i d e s t e r s ，p h e n o l s ，a l c o h o l s ，a l d e h y d e s ，k e t o n e s ，t e r p e n e s a n ds oo n n e c h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fp r o p o l i sl i el a r g e l yo nt h ep l a n t sc o l l e c t e db y h o n e y b e e s b e c a u s eo ft h ed i s t i n c t i o no nk i n d so fp l a n t si nd i f f e r e n ta r e a s ，t h e c h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fp r o p o l i sa r ea p p e a rv a r yg r e a t l y ，w h i c hl e a dt h e c h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fp r o p o l i sf r o md i f f e r e n ta r e a sm a yb et o t a l l yd i f f e r e n t s ot h e r ei sav e r yc l e a rr e g i o n a li nt h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fp r o p o l i s i n o r d e rt ot oc a r r yo u tt h eq u a l i t ys u p e r v i s o r yc o n t r o lo f p r o p o l i sp r o d u c e di n o n ea r e a m u s tg oa l o n gr e s e a r c h i n go nt h ep r o p o l i s t 1 1 i sp a p e rw a sf i r s tt o c a r r i e do u tr e s e a r c h i n gt h ec h e m i c a l c o m p o s i t i o n s a n dt h e i rq u a n t i t i v e a n a l y t i c a l m e t h o d so f p r o p o l i s c o l l e e t e df r o mm o u n t a i nt a i f i f t e e n c o m p o u n d sa r es e p a r a t e da n da p p r a i s e d ，a n ds e v e nk i n d so ft h e m f o rr e f e r e n c e s u b s t a n c e ，a n d d e t e r m i n e dt h ed i f f e r e n c e so fp r o p o l i sc o n t e n t sb e t w e e n m o u n t a i nt a ia n dg u a n gz h o u ，t h e np r o v i d eab a s i sf o rf u r t h e ra c t i v e a p p r a i s e m e n ta n de s t a b l i s h i n gf i n g e r p r i n t so fp r o p o l i s 砀er e s u l t s a r ea s f o l l o w s ： 1 b yd i e t h y le t h e re x t r a c t i o na n ds p m ec o l l e c t e dv c o l a t i l ec o m p o u n d s w h i c hw a sa n a l y z e da n da p p r a i s e db yg c - m ss p e c t r o s c o p yt e c h n i q u e s a n d c h e c k e do u ts e v e n t y f o u rc o m p o u n d s t h e r ew e r em a n yd i f f e r e n c e