毕业论文--冷胁迫响应玉米miRNA的靶基因预测及RACE鉴定.docx

摘 要玉米（Zea mays L.）为禾本科，玉蜀黍属一年生草本C4植物，起源于热带或亚热带地区。玉米用途十分广泛，是重要的饲料作物，又是食品、化工、燃料及医药等行业的重要原料，因此全球玉米种植面积居粮食作物首位，我国的玉米种植面积也于2008年超过水稻成为第一大粮食作物。玉米在我国国家粮食安全中起着极其重要的作用，生产生活中对玉米的需求不断增加，因而向高纬度、高海拔地区拓展种植区域的需求不断增加。但是起源于热带、亚热带地区的玉米，在生长周期中表现出对低温冷害较为敏感，在整个生长周期过程中极易遭受低温冷害的影响而导致减产。研究表明，逆境胁迫不仅会诱导植物蛋白质编码基因的表达，也会诱导一些非蛋白质编码基因的表达，这类非蛋白质编码基因的表达产物在植物的生长、发育和应对逆境胁迫等过程中发挥重要的调控作用。microRNA（miRNA）是一类内源性小分子的非编码RNA，它通过对其靶基因mRNA的降解或抑制翻译等进行基因表达调控，进而参与调控植物相关生理活动。miRNA在植物体的新陈代谢、组织器官发育以及分化中起着重要的作用，同时可以响应多种胁迫，能够在植物感受逆境胁迫过程中，做出相应的适应性调整，在植物抵御逆境胁迫过程屮发挥着非常重要的作用。本次研究主要是对冷胁迫响应玉米miRNA的靶基因预测与5RACE鉴定。通过对玉米三叶一心期幼苗不同处理，提取玉米幼苗二、三叶总RNA，并对提取的总RNA进行反转录、巢式PCR、构建载体转化、培养大肠杆菌等，获得单菌落并测序对比，最终得到玉米中miR171n-3p的剪切产物和剪切位点。关键词：玉米；冷胁迫；microRNA；RACE；靶基因AbstractMaize （Zea mays L.） is a C4 plant species of gramineous and originated in tropical or subtropical regions.Growth and productivity of maize are severely constrained by chilling stress. Because maize is widely used as forage crop, and is an important raw material for chemical, food, fuel and medicine industry, the planting area of maize ranks first world wide, and it became the first major grain crops in China in 2008. Maize plays an extremely important role in the national food security in our country. The boosting requirement for maize demand of expanding the planting area to the high latitude and high altitude region is increasing. As originated in tropical and subtropical areas, maize showed sensitive to low temperature during the entire growth season.Studies have shown that stress can not only induce the expression of plant protein coding genes, but also induce the expression of some nonprotein-encoding genes.The expression products of these nonprotein-encoding genes play an important regulatory role in the process of plant growth, development and stress. MicroRNA （miRNA） is a kind