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硕上论文电化学降解壳聚糖的研究 摘要 本文首次提出一种新的壳聚糖降解方法一电化学法，并对电化学和超声联合电化学 两种降解方法进行比较。探讨了电流密度、温度、初始浓、p h 等因素对降解效果的影响。 采用红外、x 一射线衍射、紫外、热重等分析方法对壳聚糖及其降解产物结构进行表征， 研究壳聚糖在电化学降解过程中的动力学。主要研究结果如下： ( 1 ) 采用电化学降解壳聚糖，结果显示t i s n 0 2 一s b 2 0 3 电极板的降解效果优于 t i t i 0 2 r u 0 2 电极板，有磁力搅拌效果较好，降解效果随着电流密度的增大而提高，随 着温度升高而提高，随壳聚糖初始浓度的减小而提高，随原料相对分子量的增大而提 高，随p h 增大先提高后降低。对电化学降解壳聚糖进行了动力学分析，在降解过程中， l n n ( n n 1 ) 】与时间t 成直线关系，其反应符合无规则的降解过程，可能属于一级反应动 力学范畴。 ( 2 ) 采用超声联合电化学降解壳聚糖，结果显示超声电化学降解壳聚糖的效果优于 单独电化学或单独超声降解壳聚糖。降解效果随着电流密度的增大而提高，随着降解 体系的温度升高而提高，随壳聚糖初始浓度的减小而提高，随原料相对分子量的增大 而提高，随时间的增长而提高，随p h 增大先提高后而降低。 ( 3 ) 两种方法都可以制备水溶性低聚壳聚糖。通过表征测试说明，电化学降解和超 声联合电化学降解产物的官能团、结构单元基本没有改变，且降解过程中断裂位置主 要发生在d ( 1 ，4 ) 糖苷键上。 关键词：电化学，壳聚糖，降解，分子量，超声 a b s t r a c t 硕i j 论文 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , an e wm e t h o do fc h i t o s a n d e g r a d a t i o nw a sp u tf o r w a r df i r s tt i m e ： e l e c t r o c h e m i c a lp r o c e s s i na d d i t i o n ，t w od e g r a d a t i o nm e t h o d so fe l e c t r o c h e m i c a la n d s o n o e l e c t r o c h e m i s t r yw e r ec o m p a r e d t h ed e g r a d a t i o ne f f e c to fc u r r e n td e n s i t y , t e m p e r a t u r e ， i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n ，p ha n do t h e rf a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e d t h es t r u c t u r eo fc h i t o s a na n di t s d e g r a d a t i o np r o d u c t sw e r ei d e n t i f i e db yf t - i r , x r d ，u vt c tt h er e s u l t sa r es h o w e da s f o l l o w s ： ( 1 ) c h i t o s a nw a sd e g r a d e db ye l e c t r o c h e m i c a l ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e t i s n 0 2 5 b 2 0 3e l e c t r o d ew a sb e t t e rt h a nt i t i 0 2 一r u 0 2e l e c t r o d eo nc h i t o s a nd e g r a d a t i o n ，a m a g n e t i cs t i r r i n ge f f e c ti sb e t t e rt h a nn om a g n e t i cs t i r r i n g ，d e g r a d a t i o ne f f e c ti n c r e a s e dw i t h t h ec u r r e n td e n s i t y , s y s t e mt e m p e r a t u r ea n dm o l e c u l a rw e i g h to fm a t e r i a l ，d e c r e a s e dw i t ht h e i n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n w h i l ee x h i b i t e da ni n c r e a s e - t o - d