si nb r e e d a n dc o n t e n to ft h ec o m p o u n d so b t a i n e db yt h et w om e t h o d s a f t e rc o m p a r i n g a n da n a l y s i n g t h es p m 匣w a sb e r e ri ne x t r a c t i n gv o l a t i l eo i l 2 n l ep a p e rs t u d i e dt h eu l t r a s o n i ce x t r a c t i o np r o c e s s ，a n de s t a b l i s h e d c o l o r i m e t r yw h i c hd e t e r m i n e dt h et o t a lf l a v o n o i d si np r o p o l i s o nt h i sb a s i s ， t h et e s ts t u d i e dt h ef a c t o r sw h i c ha f f e ：c t e dt h ee x t r a c t i o nr a t eo ft h ea c t i v e i n g r e d i e n t so fp r o p o l i s ，a n do b t a i n e dt h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o ni s ： e x t r a c t e d10 m i nb yu l t r a s o u n di n9 5 e t h a n o l ，a t35 e x t r a c t i n gb y u l t r a s o u n dc a nb eo b t a i n e dah i g h e re f f i c i e n c yc o m p a r e dw i t ht h ei n d u s t r i a l e x t r a c t i o n 3 t h ee x t r a c ti se x t r a c t e db yu l t r a s o u n d ，c o n c e n t r a t e du n d e rr e d u c e d 2 山东农业大学硕士学位论文 p r e s s u r e ，s e p a r a t e da n dp u r i f i e db yv a r i o u sm e a n si n c l u d i n gs o l v e n tp a r t i t i o n ， s i l i c a g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ，t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，r e c r y s t a l l i z a t i o n ， h s c c c s e p h a d e xc h r o m a t o g r a m f i f t yc o m p o u n d sb eo b 位i i n e df r o ma c e t i c e s t e re x t r a c t i v e ，a n dd e f i n e ds t r u c t u r e sb yu va n dm s 】s n ，a n da p p r a i s e df i v e f l a v o n o i dc o m p o u n d s ，t e no r g a n i ca c i d sa n de s t e r s 4 ah p l cm e t h o df o rt h ea n a l y s i so fs e v e nr e p r e s e n t a t i v eb i o a c t i v e c o m p o n e n t s ：1 k a e m p f e r o l2 a l p i n e t i n3 t e c t o c h r y s i n4 b e n z y lp c o u m a r a t e5 b e n z y lf e r u l a t e6 c a f f e i ca c i dp h e n e t h y le s t e r7 p h e n e t h y lp c o u m a r a t ei n p r o p o l i sw a se s t a b l i