of non-coding RNA of endogenous small molecule. It is involved in the regulation of plant-related physiological activities by regulating gene expression of its target gene mRNA or inhibiting translation. MiRNA plays an important role in plant metabolism, tissue development and differentiation, and can respond to a variety of stress.It is necessary to make the appropriate adjustment in the process of plant stress and stress, which plays a very important role in the process of plant resistance to stress.This study was mainly based on the prediction of the target gene of maize miRNA response to cold stress and 5RACE identification. Through the different treatments of maize clover seedling.Total RNA was extracted from the second and third leaves of maize seedling, and the total RNA extracted was reverse transcribed, nested PCR, vector transformation, culture of Escherichia coli.A single colony was obtained and sequenced. The shear product and cleavage site of miR171n-3p in maize were obtained.Key words: maize; cold stress; microRNA; RACE; target gene26目 录摘 要IAbstractII第一章 绪 论1第1节 低温冷害的类型及其对玉米的影响1第2节 植物microRNA的研究进展22.1 植物microRNA的生物合成22.2 植物microRNA的作用机制3第3节 玉米microRNA的研究3第4节 植物miRNA的研究方法与技术路线54.1 植物miRNA的研究方法54.2 技术路线6第二章 自交系B73玉米材料的获取和处理7第1节 自交系B73玉米材料的获取71.1 实验材料及仪器71.2 玉米材料的种植7第2节 自交系B73玉米材料的处理72.1 实验材料及仪器72.2玉米材料的处理7第三章 B73玉米幼苗叶片总RNA的提取8第1节 RNA提取实验器材的除RNase灭菌处理81.1 实验试剂及仪器81.2 实验方法8第2节 B73玉米幼苗叶片总RNA的提取82.1 实验材料及仪器82.2 实验方法8第3节 结果与分析9第四章 miRNA靶基因预测及RACE验证10第1节 靶基因预测10第2节 5RACE验证102.1 实验材料及仪器102.2 实验方法10第3节 靶基因降解组测序133.1 电泳回收143.2 连接转化143.3 PCR进行菌液检测及测序14第4节 结果与分析144.1 两轮巢式PCR引物设计与产物检测144.2 降解产物RACE验证15结 论17致 谢18参考文献19第一章 绪 论玉米（Zea mays）为禾本科，玉蜀黍属一年生高大草本植物，起源于热带或亚热带地区。玉米产量位于粮食作物之首，且玉米用途十分广泛，所以玉米在全世界热带和温带地区广泛种植。近年来，玉米种植面积已经跃居全球第一我国的玉米种植面积于2008年超过水稻成为第一大粮食作物。玉米在我国国家粮食安全中起着极其重要的作用，是重要的饲料作物，又是食品、化工、燃料医药等行业的重要原料。