e c r e a s et r e n dw i t ht h ep h i na d d i t i o n ，t h er e a c t i o nk i n e t i c so fe l e c t r o c h e m i c a ld e g r a d a t i o nw a sr e s e a r c h e d t h er e l a t i v e c u r v e so fl n n n ( n n 一1 ) v e r s u sr e a c t i o nt i m ei nd e g r a d a t i o np r o c e s ss h o w e dl i n e a r i t y , a n dt h e r e a c t i o nk i n e t i c si sf i r s to r d e r ( 2 ) c h i t o s a nw a sd e g r a d e db ys o n o e l e c t r o c h e m i s t r y , f o u n dt h a tt h ed e g r a d a t i o ne f f e c to f c h i t o s a nb ys o n o e l e c t r o c h e m i s t r yi sb e t t e rt h a ne l e c t r o c h e m i c a lo ru l t r a s o n i c d e g r a d a t i o n e f f e c ti n c r e a s e dw i t ht h ec u r r e n td e n s i t y , s y s t e mt e m p e r a t u r ea n dm o l e c u l a rw e i g h to fm a t e r i a l ， d e c r e a s e dw i t ht h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n ，w h i l ee x h i b i t e da ni n c r e a s e - t o d e c r e a s e t r e n dw i t ht h ep h ( 3 ) t h ee x p e r i m e n i a lr e s u l t ss h o w e dt h a tw a t e r - s o l u b i l i t yc h i t o s a nc a nb ee f f e c t i v e l y p r o d u c e db yt w od e g r a d a t i o nm e t h o d s b yt h ec h a r a c t e r i z a t i o nt e s t s ，t h ed e g r a d a t i o no f c h i t o s a nb ye l e c t r o c h e m i c a la n ds o n o e l e c t r o c h e m i s t r yd i dn o td e s t r o yb a s i cf u n c t i o n a lg r o u p ， s t r u c t u r a lu n i ta n dt h ec r y s t a l l i z a t i o nd e g r e eo fc h i t o s a n i nd e g r a d a t i o np r o c e s s ，t h em a i n f r a g m e n t a t i o no c c u r r e di nt h e1 3 - ( 1 ，4 ) g l y c o s i d i cb o n d k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a l ，c h i t o s a n ，d e g r a d a t i o n ，m o l e c u l a rw e i g h t ，u l t r a s o n i c i i 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明 确的说明。 研究生签名：鲞童舛年6 月p 日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密论文， 按保密的相关规定和程序处理。 研究生签名： 壶2 夔弘户年6 月沙日 硕l 论文电化学降解壳聚糖的研究 1 绪论 壳聚糖( c h i t o s a n ) ，是甲壳质经脱乙酰反应后的产品，来源于软体动物、环节动物和 节肢动物等。壳聚糖在自然界储量丰富并可再生，目前已经广泛的运用在医药、保健、 护肤品、纺织以及农业等多个领域。随着人们的深入研究，发现壳聚糖的分子量对其物 理、化学、生理等方面的性质都具有很大的影响，不同分子量的壳聚糖的性质也有着截 然相反的性质i l 】，许多独特的性质只有当分子量降低到一定程度才表现出来。