s h e d ，t w os a m p l e sf o r mm o u n t a i nt a ia n dg u a n g z h o u w a sa n a l y s e d i ti n d i c a t e dt h a ta l lt h es e v e nb i o a c t i v ec o m p o n e n t sa r em u t u a l c o n s t i t u e n t si nt w op r o p o l i ss a m p l e s ，a n dt h e r e a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s b e t w e e nt h ep r o p o l i sc o n t e n tf r o mm o u n t a i nt a ia n dg u a n g z h o u k e y w o r d s ：p r o p o l i s ；i s o l a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；f l a v o n o i d s ；o r g a n i ca c i d s 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：幽玺i 丛l 导师签名：至也 e l期： 垫! ! ：! ：1 5 泰山蜂胶化学成分研究 1 引言 蜂胶是一种天然活性物质，成分极为复杂，具有广泛的生理和药理 作用。具有抗菌、降血脂、降血糖、降血压、抗氧化、增强免疫力等功能 ( j o h n s o n ，1 9 9 6 ) ，素有“紫黄金”之称。受到了医药和食品界的关注， 是一种具有很大开发潜力的天然中药材和天然功能食品原料( 余兰平， 2 0 0 8 ) 。国内外的科学家们对蜂胶的研究都给予高度的重视，从药理、临 床、应用等各个领域进行了比较深入系统的研究，获得了大量的研究成果， 证明了蜂胶不仅是一种优良的保健食品，而且是一种具有广泛用途的天然 药品( b a n k o v a ，1 9 9 8 ) 。 在我国，药食同源历史悠久，有较好的推广基础。蜂胶含丰富的微 量元素及大量黄酮类、有机酸类化合物，是一种良好的天然免疫增强剂。 近年来，随着人们保健意识的增强，日益强调食品原料及添加剂的天然性、 功能性，使得人们更加关注蜂胶的药食兼用的特性。我国是一个蜂产品生 产大国，有充足的原料来源，为蜂胶的开发提供了广阔的空间( 黄文诚， 2 0 0 6 ) 。 1 1 蜂胶的功效成分 对蜂胶化学成分的研究始于德国，1 9 1 0 年k u s t e n m a c h e r 从蜂胶中鉴 定出肉桂醇和肉桂酸。现代科学分析从蜂胶中鉴定出数百种化合物，其中 黄酮类7 1 个，芳香酸与芳香酸酯类5 9 个，氨基酸2 5 个( c a r a v a c a ，2 0 0 6 ) ， 醛与酮类1 9 个，甾体类6 个，糖类9 个，烃类2 5 个，醇、酚类和其他 化合物2 4 个。新采集的蜂胶约含有5 5 树脂和香膏，3 0 蜂蜡，1 0 芳 香挥发油，5 的花粉等杂物( m o k r y e o n ，2 0 0 6 ) 。蜂胶中丰富的黄酮类 和萜烯类物质具有独特的生物学作用( 董捷，2 0 0 7 ) 。 1 1 1 黄酮类化合物的结构 黄酮类化合物( n a v o n o i d s ) 的名称来自黄酮( n a v o n e ) ，是指以黄酮( 2 一苯 基色原酮) 为基本母核的一大类化合物，即由两个苯基通过三碳相连形成 具有c 6 c 3 c 6 基本骨架的化合物。黄酮母核上有羟基、甲氧基、烷氧基等 取代基，分别形成各种黄酮类化合物( 张红雨，1 9 9 9 ) 黄酮类化合物广泛 分布在植物界，大部分以苷的形式存在，少部分以游离的形式存在，种类 较多，目前为止已经分离出包括苷和苷元约数千种化合物。根据苷元的基 本结构可以分成十多种类型( p o p o v a ，2 0 0 5 ) ，主要类型如下： o 二氢黄酮 4 o 黄酮 山东农业大学硕士学位论文 o 黄酮醇 o 二氢异黄酮 o 查尔酮 o h 黄烷3 ，4 二醇 o 二氢黄酮醇 o 异黄酮 黄烷3 醇 o 二氢黄酮醇 蜂胶中含有丰富的黄酮类化合物，其中包括多种苷元、黄酮苷、黄 酮醇、二氢黄酮，二氢黄酮醇，查尔酮等，目前蜂胶中已知的黄酮类化合 物名称、结构总结如下： 表1 蜂胶中黄酮类化合物 泰山蜂胶化学成分研究 6 山东农业大学硕士学位论文 ，。