玉米为起源于热带地区的C4植物，是一种喜温作物，对温度要求较高，玉米在整个生长周期过程中极易遭受低温冷害的影响而导致减产。因此研究玉米抗冷分子机理具有十分重要的意义。第1节 低温冷害的类型及其对玉米的影响低温冷害（low temperature,chilling or cold damage）是影响我国东北地区玉米生产的主要灾害之一，一般指高于0而低于20的温度1。它简称冷害，指农作物在生育期间遭受低于其生长发育所需的环境温度，引起农作物生育期迟，或使其生殖器官的生理机能受到损害，导致农业减产的现象。冷害的分类主要有两种分类方法，一种分类方法根据在农业气象学中，低温对作物危害的特点及作物受害的症状来划分，将冷害类型分为三类，即延迟型冷害、障碍型冷害和混合型冷害（指延迟型与障碍型冷害在同年度发生）2。延迟性冷害是指作物生长发育期间（主要是营养生长期、有时也包括生殖生长期）遇到低温，消弱了生理活性而使生育期显著延迟，作物不能正常成熟而减产的现象。障碍性冷害是指作物在生殖生长期（主要从颖花分化期到抽穗开花期）遇到短暂而强烈的低温，生殖器官受破坏而减产的现象2。另一种对冷害的分类方法是从灾害角度按照冷害发生的时间将冷害分为三类，即春季低温冷害、秋季低温冷害、东北夏季低温冷害类。农作物低温冷害是我国北方地区主要农业气象灾害之一，其中东北地区发生比较严重和频繁。东北地区是我国玉米生产基地之一，也是世界著名的三大黄金玉米带所在地，该区域玉米播种面积近6.0106hm2，约占粮食作物总面积的一半，正常年景年产玉米 7.01010kg左右，约占全国玉米总产量的40%3。但是，由于东北大部分地区常年气温较低，积温不足，加之中、晚熟品种播种面积比例较大，因而经常发生玉米延迟型低温冷害，如1954、1957、1969、1975、1976、1985和1995年等年份，低温冷害导致东北大部分地区玉米单位面积产量减产 10%以上，严重年份减产 15-20%甚至更多，同时造成玉米含水率高，品质下降3。第2节 植物microRNA的研究进展2.1 植物microRNA的生物合成小RNA长度为21-24nt，也叫作microRNAs（miRNAs）或短干扰RNA（siRNAs），在动植物中广泛抑制基因的表达。植物小RNA最初由Dicer-like（DCL）蛋白的内切酶活性剪切一个大的RNA前体的螺旋区域形成双链复合体。复合体中的一条链与AGO蛋白结合形成复合体。2.1.1 microRNA前体的转录植物miRNAs主要在基因区域发现而与蛋白编码基因无关4，大多是植物miRNAs都有自己的转录单位。植物miRNAs偶尔在基因组中成簇排列，暗示可能从初级转录本得到多个miRNAs（例如miR395）5, 6。Northern，EST和图位克隆的证据表明植物miRNA初级转录本（有时称为pri-miRNAs） 大大长于miRNA的茎环结构6, 7, 8。部分pri-miRNAs转录后会被剪切、加尾7, 9和加帽8。植物miRNA初级转录本可能超过1kb，它们前面通常是一个典型的TATA-box，经历了经典的剪接、加尾以及加帽，表明RNA聚合酶参与了大多数植物 miRNAs的转录8。虽然我们对植物中miRNAs的转录调节了解相对较少，但是我们没有理由怀疑它们的调节方式与蛋白编码基因有什么不同。2.1.2 miRNAs的加工与输出miRNAs成熟的核心步骤是通过RNase III内切酶将成熟的miRNAs从miRNAs前体中切下来，比如Dicer酶。这个过程在动植物中存在显著差别。Drosha蛋白是定位于细胞核中的RNase III酶，对pri-miRNA进行第一次剪切将miRNAs前体（pre-miRNA）从初级转录本侧翼序列释放出来形成茎环结构10。输送到细胞质以后，Dicer对miRNA前体进行第二次剪切，释放miRNA/miRNA*双链（近似完全配对）10。miRNA/miRNA*双链复合体通常在3末端有两个碱基突出11，与Dicer酶剪切长双链RNA产生siRNA双链复合体的突出类似12-14。植物中，DCL1是产生miRNA所必需的，尽管中间产物并不在DCL1突变体中大量积累，暗示DCL1可能有类似Drosha活性并在第一次剪切中起作用4, 9, 15。拟南芥中另外三个类Dicer酶都与miRNA的生物合成无关16,17，暗示DCL1也可能参与了第二次剪切。