因此，通 过降解壳聚糖制各低分子量的壳聚糖已经成为最近几年研究的热点。 甲壳素又名壳多糖、几丁质等，是白色或灰白色的粉末。分子量高达数十万甚至数 百万，溶解性极差，不溶于水、稀酸、稀碱及绝大部分溶剂，仅溶于纯甲酸、甲磺酸、 六氟异丙醇、二氯乙酸、这些溶剂以及5 氯化锂- - 甲基乙酰胺( 或n 一甲基- 2 - 吡咯烷酮) 等混合溶剂体系【2 1 。 甲壳素化学结构式如下图1 1 ： h 图1 1 甲壳素化学结构式 壳聚糖，是白色至淡黄色、无定型、略有珍珠光泽的粉末【3 】，是甲壳素的n 一脱乙酰 产物，化学名为1 3 - ( 1 ，4 ) 2 乙酰氨基2 脱氧d 葡萄糖，由少量n 乙酰氨基葡萄糖通过 1 3 - ( 1 ，4 ) 糖苷键和大部分氨基葡萄糖连接起来的直链多糖生物大分子，是至今发现的唯一 天然碱性多糖【4 ，5 】。 壳聚糖化学结构式如图1 2 ： i 绪论 硕t 论文 图1 2 壳聚糖化学结构式 壳聚糖大分子链上分布着许多氨基、羟基和n 一乙酰胺基，它们会形成各种分子间和 分子内的氢键，正因为这些氢键存在，才形成了壳聚糖大分子的二级结构。因原料不同 和制备方法不同，相对分子量从数十万至数百万不等，不溶于水、稀硫酸、稀磷酸和碱 溶液，但是可溶于稀盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸。 1 2 壳聚糖分子= 亘剐新蟠糊蜘 壳聚糖具有显著的物理活性和生理活性f 6 】，有着絮凝和吸附性、生物降解性、抑菌 性、成纤成膜性及其它许多优异性能。但是壳聚糖是高分子类聚合物，分子量不同从而 引起性能上的很大变化，同高分子壳聚糖相比，低分子量的壳聚糖具有一些独特的性质。 1 2 1 分子量对壳聚糖物理性质的影响 1 2 1 1 水溶性【7 ，8 】 壳聚糖分子链结构中含有大量的一o h 和- n h 2 基团。当壳聚糖的相对分子量降低时， 分子之间的氢键作用会随之减弱，分子链上游离n h 2 水合作用也会增强，这些变化使 得壳聚糖分子在水溶液中无序程度增加，水溶性也大大的增加。 1 2 1 2 液晶性 黄炎明1 9 】等人研究了两种用酶降解法得到的低分子量壳聚糖的溶致液晶性。结果表 明在相对分子量低至6 2 2 的低分子量壳聚糖水溶液中仍发现了溶致液晶现象，并确定出 相对分子量为6 2 2 和2 311 的低分子量壳聚糖液晶临界浓度为7 3 和3 6 ，与高分子量 壳聚糖液晶临界浓度随分子量升高而降低的基本规律是一致的。 1 2 1 3 流变性 王伟【1 0 l 等人研究了壳聚糖分子量对其溶液流变性质的影响。结果表明壳聚糖稀溶液 中，其分子量变小，分子链越短，键之间的缠结减少，表现出更好的流动性。 1 2 1 4 成膜性 2 硕上论文电化学降解壳聚糖的研究 一直以来，壳聚糖就被用作为渗透膜用于物理分离，药物缓释等。研究表明壳聚糖 膜的光滑度、结晶性、透光性、对葡萄糖的渗透作用和对蛋白的吸附作用等特性，与其 相对分子量有很大关系【l 。低分子量壳聚糖膜表面结构较为粗糙；壳聚糖膜的结晶度随 壳聚糖分子量的减小而增大；透光性随壳聚糖分子量的减小而变差；对葡萄糖的渗透作 用随壳聚糖分子量的减小而增大；蛋白的吸附作用随壳聚糖分子量的减小而增强。 1 2 2 分子量对壳聚糖生理活性的影响 1 2 2 1 吸湿保湿性 壳聚糖含有大量的o h 和- n h 2 基团，不仅水溶性改善，而且也具有良好的吸湿保 湿功能。夏文水【1 2 】等人的研究表明：一定低分子量的壳聚糖吸湿保湿功能优于甘油和透 明质酸，并且在一定的分子范围内随着壳聚糖分子量的减小，吸湿率逐渐增加。 1 2 2 2 降低胆固醇作用 壳聚糖在很早以前就被发现能够降低胆固醇的作用，低分子壳聚糖是聚阳离子，能 够吸收胆汁酸和胆汁酸，还可以阻止胆固醇进入肠粘膜细胞。陈凡【1 3 】等人用不同相对分 子量的壳聚糖降低胆固醇，发现随着分子量越小，降低胆固醇的药效就越高，有可能是 分子量比较小的壳聚糖，容易在胃中形成小的颗粒，增强对胆固醇吸附作用。 1 2 2 3 抗菌抑茵作用 低分子量壳聚糖具有明显的抑菌活性高、杀菌率高等优点。壳聚糖主要通过破坏细 菌的外膜结构和功能而起到抑菌作用。对小分子量壳聚糖来说，浓度越大，进入病原菌 细胞的壳聚糖小分子越多，能更多的与病原菌d n a 结合，干扰d n a 结构，从而更为 有效地抑制病原菌的生长。郑连英【1 4 】的研究认为：对革兰氏阴性菌，随壳聚糖的分子量 减小，抗菌作用逐渐增强，分子量为5 0 0 0 以下时抗菌作用最强。 1 2 2 4 降血脂 壳聚糖是带正电荷的纤维质，与食物中带负电的脂肪自动附着结合，具有良好的吸 附作用和整合能力，可阻断脂肪分解酵剥巧】，使得脂肪在肠内不被吸收然后排出体外， 从而降低了血脂的含量。王淑玲【l6 】曾用壳聚糖对糖尿病大鼠做实验，发现注射壳聚糖一 段时间以后，发现大鼠血脂明显下降，改善了糖尿病的病变。 1 2 2 5 抗肿瘤 壳聚糖及其衍生物具有抗肿瘤的作用，其抗肿瘤机制既可直接作用于肿瘤细胞，干 扰细胞代谢，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡，又可通过增强机体免疫功能，发挥抗肿瘤 作用。