2 ，5 二羟基7 甲氧 基二氢黄酮 3 6短叶松素 3 7 3 甲氧基短叶松素 3 8 5 甲氧基短叶松素 ，n5 甲氧基短叶松素 3 乙酸酯 - 一，i d 6 d n 7 甲氧基短叶松素 3 乙酸酯 4 1 短叶松素3 乙酸酯 4 2 短叶松素3 丙酸酯 1短叶松素3 异丁酸 酯 。d 短叶松素3 一异戊酸 ” 酯 i o o o 2 0 o o o o o o o曲。o oi o o o 图4s p m e 法萃取泰山蜂胶g c - - m s 总离子流图 f i g 4 g c - m sp r o f i l eo fs p m eo fp r o p o l i sf r o mm o u n t a i nt a i 表8g c m s 法鉴定出化合物 保留 分 相对含量 ：m )重合搜憷称分子式茎主鬟s p m e i n 3 0 5 2 丙酸p r o p a n o i ca c i d ，c ，3 甲基一3 一丁烯1 一醇 。岁 3 - m e t h y l 3 b u t e n 1 o l 4 4 2 6 3 一甲基一2 一丁烯醇3 一m e t h y l - 2 - b u t e n - 1 - 0 1 。， 二甲基甲酰胺n ， 4s 气1 一。：3 。“1 1 。 n d i m e t h y l f o r m a m i d e 5 8 1 4 甲酸肼f o r m i ca c i dh y d r a z i d e 6 15 4 2 - 甲基丁酸2 m e t h y l b u t a n o i ca c i d q 。，74 反式一2 甲基巴豆酸2 - m e t h y l - ， ( e ) 2 b u t e n o i ca c i d 9 7 61 苯甲醛b e n z a l d e h y d e 10 3 2 9 苯酚p h e n o l 1 0 3 5 4 辛酸o c t a n o i ca c i d 1 0 8 4 6 丁酸丁酯b u t a n o i ca c i d ，b u t y le s t e r l0 8 9 6 e ) 3 己烯酸( e ) - 3 h e x e n o i ca c i d 1 1 2 4 9 二甘醇乙醚2 ( 2 e t h o x y e t h o x y ) 一e t h a n o l 1 2 0 5 6 烯丙苯2 - p r o p e n y l - b e n z e n e l2 3 0 9 苯甲醇b e n z y la l c o h o l 13 4 9 4 苯乙酮a c e t o p h e n o n e 1 3 8 8 5 甲酸苄酯f o r m i c a c i d ，p h e n y l m e t h y l e s t e r 14 3 01 邻甲氧基苯酚2 - m e t h o x y - p h e n o l 14 6 5 4 芳樟醇3 ，7 - d i m e t h y l - l ，6 - o c t a d i e n - 3 - o l l5 2 0 9 苯乙醇p h e n y l e t h y la l c o h o l 16 6 2 2 2 一烯丙基酚2 a l l y l p h e n o l 1 7 0 1 3 乙酸苯甲酯a c e t i ca c i d ，p h e n y l m e t h y l c 3 h 6 0 2 7 4 o 4 3 c s h l o o 8 6 c 5 h 1 0 0 8 6 c 3 h 7 n o 7 3 c h 4 n 2 0 6 0 c 5 h i 0 0 2 1 0 2 c 5 h 8 0 2 1 0 0 c 7 h 6 0 1 0 6 c 6 h 6 0 9 4 c 8 h 1 6 0 2 1 4 4 c 8 h 1 6 0 2 1 4 4 c 6 h l 0 0 2 1 1 4 c 6 h 1 4 0 3 1 3 4 c 9 h 1 0 1 1 8 c 7 h 8 0 1 0 8 c s h 8 0 1 2 0 c 8 h 8 0 2 1 3 6 c 7 h 8 0 2 1 2 4 cu o h t 8 01 5 4 c s h t 0 0 1 2 2 c 9 h i o o 1 3 4 1 5 4 2 3 2 2 4 1 3 9 3 0 4 3 7 1 1 1 9 1 3 3 3 2 6 9 6 0 1 8 1 2 4 7 2 2 7 2 - 0 3 2 7 0 1 4 30 0 8 5 0 4 6 2 0 3 4 40 1 6 5 - 0 3 4 0 4 4 3 0 2 8 0 1 3 6 3 92 4 3 2 7 0 3 0 1 0 0 4 7 0 1 4 7 9 2 3 6 0 1 8 7 0 0 6 2 0 0 9 8 7 0 0 9 0 0 7 l c 9 h 1 0 0 2 1 5 02 2 0 82 9 1 3 山东农业大学硕士学位论文 泰山蜂胶化学成分研究 注：“一”：未检出 3 2 提取工艺参数的优化 3 2 1 正交试验分析 由表9 所示实验结果可知，影响因素主次为d b c a ，即乙醇超声 法提取蜂胶工艺参数中，乙醇浓度为主要影响因素，其次为液料比、超声 时间和提取温度。