事实证明两次剪切产生miRNA/miRNA*双链复合体的过程均发生在细胞核中，同时DCL1主要定位于细胞核，所以认为植物中的DCL1兼具Drosha和Dicer的功能16,18,19。2.2 植物microRNA的作用机制2.2.1 miRNA指导的RNA 剪切小RNA调节基因表达主要有三种方式：RNA剪切、抑制翻译和转录沉默。植物mi RNAs的功能涉及靶基因剪切和翻译抑制。证据表明植物miRNAs通常指导互补或近似互补的mRNAs的剪切，比如在小麦胚芽和拟南芥的溶胞产物中均发现了miRNAs指导的剪切活性20, 21。植物中miRNAs代谢通路突变（如：hen1,ago1,and hyl1）导致miRNAs受损时很多的miRNAs靶基因表达水平会升高22,23,24。与此相似，表达特定RNA沉默子的病毒抑制因子导致miRNAs靶基因过量积累25-29，然而过表达miRNAs会导致靶基因mRNA减少20, 30-32。这些结果暗示miRNAs负调控其靶基因的稳定性。而且，通过Northern26, 33-35和5RACE6,26, 28,36实验在活体细胞内还可以检测到miRNAs剪切后的3末端产物。5RACE得到的片段与miRNAs 10-11位核苷酸匹配的靶基因相一致，恰恰是RISC剪切的位置12, 35。2.2.2 miRNAs介导的翻译抑制RISC介导的剪切不能解释沉默RNA相关的翻译抑制机制，尤其是动物中，这种类型的内源靶基因抑制很少见37。植物中，RISC介导的剪切之外的抑制程度并不清楚，但是看起来要比动物的要少。在所有植物靶基因检测中发现 RISC介导的剪切是主要方式，就像植物miRNAs与靶基因的严格互补一样。最早研究APETALA2（AP2）的抑制时发现miR172可能影响靶蛋白的积累而不是mRNA7, 38。最近研究显示RISC介导的mRNA剪切为miR172抑制AP2的主要方式，但是AP2的mRNA水平保持稳定，因为低水平的AP2蛋白触发了转录代偿的激活39。虽然如此，在RISC催化的剪切之外，一个重要的抑制过程发生在翻译水平。第3节 玉米microRNA的研究早期对于玉米miRNA的认识来源于不能（减少）合成miRNA的突变体的获得如CARPEL FACTORY和Hen1，它们表现出发育缺陷，因此早期认为miRNA的功能集中在参与植物的生长发育4,15。随后对玉米突变体的研究进一步深入，miR166的时空表达特性决定了其靶基因rld1的时空表达，rld1作为HD-zip III转录因子家族成员在叶片的发育过程中起重要作用。在玉米叶片发育过程中miR166随着叶片发育表现出进行性的扩张表达模式，而且在韧皮部汁液中也发现了miR166的存在，表明它可能作为一个可移动的信号从叶原基下方的信号中心向外运输传递40。有研究发现玉米mop1突变体和ts1突变体中SBP-box基因家族某些成员mRNA表达水平增加。进一步的小RNA Northern试验显示两个突变体中miR156的表达量均减少。尽管miR156的表达量和SBP-box基因的转录本之间存在负相关但并不绝对，因此作者推测miR156的减少给了其它未知因子促进SBP-box基因上调表达的机会41。玉米中花器官的性别决定于雄穗中心皮和雌穗中雄蕊的发育受到抑制。Tasselseed6（Ts6）和tasselseed4（ts4）突变体中雄穗的心皮部分发育导致多分枝出现，表明性别决定和分生组织分化经历了相同的代谢途径。ts4编码了miR172，并靶向调节APETALA2。三个突变体株系证据表明APETALA2基因之一的spikelet1 （ids1）是ts4的关键靶标并在小穗分化过程中起决定性作用。结果证明玉米花器官性别决定于花发育途径中某些基因的抑制表达42。利用基因枪法将APETALA2-like gene glossy15（gl 15）基因转入H99玉米自交系，试验表明miR172及其靶基因gl15共同调控了玉米的营养生长，其中过表达gl 15基因的玉米幼年期状态延长叶片增加而miR172通过下调gl 15的表达促进玉米向生殖生长转变43。也有研究针对某些miRNA进行组织部位表达模式分析，如对玉米穗部、幼苗以及籽粒的miR156、miR160、miR166、miR167及miR169表达模式分析表明它们具有不同的表达模式44，同时5RACE试验证明了玉米中miR156和miR159的靶基因。