m a e d a 1 7 1 等研究发现低分子量壳聚糖可抑制荷s 1 8 0 细胞小鼠的肿瘤生。r o d e r i c k t l s 】 报道叶绿酸一壳聚糖复合物可抑制杂基因突变和环胺诱导转基因动物的致癌和致突变作 用。 1 绪论硕j ：论文 1 2 3 低壳聚糖的应用研究现状 1 2 3 1 在生物医学及制药等方面的应用i l 蛇l j 壳聚糖的生物相容性良好，在生物医学及制药等方面的应用极其广泛。低分子量壳 聚糖制成的医用纱布，绷带等可用于治疗烧烫类。壳聚糖可以作为天然的可吸收手术缝 合线的材料，能够被人体自行吸收，免除患者的痛苦。聚壳聚糖具有促进脾脏抗体生成、 抑制肿瘤生长的生理功能，特别是低聚6 8 糖可通过活化人体中的淋巴细胞、抑制癌细 胞的繁殖和扩散来达到抗癌抑癌作用。以壳聚糖制成的生物管用于桥接缺损神经，可以 抑制成纤维细胞的生长，进而防止神经瘤的形成，为轴突的生长创造有利的微环境。在 磷酸钙骨水泥中加入壳聚糖作为配料，可以提高骨水泥的内聚力，防止其在体内降解， 并具有良好的组织相容性。 1 2 3 2 在护肤品中的应用1 2 2 j 壳聚糖在护肤品中有着广泛的应用。低聚壳聚糖的保湿增湿效果更佳。使用含有壳 聚糖的化妆品可以加快表皮细胞的再生速度，给皮肤提供营养成分等优点。壳聚糖不但 在护肤品中有着重要应用，而且在护发液和浴液等日用品中也有着重要用途。 1 2 3 3 在食品工业方面的应用【2 3 之5 1 低分子量壳聚糖作为一种具有生物活性的天然高分子化合物，无毒、无副作用，而 且具有低甜度，低热值，降血脂和降血糖等功效。在食品加工过程中，可当做保鲜剂在 水果表面形成形成一层半透明膜，调节水果的代谢，延长贮藏；可用于饮料中，有着优 良的澄清效果；以低分子量壳聚糖为主要原料生产的生物保健品，不仅有利于人体肠内 双歧杆菌的增殖，同时可抑制肠内腐败物质和有毒菌的生成，增加人体内纤维素的质和 量，提高机体的免疫力。低聚壳聚糖的保健功能并不限于某些特定的器官，而且可以作 用于人体全身。 1 2 3 4 在纺织印染上的应用【2 6 】 在纺织方面，壳聚糖可用来做为抗菌纤维中的抑菌剂，也可制成抗菌纤维，在使用 交联剂的情况下，整理织物抗菌性能长久。低分子量的壳聚糖渗透能力强，易于渗透到 纤维内部，与纤维结合更加紧密，可改善织物的抗皱性能。研究表明随着降解壳聚糖整 理液用量的增大，织物的折皱回复角增大当用量为8 时棉织物的急弹折皱回复角为 3 0 6 0 ，缓弹折皱回复角为31 6 7 0 1 2 7 j 。 近年来，科学工作者提出了许多降解方法，并取得了一批令人瞩目的成果。根据制 备方法，可将其分为酸降解法、氧化降解法、酶降解法和物理降解法四大类。 4 硕l j 论文电化学降解壳聚糖的研究 1 3 1 酸降解法 酸降解法是制备低分子量壳聚糖的一种基本方法。它是利用壳聚糖分子中存在众多 的游离氨基与溶液中氢离子结合，引起壳聚糖分子间与分子内部的氢键断裂，使得分子 结构舒展，长链部分易发生断裂，最终得到分子量低的壳聚糖。 1 3 1 1 盐酸降解法【2 8 2 9 b a k e r 等早在1 9 5 8 年就将壳聚糖溶于3 3m o l l 的盐酸溶液中，在1 0 0 。c 条件下反 应3 2 h ，得到了聚合度为l 7 的氨基葡萄糖。采用较温和的盐酸处理条件，能有效地 降低壳聚糖体系的黏度，1 0 壳聚糖稀醋酸中，通过添加2 盐酸于9 0 保温搅拌反应 6 h ，能有效地降解壳聚糖，体系的黏度下降达9 1 1 3 。 1 3 1 2 磷酸 m a k o t o 3 0 】等研究了用8 5 磷酸水解壳聚糖，在室温内放置1 6 星期，壳聚糖有明 显的降解，降解产物中有不溶于水壳聚糖( 4 3 的产率) 聚合度为1 6 ，水溶性的壳聚糖 ( 1 2 5 的产率) 聚合度为7 。 1 3 1 3 其他酸 取0 3 9 壳聚糖分别溶于3 0 m l 质量分数均为2 0 9 k g 1 的草酸、柠檬酸、苹果酸、琥 珀酸、酒石酸中，在7 0 条件下降解1 0 h ，壳聚糖的降解速度在草酸中最快，柠檬酸中 次之，琥珀酸和苹果酸中依次减小【3 1 j 。分子量从1 1 6 1 0 5 分别降低到5 0 4 1 0 5 、6 2 6 1 0 5 、7 6 6 1 0 5 和8 8 3x1 0 5 。 1 3 2 氧化降解法 氧化降解法是目前研究最多的方法，包括过氧化氢法、过硼酸钠法、次氯酸钠法等。 1 3 2 1 过氧化氢法 过氧化氢氧化降解因成本低、降解速度相对较快、产品分子量低且分布窄，无残毒、 所以应用的最多阎。任艳玲等3 3 1 人采用过氧化氢在中性条件下氧化降解壳聚糖，在壳 聚糖的水溶液加入一定量的双氧水，加热搅拌一段时间进行降解。可以将壳聚糖的分子 量从1 0 3 万降解到5 万，氧水的质量百分比、反应温度、反应时间等因素均可对其产生 一定影响。刘羿君【3 4 1 等人在乙酸体系中对壳聚糖进行降解，在常温下称取1 o g 壳聚糖 搅拌溶于0 2 m o l l 1 的乙酸溶液中，控制反应温度，加入过氧化氢后慢速均匀搅拌。在 p h 为5 0 6 5 时的乙酸均相体系中，过氧化氢对壳聚糖具有很好的降解效果，可以得 到分子量为6 8 1 0 3 的壳聚糖。