最佳工艺应为d 3 8 3 c 2 a 2 。以此艺条件进行验证实验， 得出黄酮的提取率为1 8 5 5 。 表9 l 9 ( 3 4 ) 正交试验结果 山东农业大学硕士学位论文 3 2 3 超声提取与工业提取法的比较 表1o 超声提取与工业提取法提取参数比较 按照本文2 5 所述方法，得到工业提取方法提取率为1 5 0 1 。超声 提取与工业提取法相比，温度、液料比、乙醇浓度等工艺参数要求较为严 格，提取设备较工业提取法先进，在获得较高提取率的同时大大缩短了提 取时间，提高了提取效率。综合以上结论得出，在蜂胶的提取中，超声提 取法是一种非常有效的提取手段，有广阔的发展前景。 3 3 蜂胶中化合物的分离提纯 3 3 1 蜂胶9 5 乙醇浸膏的制备及粗分离 石油醚部分浓缩得到浸膏1 0 1 5 9 ，乙酸乙酯部分浓缩得到浸膏3 5 9 ， 乙酸乙酯萃取后的水层于6 5 减压蒸发，得到残渣1 9 。将各部分浸膏使 用t l c 、h p l c 检测后发现石油醚部分蜂蜡含量很大，不易分离，此部分 暂不做处理；水相与乙酸乙酯相所含化合物种类大多重合，决定将乙酸乙 酯部分制成浸膏，进行进一步的纯化。 3 3 2 硅胶柱层析 经过多次t l c 实验发现正己烷一乙酸乙酯( 9 5 ：5 ) 时，样品最大 r f 值约o 2 ，依照经验，此展开剂配比适合作为硅胶柱层析的初始洗脱洗 脱剂比例。使用干法上样，然后使用正己烷冲洗2 个柱体积以除去蜂蜡， 依照t l c 实验得出的正己烷乙酸乙酯( 9 5 ：5 ) 体系洗脱，每5 0 0 m l 泰山蜂胶化学成分研究 收集为1 份，于6 0 ( 2 减压浓缩至2 m l 后，置于5 m l 玻璃瓶中。浓缩液每 间隔3 份进行h p l c 检测，合并所含化合物保留时间相近组份。当流份中 物质含量较少时即以1 0 为梯度增加乙酸乙酯浓度。整个洗脱过程共收 集样品4 0 0 份，洗脱剂配比与组份对应如表1 1 所示： 表1 1 硅胶柱层析中洗脱剂比例与组份的对应 3 3 4s e p h a d e xl h 2 0 柱层析精制 自动标尺色谱图 分钟 图5 经s e p h a d e xl h 2 0 柱层析纯化后组份纯度示例 f i g 5 t h ep u n r i t yo fp r o c e s s i n gs a m p l eu s i n gs e p h a d e xl h 2 0c o l u m n 本图与图1 比较可见，保留时间在1 0 m i n 之前的杂质被很好的除去， 说明s e p h a d e xl h 2 0 柱层析可有效将化合物和杂质有效分离，经e m p o w e r 山东农业大学硕士学位论文 工作站软件以峰面积百分比法自动积分计算发现，精制后化合物纯度达到 9 5 ，说明此方法适合蜂胶中化合物的纯化。 3 3 5 高速逆流色谱( h s c c c ) 溶剂体系的建立 高速逆流色谱( h s c c c ) 分离的关键在于找到合适的溶剂体系，由 于高速逆流色谱中固定相和流动相都为液体，无法梯度洗脱，特定溶剂体 系仅适合分离某几种化合物，分离不同化合物需筛选不同的溶剂体系。以 第2 2 4 流分为例，说明溶剂体系筛选过程： 使用溶剂体系：配置溶剂体系正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 ：l ：1 ： 2 ) ，按照本文2 6 6 所述方法，通过所得溶剂体系上下相的h p l c 图判断 k 值，此流分在体系上下象溶解量见图6 、7 ： 图6 正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水埘：1 ：1 ：2 ) 体系上相h p l c 图 f i g 6 t h eu p p e rp h a s e sh p l cc h r o m a t o g r a mo f n - h e x a n e - e t h y la c e t a t e - m e t h y la l c o h o l - - w a t e r ( 1 ：1 ：l ：2 ) s o l v e n ts y s t e m 自动标尺色谱圈 升钎 圈7 正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 ：1 ：i ：2 ) 体系下相 f i g 7 t h el o w e rp h a s e sh p l cc h r o m a t o g r a mo f n h e x a n e - - e t h y la c e t a t e - - m e t h y la l c o h o l - - w a t e r ( 1 ：1 ：1 ：2 ) s o l v e n ts y s t e m 如图6 、7 所示，下相中三种化合物峰面积( 含量) 都远大于上相， 说明k 2 ，即物质在下相中溶解过多，此体系不适于此化合物h s c c c 2 9 泰山蜂胶化学成分研究 分离。经过实验知此化合物易溶于乙酸乙酯，此溶剂体系中乙酸乙酯大多 位于上相，故应增加乙酸乙酯含量。经多次尝试，得到体系正己烷一乙酸 乙酯一甲g - t k ( 1 ：2 ：1 ：2 ) ，其h p l c 图见图8 、9 。 颤动标尺色潜圈 3 势钟 图8 正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 ：2 ：l ：2 ) 体系上相 f i g 8 t h eu p p e rp h a s e si - i p l cc h r o m a t o g r a mo f n h e x a n e - - e t h y la c e t a t e - - m e t h y la l c o h o l - - w a t e r ( 1 ：2 ：l ：2 ) s o l v e n ts y s t e m 自动标尺色谱图 图9 正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( i ：2 ：1 ：2 ) 体系下相 f i g 9 t h el o w e rp h a s e sh p l cc h r o m a t o g r a mo f n h e x a n e - - e t h y la c e t a t e - m e t h y la l c o h o l - w a t e r ( i ：2 ：l ：2 ) s o l v e n ts y s t e m 峰2 、峰3 的k 值大约为1 2 1 ，峰l 在下相中溶解度仍高于上相， 说明此体系适合分离峰2 、峰3 ，不适合分离峰l 。考虑h p l c 图中峰l 、 2 距离较近，推断二者应结构性质相似，但在体系二的上下相l c 图中， 表明峰1 极性远大于峰2 ，与体系1 的h p l c 结果矛盾。根据色谱理论和 3 0 山东农业大学硕士学位论文 色谱仪相关资料判断，峰i 可能为高极性杂质，此h p l c 图峰i 出峰时间 实际为死体积，不影响其他峰分离。故正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( i ： 2 ：l ：2 ) 体系适合此组分的分离此体系下h s c c c 分离结果如图1 0 所 示。第一与第二蜂分离较好，h p l c 测得第三蜂中含有第二蜂成分，第 二与第三蜂分离不理想。由h s c c c 理论判断，可加强下相洗脱力，并在 体系中加入乙酸，减少拖尾现象。故改用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 ： 2 。0 82 2 ，0 l 乙酸) ，分离结果如图l i 所示，经过h p l c 进行纯度检 测图中阴影部分各化合物纯度达到9 0 以上。 t i m e ( h ) 圈i o 正己垸一乙酸乙酯一甲酵一水( 1 ：2 ：1 ：2 ) 体系分离结果 f i g 1 0 t h e h s c c cc i l r o m a t o g r a m0 f n - h c x a n e - - e t h y la c e t a t e - - m e t h y la l c o h o l - - w a t e r ( 1 ：2 ：l ：2 ) s o l v e n ts y s t e m ： l 一 i _忆 一 一 一 j 圈l i 正己烷一乙酸乙酯一甲酵一永( 1 ：2 ：08 ：2 2 ) 体系丹禹结果 f i g l it h c h s c c cc h r o m a t o g r a mo f n - h “a n e - - e t h y la c e t a t e - - m e m y la l c o h o l - - w a t e r ( 1 ：2 ：0 8 ：2 2 ) s o l v e n ts y s t e m 在k 值适合的情况下，由于进样量，温度以及其它因素的影响，并 非样品中所有化合物的分离效果都可以达到理想状态，此时可以将没有分 离开的部分收集，换其它溶剂体系进行二次分离。