随着研究的发展，植物中发现了越来越多的miRNA，科学家们并不满足于玉米中miRNA的发现速度。于是通过大规模的同源比对和二级结构分析，发现了玉米中可能存在188个miRNA，它们隶属于 29个基因家族。通过靶基因预测认为这些miRNA的靶基因大部分属于转录因子，它们在玉米根、茎和叶的发育过程中起重要作用。推测这些miRNA还可能参与了细胞代谢如信号转导、胁迫响应、糖类及纤维素合成以及蛋白的泛素化降解等过程45。009年以后，随着玉米基因组测序的完成46和miRNA芯片技术以及测序技术的广泛应用miRNA的发现速度开始加快，多个课题组发表了玉米不同组织部位和胁迫条件下玉米miRNA表达谱测序文章47-49。通过对耐盐玉米自交系“NC286”和盐敏感自交系“黄早四”进行miRNA芯片分析发现有98个miRNA分属于27个miRNA基因家族，在盐胁迫下差异表达47。基于生物信息学的同源性和二级结构分析，在玉米中发现150个可信度极高的miRNA基因，分属于26个基因家族，同时使用测序技术鉴定了其中25个家族的miRNA基因在玉米的不同组织部位均有表达49。通过分析玉米根和茎的全基因组甲基化模式和mRNA以及miRNA转录组的关系发现miRNA的表达和甲基化之间存在相互关联。基因和转座子的甲基化模式截然不同，两个抑制性标记H3K27me3和DNA甲基化通常互相排斥。miRNA和内源干扰小RNA的表达存在组织特异性，暗示它们的生成部位也不相同。另外mop1的减少伴随着24nt siRNA和21nt miRNA以组织依赖的方式的减少表达48。这些研究表明miRNA在生物体内发挥着广泛的生理功能，并不只限于在植物的发育过程中起调控作用。第4节 植物miRNA的研究方法与技术路线4.1 植物miRNA的研究方法早期对于miRNA的研究主要基于突变体的获得，通过分离突变体的小片段RNA，然后进行测序，克隆miRNA的基因。随着大规模测序技术的成本不断降低和技术的进步，miRNA测序技术逐渐得到广泛的应用50-54。植物中miRNA通过剪切的方式将mRNA降解来抑制翻译过程，动物中主要是结合在3UTR区域进行抑制，也有部分是降解；所以降解组测序常出现在植物的研究中。通过获取这些降解后得到的小片段进行建库，上机测序，一是根据测得的结果推出其的互补序列55-57。另外还要借助生物信息学工具Target finder来做一个反向的预测，综合两方面结果，即可得到比较可信的靶基因结果58。另外5RACE也被广泛用于miRNA靶基因剪切位点的验证，许多miRNA的靶位点都是通过RACE得到证明59。Northern blot技术是进行 miRNA的重要手段，探针的种类主要包括放射性探针，LNA探针以及地高辛标记的探针。放射性探针的优点是灵敏度极高，背景低，噪点少。但是由于探针放射性对人体有一定影响，对于实验条件要求很高，因此放射性探针的应用受到一定限制。LNA是核酸类似物，它包含了 2-氧4碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，因而将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和优越的稳定性。LNA探针的化学结构决定了其与目标序列杂交后的稳定性，与普通的DNA荧光探针相比，每增加一个单体LNA分子将导致其熔点提升8。因此，可以通过调整LNA碱基在探针中的位置来调节最佳熔点（Tm）和杂交的特异性。但是LNA探针的价格非常高，这也限制了LNA探针的应用。地高辛标记的探针由于其价格较低，而且对人体和环境基本无害，因此得到广泛的应用。本文采用体外转录合成地高辛标记的 RNA探针，参照Kim的方法对提取的总RNA进行杂交60，获得较好的条带。4.2 技术路线第二章 自交系B73玉米材料的获取和处理第1节 自交系B73玉米材料的获取1.1 实验材料及仪器1.1.1 材料：自交系B73玉米种子51粒。1.1.2 试剂：蒸馏水、草炭土、蛭石、珍珠岩。1.1.3 仪器：锥形瓶、营养钵。1.2 玉米材料的种植玉米种子经蒸馏水浸泡24小时后种于营养钵中，基质为草炭土：蛭石：珍珠岩比例10:1:1。放入人工气候箱中生长到三叶一心期，温度25/20（day/night），相对湿度60/70%（day/night）植株，光周期16/8小时，光强度500mol m2s1。