h 2 0 2 氧化降解法降解后期降解产物的颜色会变成褐色， 这是因为壳聚糖降解过程中发生了羰氨反应，因此产生了褐变反应【3 5 1 。 1 3 2 2n a o c l h 2 0 2 协同氧化法p 6 1 n a o c l h 2 0 2 协同氧化可以制备壳寡糖，用o 6 m o l 摩尔配比为2 5 的n a o c l h z o z 协 同氧化剂氧化降解6 0 9 壳聚糖，在反应p h 为6 0 ，温度为5 5 。c ，时间8 h 的条件下，可 i 绪论硕i j 论文 使9 8 的壳聚糖转化为壳寡糖。证明该氧化反应主要是开裂壳聚糖的1 3 - ( 1 ，4 ) 糖苷键来进 行的。 1 3 2 3 钨磷酸一过氧化氢 黄金凤【3 7 1 等人研究了在异相条件下钨磷酸催化氧化h 2 0 2 降解壳聚糖，在h 2 0 2 浓 度2 7 m o l l 一、反应时间2 0 m i n 、反应温度9 0 、催化剂与壳聚糖的质量比0 o l 的最佳 条件下可制得分子量为1 2 x 1 0 4 左右的水溶性壳聚糖。 1 3 3 酶降解法 酶降解法没有副反应、降解条件温和、降解过程及降解产物相对分子量分布容易控 制、制备的低聚壳聚糖生物活性高，且不对环境造成污染。目前，已经发现3 0 多种酶 可以用来对壳聚糖进行降解。其中，包括专一性酶如壳聚糖酶，非专一性酶如脂肪酶、 溶菌酶、果胶酶、木瓜蛋白酶等。 1 3 3 1 壳聚糖酶 壳聚糖酶以内切作用方式催化水解壳聚糖中氨基葡萄糖营键，生成聚合度为2 8 的低聚糖聚合物。方文建等【3 翻利用青霉素产生壳聚糖酶来制备低分子壳聚糖，研究表明 在3 0 、p h 为5 0 、壳聚糖酶量为0 0 1 u m l 。的条件下降解4 壳聚糖，通过m h s 方 程1 1 = 1 0 2 x 1 0 _ 4 m w l 。2 7 控制反应时间脂肪酶，可以得到低分子量的壳聚糖。 1 3 3 2 脂肪酶 脂肪酶( 1 i p a s e ) 是作用于水有机界面上不溶性物的脂酶。夏文水等使用麦胚脂肪酶 在微酸性条件下能在几分钟内快速降低壳聚糖的粘度，使壳聚糖的平均分子量降低，形 成无任何偏向的分子组分。张洪威3 9 1 等人研究了脂肪酶降解壳聚糖过程中温度、时间、 酶浓度对降解程度的影响，结果表明，在温度6 0 。c ，降解时间是5 h ，酶量为7 0 0 u g 时 可以得到分子量下于1 万的低壳聚糖。王丽娟【4 0 j 等通过还原端基含量测定、粘度测定研 究了非专一性脂肪酶对壳聚糖的降解作用，研究发现脂肪酶水解壳聚糖不符合 m i c h a e l i s m e n t e n 方程，且3 m m o l l 的c u 2 + ，1 0 m m o l l 的m 9 2 + 、c a 2 + 对脂肪酶有一定 的激活作用，1 0 m m o l l 的8 a 2 + 、z n 2 + 、f e e + 对该酶有一定的抑制作用，随着底物壳聚糖 脱乙酰度的提高，降解速度降低。 1 - 3 3 3 溶菌酶【4 1 】 溶菌酶在工业上的应用较为广泛，主要存在于鸡蛋蛋白及人的唾液中，其中从鸡蛋 蛋白中提取的溶菌酶的转糖苷化能力较强。溶菌酶能够在酸性条件下迅速的降解壳聚 糖，断裂连接断裂连接d 氨基葡萄糖和d 乙酰基氨基葡萄糖的p ( 1 ，4 ) 糖苷键，得到低 分子量壳聚糖。在降解过程中，金属离子c u 2 + 、z n 2 + 、b a 2 + 、c ，能够提高溶菌酶的活 性，而k + 、c a 2 十和高浓度的z n 2 + 会抑制酶的活性。 1 3 3 4 果胶酶 6 硕上论文电化学降解壳聚糖的研究 果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶，广泛的存在植物界。李和生【4 2 】等人采用液体 果胶酶p e c t i n e x 对壳聚糖进行降解，并通过正交试验对果胶酶水解壳聚糖的工艺进 行优化，还对降解过程中粘度、还原糖生成量、平均分子量等指标的动态变化进行研究。 发现在温度5 0 ，p h 值4 5 ，果胶酶用量与壳聚糖质量之比为3 ，壳聚糖脱乙酰度为 8 0 是降解效果在最佳。k i t t u r f 4 3 1 等人研究了果胶酶对壳聚糖的降解作用。研究显示 a n i g e r 果胶酶对壳聚糖及其珩生物有着降解能力，反应的最佳作用条件是温度4 7 。c 和 p h 为3 0 ，而且遵守经典的m i c h a e l i s m e n t e n 动力学方程，生成的壳聚糖的分子质量范 围在5 1 0 3 2 1 0 4 之间，且具有较高的结晶性。 1 3 3 5 木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶价钱便宜且稳定性好，对壳聚糖的降解效果也比较高。黄永春一j 等人研 究木瓜蛋白酶催化壳聚糖降解过程中，酶量、温度、底物质量浓度以及脱乙酰度等条件 对降解速率的影响。结果表明，木瓜蛋白酶只选择地降解g l c n a c g i c n 糖苷键，反应 最适p h 值和温度分别为4 5 和4 5 。c 。而k u m a r t 4 5 】等人发现p a p a y al a t e x 木瓜蛋白酶在 最适的p h 为3 5 和温度3 7 时，能有制备低分子量壳聚糖，其中的聚合度在2 6 之间。 