例如，图1 2 所用溶剂 体系为正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 ：1 ：2 ：1 ) ，流分含3 种主要物质， i 导 1 泰山蜂胶化学成分研究 k 值分别为0 8 5 、09 1 和1 2 1 ，符合h s c c c 分离要求。由图1 2 所示的 分离结果可见，此溶剂体系下仅第二色谱峰( b 部分) 分离效果较好，第 一色谱峰( a 部分) 没有达到基线分离，根据h s c c c 理论判断，此溶剂 体系的流动相对a 部分来说洗脱力过强，导致a 部分各个峰之间没有分开。 但换用洗脱力较小的溶剂系统后，b 部分出峰时间过长，经多次微调后仍 达不到较好的分离效果。于是决定将a 部分收集，减压浓缩后使用洗脱力 较弱的正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( i1 ：l ：1 ) 体系，分离效果得到 很大改善，继续微调溶剂体系为正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( i ：0 8 ：i ： 08 ) ，得到了较好的分离效果如图1 3 所示。 3 e 9 2 图1 2 正己炕一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 ：i ：2 ：1 ) f 。g1 2t h c h s c c c 血m m m o g r a t io f n - h e x a n c - - e t h y la c e t a t e - - m e t h y la l c o h o l - - w a t e r ( 1i ：2 ：1 ) s o l v e n ts y s t e m 1234s t i m e ( h ) 囤1 3 正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( o i 乙酸) ( 1 ：0 8 ：1 ：0 8 ) f i g1 3t h eh s c c cc h r o m a t o g r a mo f n h e x a n e - e t h y la c e t a t e - m e t h y ia l c o h o l - w a t e r ( 1 ：o8 ：i ：08 ) s o l v e n ts y s t e m 3 2 山东农业大学硕士学位论文 3 3 6 化合物的鉴定 综合使用硅胶柱、h s c c c 、葡聚糖凝胶色谱法共从蜂胶的乙酸乙酯 萃取部分分离得到化合物1 5 个。使用化学分析、紫外、l c - - m s 、对照 品比对进行鉴定。由于此部分化合物多为已知黄酮和有机酸类物质，并且 部分物质已有标样，给鉴定带来很大便利。 鉴定流程为：将样品配制成一定浓度甲醇溶液，注入h p l c 进行纯度 检测，同时使用二极管阵列紫外检测器( p d a ) 在2 1 0 - - 4 0 0 n m 波长下对 化合物进行扫描，确定化合物的紫外吸收波长；将样品在硅胶或聚酰胺薄 层板展开后于2 5 4 n m 或3 2 0 r i m 紫外灯下观察荧光颜色，然后喷三氯化铁 显色剂显色，获得荧光和显色信息；根据样品电喷雾m s m s “所给出分子 量在已知化合物中检索，找出所有符合此分子量物质，综合以上信息对化 合物进行鉴定。如果已有此物质的标准样品，则使用标准样品再次进行 h p l c 出峰时间和m s m s “验证，并根据此类物质裂解规律判断裂解过程。 化合物鉴定信息如下： 化合物i ：2 甲基2 丁烯醇咖啡酸酯f 2 m e t h y l 2 b u t e n y lf e r u l a t e ) ，分 子式c 1 5 h 1 8 0 4 ，分子量2 6 2 。h p l c p d a 谱图、u v 扫描图和e s i - - m s n 给出多级质谱碎片信息图如下： 自动标尺伍谱网 泰山蜂胶化学成分研究 白色针状结晶( c h 3 c o h ) ，使用聚酰胺薄层板展开，在2 5 4 n m 紫外灯 下显蓝色，喷三氯化铁显色剂呈灰绿色，说明此化合物为芬酸类物质。 u v ( c h 3 c o h ) m a x ：2 1 8 r i m 、2 9 0 n m ，符合咖啡酸衍生物光谱特征。在负 离子模式下级m s 给出2 6 1 4 m ：z m + h j 一( 基峰) ，得知此化合物分子 量为2 6 2 。在已知蜂胶成分中，符合此分子量的仅有2 甲基2 丁烯醇咖啡 酸酯。