1 3 4 物理降解法 物理降解法主要有超声波降解法、丫射线降解法、微波场降解法等。 1 3 4 1 超声波 r e n a t a 4 6 】等研究了3 6 0 k h z 超声波对水溶液中的壳聚糖的作用。结果表明超声波是 一种有效的降低多糖分子质量的手段。董岸杰等【4 7 1 人研究了超声波对壳聚糖降解速度的 影响与降解条件( o n 氧化剂、温度等) 有较大关系，表明了超声波能够不仅大大加速壳聚 糖的降解反应，而且不影响壳聚糖降解反应的动力学规律。刘石生【4 8 】等对超声波对壳聚 糖降解作用的主要机制进行了探讨，证明超声的空化作用是其主要降解作用机制，并证 明反应属于高斯降解类型，降解发生在1 3 - 0 ，4 ) 糖苷键发生断裂且降解前后晶态没有变 化。 1 3 4 2y 辐射法 丫射线的穿透能力强，可以一次性的把全部或部分的能量传递介质子。s e o kc h o i 等【4 9 】研究了用不同剂量的c o 6 0y 射线辐照醋酸溶液( 2 ) 中的壳聚糖，得到低分子量壳 聚糖，当辐射剂量达到1 0 k g y ，分子量降低速率大大增大，当辐射剂量超过1 0 0 k g y ， 会出现深褐色。康斌【5 0 】等人研究了壳聚糖y 辐射降解产物的水溶性规律，研究表明壳聚 糖的相对分子量随着辐射剂量增加不断减小，产物在水中的溶解度也不断增大。并发现 降解过程中壳聚糖结晶形态由初始的q 态向b 态转变，结晶度不断下降。 1 3 4 3 机械研磨法 机械研磨技术是指固体颗粒物质在通过摩擦、冲击、碰撞等机械力作用下，诱导材 7 1 绪论硕l ：论文 料组织、晶体结构和物化性能的变化，使部分机械能转变成物质的内能，从而引起固体 的化学活性增加。蒋林斌等【5 l 】人研究了搅拌球磨机械活化降解壳聚糖的工艺，并考察了 机械活化时间、温度及搅拌速度对壳聚糖溶解度和分子质量的影响。结果表明，机械力 化学作用最明显，其次为搅拌速度和温度，降解产物的结晶结构受到破坏，其结构从晶 态变成非晶态。 1 3 4 4 微波场 微波是一种频率在0 3 3 0 0 g h z 的电磁波，介于红外与无线电波之间，在化学反应 中，常采用2 4 5 0 m h z 的微波进行辐射反应。r o n g e 5 2 】等研究了在微波环境中，无机盐 对于壳聚糖降解的影响。发现通过微波可以制备低分子量壳聚糖。并且在微波照射下， 添加一些无机盐可以有效地提高壳聚糖的降解速度。 1 3 4 5 高压均质法 k a s a a i 5 3 】等人采用微射流的高压均质机裂解壳聚糖，取得了不错的效果，获得了低 分子量的壳聚糖，同时还考察了壳聚糖浓度、均质阀压力、温度、溶剂等因素对降解效 果的影响。周今朝【5 4 】研究了高压均质法降解壳聚糖，发现降解效率随原料分子量的增大 而提高，随壳聚糖溶液浓度的增大而降低，随均质压力的增大而提高，随循环次数的增 加而提高，不随乙酸溶液浓度、乙酸钠溶液浓度及温度发生变化。 1 3 4 各种方法的比较 下面对各种主要的壳聚糖降解的方法进行比较： ( 1 ) 酸降解法是一种简易的方法，可分离得到低至单糖的各种低分子量壳聚糖，其 降解反应所用试剂价廉易得，易于实现工业化，但酸降解法制备低分子量壳聚糖的产率 较低，反应难以控制。另外，酸降解法引入了强酸，后处理比较困难，会给环境造成了 一定的污染。 ( 2 ) 氧化降解法原理简单，见效快，成本适中，但可能引入毒物，降解产物质量不 易控制，分离也有一定的困难。 ( 3 ) 酶降解法不需要加入大量的化学试剂，反应条件较温和的，对环境污染少，但 生产周期长，酶的提取纯，成本较高等方面存在都有一定的困难，无法实现大规模的工 业化生产。 ( 4 ) 物理降解法设备单一，不会引入杂质，但是目前大多数的物理方法还只是处于 实验室研究阶段，要实现工业化生产，还必须进行更深入的研究。 从降解机理、原料、质量控制、环保及成本等方面综合考虑，壳聚糖降解现有的方 法需要深入的研究和完善，并且需要探索新的降解方法。在此基础上，本文提出一种新 的降解壳聚糖的方法一电化学法。在电极和溶液表面界面上进行电化学反应，不需要外 加试剂，有利于产物分离和提纯，几乎没有或很少有二次污染：反应在常温常压下即可 8 硕十论文电化学降解壳聚糖的研究 进行，能利用率高，易于控制，易于工业化。 电化学是研究电和化学反应之间的相互作用，电能和化学能之间的相互转换的科 学。由于电化学技术设备简单，易于控制，在常温常压下进行，且没有二次污染。使得 电化学方法在燃料电池、蓄电池、污水处理、环保等多个方面都有广泛应用。刘海萍【5 5 】 等人研究掺锑二氧化锡多孔钛阳极对苯酚进行电化学氧化降解，结果显示苯酚的催化降 解最终产物为二氧化碳。王斌【5 6 】研究了电化学法处理t n t 废水，用钛基二氧化铅阳极 板电解t n t 黄水2 4 小时，t n t ，色度以及c o d c r 的去除率分别可达到9 8 7 ，8 5 8 和6 0 8 ，降解效果显著。 电化学法原理【5 7 j ： 根据电极参与氧化反应的机理不同，电化学氧化法可分为直接氧化法和间接氧化 法。直接氧化法是指被氧化物质和电极基体直接进行电子传递的氧化方法。在直接氧化 工艺中，有机物首先吸附在电极表面，然后通过有机物与电极之间的直接电子传递，使 有机物降解。间接氧化就是利用电极表面产生的强氧化剂( 如羟基自由基、h 2 0 2 、次氯 酸、f e n t o n 试剂等) ，使有机物被氧化降解。产生的氧化物质，既可以是氧化媒质催化 剂，也可以是短寿命的中间物。活性物质的产生与电极材料、电极表面电荷、电解质溶 液的组成和浓度有密切的关系。 根据被氧化物质氧化程度的不同，电化学氧化法又可分为电化学氧化与电化学燃 烧。电化学氧化是指主要依靠阳极的氧化作用，将吸附在电极表面的有机污物直接氧化 降解生成小分子。电化学燃烧是指将有机污染物深度氧化，最终产物为水和c 0 2 。 1 5 本课锄嗍内容揪 目前，壳聚糖在国内外已经广泛的应用于食品、化妆品、生物医药等领域。但从自 然界直接获取的壳聚糖分子量往往较高，使其应用受到限制。因此寻找一种简便、可工 业化生产、高效、且具有很大发展前景的壳聚糖降解方法一直都是研究壳聚糖的热点。 本文主要采用电化学方法对壳聚糖的降解，制备低分子量壳聚糖，为壳聚糖进行降解提 供一种新的方法。 主要研究内容： ( 1 ) 采用双突跃电位滴定法测定壳聚糖以及其降解产物的脱乙酰度；粘度法测定壳 聚糖以及其降解产物的相对分子量。 ( 2 ) 采用电化学法降解壳聚糖。探讨在降解过程中，电极板种类、磁力搅拌、电流 密度、壳聚糖初始浓度、温度、原料相对分子量、p h 以及时间等因素对降解效果的影 响，为制备低分子量壳聚糖提供科学依据。 9 l 绪论硕j j 论文 ( 3 ) 采用超声联合电化学方法降解壳聚糖，并与单独超声和电化学降解壳聚糖进行 比较。探讨在超声电化学降解过程中，电流密度、壳聚糖初始浓度、温度、原料相对分 子量、p h 以及时间等因素对降解效果的影响。 ( 4 ) 通过脱乙酰度、红外、x 射线衍射、紫外和热重的测定对壳聚糖原料以及两种 方法降解产物进行表征，分析壳聚糖降解产物的结构、性能、结晶度和热稳定性的变化， 并对电化学降解壳聚糖的动力学进行分析。 1 0 硕十论文电化学降解壳聚糖的研究 2 壳聚糖基本性能的测定 壳聚糖的不同来源、不同的制备条件以及不同的反应条件都会引起壳聚糖的基本性 能不同。其中，脱乙酰度和相对分子量是壳聚糖两个最重要的性能指标。本文采用双突 跃法来测定壳聚糖的脱乙酰度，用粘度法考察壳聚糖的相对分子量，以充分了解壳聚糖 原料的基本性能，为下一步实验做准备。 2 1 壳聚糖脱z j 睨劐黼聪定 脱乙酰度( d e a c e t y l a t i o nd e g r e e ，缩写为d d ) ，即壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数 占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数，已成鉴定壳聚糖质量的一个重要指数【5 8 , 5 9 】。 脱乙酰度测定方法主要有氢溴酸盐法、酸碱指示剂滴定法、电位滴定法、红外光谱 法等i 5 引。电位滴定和用甲基橙为指示剂的酸碱滴定法是目前普遍使用的测定壳聚糖脱乙 酰度的方法【6 0 , 6 1 】。由于壳聚糖在生产过程中常常吸附残酸或残碱，因此采用双突跃电位 滴定法可以有效地消除残酸或残碱的影响，使结果更为可靠。 2 1 1 双突跃电位滴定法的原理 壳聚糖的自由氨基呈碱性，用过量的盐酸溶解准确称量的壳聚糖样品，自由氨基可 与酸定量发生质子化反应，形成壳聚糖的胶体溶液，同时溶液中含有过量的盐酸，即 o o 用n a o h 标准溶液滴定时，n a o h 标准溶液首先中和过量的盐酸，p h 值出现急剧 上升，即第一突跃。然后n a o h 标准溶液再中和与壳聚糖n h 2 结合的盐酸，达到滴定 等当点时，p h 出现第二个突变。两个突变间消耗的n a o h 摩尔数相当于样品中的- n h 2 摩尔数。壳聚糖脱乙酰基c 【根据所得两个突跃点消耗n a o h 的体积就可以得到了。 2 1 2 实验试剂和仪器 样品：壳聚糖，浙江金壳生物化学有限公司 2 壳聚糖基本性能的测试 硕l ：论文 表2 1 实验药品一览表 2 1 3 实验方法 准确称量0 2 9 壳聚糖原料( 含有0 0 9 的水分) ，放入到5 0 m l 的烧杯中，加入2 0 m l 的o 1 m o l l h c l ，搅拌至完全溶解，再加入3 0 m l 蒸馏水。将p h 电极放入样品溶液中， 用0 1 m o l l n a o h 标准溶液进行滴定，记录原p h 值及加入不同体积n a o h 标准溶液后 被滴定液的p h 值。以溶液的p h 值对n a o h 标准溶液滴定体积作图，即得到酸碱滴定 曲线。做出p h v n a o h 滴定曲线和级微商曲线，就可以得到双突跃滴定曲线。 2 1 4 实验数据与处理 壳聚糖脱乙酰基程度a 可按下式计算： 口：坐兰竺业旦兰! q ：兰! 鱼 m 0 0 9 9 4 ( 2 1 1 式中：a v 一二个突变点之间的消耗的n a o h 体积之差( m l ) ； c n a o h n a o h 的浓度( m o l l _ ) ； m 一样品质量( g ) ，m = 0 2 x ( 1 0 0 9 ) = 0 1 8 2 9 ； a 一脱乙酰基程度； 1 6 一氨基的相对分子量； 0 0 9 9 4 一理论氨基含量。 