结合m s 2 值2 4 6 3 ，m s 3 值2 0 2 1 ，判断质谱的碰撞诱导裂解过程为： - - c h 3 综合以上数据确定此物质为2 甲基2 丁烯醇咖$ 酸酯。 化合物i i ：3 ，4 二甲基肉桂酸( 3 ，4 - d i m e t h o x y - c i n n a m o n i t r i l e ) ，分子式 c l l 0 4 h 1 2 ，分子量2 0 8 。h p l c p d a 谱图、u v 扫描图和e s i - - m s “给出 多级质谱碎片信息图如下： 自动标尺色潴图 柏 ：5 ； 为 0 钳m 分 弭 5 旧 5 山东农业大学硕士学位论文 有蓝色荧光。u v ( c h 3 c o h ) m a x ：2 1 8 n m 、2 9 5 n m ，符合咖啡酸衍生物 特征吸收峰。在负离子模式下一级m s 给出2 0 7 4 m ：z m h j 一( 基峰) 得 知此化合物分子量为2 0 8 ，在己知蜂胶成分中有3 ，4 二甲基肉桂酸与1 ， 5 一戊二醇单苯甲酸酯符合，但后者紫外吸收特征与此物质不符。由m s 2 值1 6 3 2 、m s 3 值1 4 8 3 、m s 4 值1 3 3 2 判断质谱的碰撞诱导裂解过程为： 经过与 o c h 3 一c o ， 此物质为3 ， 化合物i i i ：阿魏酸( f e r u l i ca c i d ) ，分子式c 1 0 0 4 h 1 0 ，分子量1 9 4 ；h p l c - - p d a 谱图、u v 扫描图和e s i - m s “给出多级质谱碎片信息图如下： 自动标尺色谱警罔 2 0 040 06 0 0矗1 00 01 2 ，0 01 4 6 0 01 8 0 0 2 0 0 0 3 5 也 c 啡l 上 一 一 未 嘉芝警是 一 一 h 泰山蜂胶化学成分研究 白色针状晶体( 正己烷) ；使用聚酰胺薄层板展开，在3 2 0 n m 紫外灯 下有亮蓝色荧光，喷三氯化铁显色剂呈绿色，表明该化合物为酚类。 u v ( c h 3 c o h ) m a x ：2 8 0 n m 、3 2 2 n m ，符合阿魏酸特征。由负离子模式下 一级m s 给出1 9 4 5 m ：z m + h j 一( 基峰) 得知此化合物分子量为1 9 3 ，在 已知蜂胶成分中仅阿魏酸符合。综合m s 2 值1 7 8 2 、m s 3 值为1 3 4 判断质 谱的碰撞诱导裂解过程为： o c h ， 经过与标准样 化合物i v 阿魏酸苄酯( b e n z y lf e r u l a t e ) ，分子式c 1 7 h 1 6 0 4 ，分子量 2 8 4 。h p l c p d a 谱图、u v 扫描图和e s i - - m s n 给出多级质谱碎片信息 图如下： 山东农业大学硕士学位论文 白色针状结晶( c h 3 c o h ) ，使用聚酰胺薄层板展开，在3 2 0 n m 紫外灯 下显蓝色，喷三氯化铁显色剂呈灰绿色，说明此化合物为芬酸类物质。 u v ( c h 3 c o h ) m a x ：2 8 8 n m 、3 2 8 n m ，符合阿魏酸衍生物光谱特征。正离 子模式下一级m s 给出2 8 5 4 m ：z m + h j + ( 基峰) 得知此化合物分子量为 2 8 4 。在已知蜂胶成分中，符合此分子量的有咖啡酸苯乙酯和阿魏酸苄酯， 但咖啡酸苯乙酯特征吸收峰为u v ( c h 3 c o i l ) m a x ：2 2 0 n m ，3 2 2 n m ，与所 得数据不符，并且在裂解过程中出现明显甲基信号，与咖啡酸苯乙酯裂解 规律不符。结合m s 2 值2 7 0 、m s 3 值2 4 2 2 、m s 4 值2 2 4 2 判断质谱的碰撞 诱导裂解过程为： o - - h 2 0 一h 综合以上数据确定此物质为阿魏酸苄酯。 化合物v ：短叶松素3 乙酸酯( p i n o b a n k s i n 3 a c e t a t e ) 分子式： c 1 7 h 1 4 0 6 ；分子量3 1 4 。h p l c - - p d a 谱图、u v 扫描图和e s i - - m s n 给 出多级质谱碎片信息图如下： 泰山蜂胶化学成分研究 臼动环r 色潜图 黄色针状晶体( c h 3 c o h ) ，使用聚酰胺薄层板展开，在3 2 0 n m 紫外灯 下显黄色，喷三氯化铁显红色，说明此化合物为黄酮类物质。符合乔松素 衍生物u v ( c h 3 c o h ) m a x ：2 1 7 n m 、3 0 0 n m 紫外吸收峰特征。负离子模式 下一级m s 给出3 1 3 4 m ：zf m h j 一( 基峰) 得知此化合物分子量为3 1 4 。 在已知蜂胶成