电位滴定曲线和一级微商曲线如图2 1 和2 2 所示： 1 2 硕上论文电化学降解壳聚糖的研究 ， 司 - e - , q 图2 1 壳聚糖脱乙酰度的p h 值滴定曲线 图2 2 一级微商曲线 从图可以看出两个明显的突跃点，第一突跃点在p h = 3 5 6 ，第二个突跃点在 p h = 8 7 5 。二个突变点之间的消耗的n a o h 体积之差可以从一级微商中得出，a v = 1 0 m l 。 将a v 代入2 1 式就可以得到壳聚糖的脱乙酰度为8 9 。 2 2 壳聚馋胁彤押随酯撇 在壳聚糖溶液性质中，壳聚糖相对分子量是其中一个很重要的性质。壳聚糖相对分 子量的大小直接影响着它的性质。测定壳聚糖分子量的方法有很多种，粘度法测定分子 量是一种常用方法。壳聚糖的粘度直接反映了壳聚糖的分子量，其溶液的粘度越大，分 子量就越高，相反，其溶液的粘度越小，分子量就越低。当壳聚糖的分子量控制在1 0 3 1 3 2 壳聚糖基本性能的测试 硕 ：论文 1 0 4 个数量级范围才能够满足对它更多的需求。 2 2 1 粘度法的原理 abc 图2 3 乌氏粘度计 粘度法即是通过测定样品溶液的粘度，从而计算出样品分子量的方法。溶液的粘度 测定，不仅实验设备简单、操作方便，而且有相当好的精密度。高聚物溶剂分子之间的 内摩擦表现出来的粘度叫纯溶剂粘度，记作t 1 0 ；溶液的表现粘度为r l ；其溶液粘度增加 的分数，称为增比粘度，记作 1 。p ，即 驴等2 亿2 ， 其中t 1 r 相对粘度，即为溶液粘度与纯溶剂粘度的比值t 1 闸佃o 。单位浓度下所显示 出的增比浓度，即1 1 。少称为比浓粘度；而l n r l r c 称为比浓对数粘度。其中t 1 ，和t 1 。p 都是 无因次的量。 溶液的粘度与溶液有关，为了消除粘度对浓度的依赖性，定义了一种特性粘度h 】， 其式为： m 2 觋孚= l 。i 训m 孚 ( 2 3 ) 川被称为特性粘度，其值与浓度无关。实验证明，当聚合物、溶剂和温度确定以 后，h 】的数值只与其平均相对分子量m 有关，它们之间的半经验关系可用m a r kh o u w i n k 方程式表示： 【7 7 】= k 厨口 ( 2 4 ) 在一定的分子量范围内，k ，a 都是与分子量没有关系的常数，它们都与温度、聚 合物、溶剂性质有关，k 为比例常数，a 是与分子形状有关的经验常数。因此只要知道 特性粘度【t 1 】的值就可以计算出聚合物的分子量。 k 和q 的数值，只能通过其它绝对方法确定，例如渗透压法、光散射法等等。 1 4 硕j j 论文电化学降解壳聚糖的研究 测定液体粘度的方法主要有三类：( 1 ) 用毛细管粘度计测定液体在毛细管里的流出 时间；( 2 ) 用落球式粘度计测定圆球在液体里的下落速度；( 3 ) 用旋转式粘度计测定液体 与同心轴圆柱体相对转动的情况。 测定高分子的 t 1 】时，用毛细管粘度计最为方便。当液体在毛细管粘度计内因重力 作用而流出是遵守p o i s e u i l l e 定律： z c p r 4 t x g h r 4 p t ，7 = 一= 一 。8 l v8 l v ( 2 5 ) p 为液体的密度；l 是毛细管长度；r 是毛细管半径；t 是流出时间；h 是流经毛细 管液体的平均液柱高度；g 为重力加速度；v 是流经毛细管的液体体积；m 是与机器的 几何形状有关的常数，在r l 5 0 时，p h 对降解效果 影响不大。所以反应溶液的p h 宜控制在4 0 , - - - 5 0 之间。 3 3 2 降解产物的表征 3 3 2 1 降解产物的凝胶渗透色谱分析 通过凝胶渗透色谱考察降解前后壳聚糖分子量分布的变化。色谱条件：色谱柱 t o s o h a a s t s k ( g m p w x l 3 0 x 7 8 m m ) ，流动相0 2 5 m o l l h a t - - - 0 2 5 m o l l n a a c 溶液，温 度3 5 ，流速0 4 m l m i n 。当实验温度为5 0 ，壳聚糖相对分子量为5 0 万，初始浓度 为3 9 l ，p h 为4 9 ，磁力搅拌器搅拌，电流密度为6 0 m a c m ，t i s n 0 2 s b 2 0 3 电极板， 降解时间3 0 m i n ，壳聚糖原料及其降解产物的凝胶渗透色谱如下图3 8 所示。 硕j 二论文电化学降解壳聚糖的研究 窭 舌 鲁 巴 暑 旦 罟 图3 8 壳聚糖原料及其降解产物的凝胶渗透色谱图 a - 壳聚糖原料；b 电化学降解产物 通过比较壳聚糖原料与降解产物的凝胶色谱图可以发现，原料和降解产物的凝胶色 谱图谱基本相似。壳聚糖电化学降解产物的凝胶色谱峰的位置有着明显的变化。降解产 物主峰的位置向后偏移，即保留时间长，说明壳聚糖通过电化学发生降解反应，相对分 子量减少。 3 3 2 2 脱乙酰度测定 本文采用双突跃滴定法测定电化学降解产物的脱乙酰度，降解反应在温度为5 0 ， 壳聚糖相对分子量为5 0 万，初始浓度为3 9 l ，p h 为4 9 ，电流密度为6 0 m a c m 之下降 解1