第2节 自交系B73玉米材料的处理2.1 实验材料及仪器2.1.1 材料：自交系B73玉米三叶一心期幼苗。2.1.2 试剂：液氮。2.1.3 仪器：恒温培养箱、小牛皮纸袋、剪刀、塑料袋、马克笔、不锈钢饭缸、镊子、冰箱。2.2玉米材料的处理2.2.1 玉米材料冷处理取9盆B73玉米三叶一心期幼苗放入恒温培养箱，温度设置为4，光照12小时，其余8盆幼苗室温放置12小时。2.2.2 玉米材料液氮处理（1）将小牛皮纸袋分批标记“12h冷处理”和“常温处理”，并剪去袋角备用。（2）将4冷处理幼苗取出，手动快速折下幼苗二、三叶，放入标记“12h冷处理”小牛皮纸袋并将纸袋没入液氮中。（3）将常温幼苗取出，操作同2。（4）-80保存液氮处理后的玉米材料。第三章 B73玉米幼苗叶片总RNA的提取第1节 RNA提取实验器材的除RNase灭菌处理1.1 实验试剂及仪器1.1.1 试剂：ddH2O、DEPC、70%酒精。1.1.2 仪器：1000L移液枪、1000L移液枪枪头、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、点火器、超净工作台、报纸、饭盒。1.2 实验方法RNA提取实验所使用的移液枪枪头、ddH2O等使用DEPC按照DEPC:ddH2O=1:1000的比例处理10h左右（或者过夜处理），处理器材放置于通风橱。之后高压蒸汽灭菌除去多余DEPC，高压蒸汽灭菌锅设置为12120min，并使用烘箱2801h烘干备用，RNA提取实验使用的移液枪、离心管、收集管、收集板、试剂盒等在实验前放入超净台紫外灯照射0.51h，同时向研钵中倒入少量70%酒精，点燃灭菌。第2节 B73玉米幼苗叶片总RNA的提取2.1 实验材料及仪器2.1.1 材料：上一章获得的玉米幼苗二三叶材料。2.2.2 试剂：超纯RNA提取试剂盒（康为世纪公司，cat：CW0597）、氯仿、70%乙醇、无水乙醇。2.2.3 仪器：1000L移液枪、200L移液枪、50L移液枪、不同型号移液枪枪头若干、超净工作台、研钵、离心管、收集板、医用塑胶手套、离心机。2.2 实验方法（1）分别取经过液氮处理的4度12h处理和常温处理的B73幼苗二、三叶各两袋，在液氮中充分研磨（研磨时不断补充液氮）加入1毫升 Buffer RLT，并使用移液枪反复吹打几次，使其混合均匀，室温放置5分钟；（2）向（1）中样品加入200微升氯仿，将管盖盖严并分别标记，上下晃动剧烈震荡20s，之后室温放置2分钟；（3）使用恒温离心机412,000rpm离心10分钟，将上层水相全部取出并移入新的离心管中，分别标记，之后向新的离心管中加入等体积70%乙醇，上下反复颠倒混匀之后，将所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中（如果溶液较多，分多次加入）。12,000rpm离心20秒，将收集管中的废液倒入废液缸，并将吸附柱重新放入收集管中备用；（4）向（3）中的吸附柱内加入700微升Buffer RW1，高速离心机12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管内备用；（5）向（4）中的吸附柱内加入500微升 Buffer RW2（使用前确认已经加入无水乙醇），高速离心机12,000rpm离心20秒，丢弃废液，将吸附柱重新放入收集管，重复这个步骤2次；（6）12,000rpm离心2分钟，将收集管中的废液丢弃，并将吸附柱至于室温约6分钟；（7）将（6）中的吸附柱放入一个新的无菌离心管中，向吸附柱中间部位缓慢加入40微升ddH2O，并室温放置1分钟，之后离心机12,000rpm离心1分钟，收集离心管中的RNA溶液，-80保存RNA。第3节 结果与分析RNA质量检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测，得到三条清晰条带，从上到下依次为28s，18s和5s RNA条带，可以看到RNA比较完整无降解片段。图3.1 总RNA电泳检测M：DL2000Marker注：B0：常温处理B73玉米幼苗B12：412h处理B73玉米幼苗第四章 miRNA靶基因预测及RACE验证第1节 靶基因预测根据已知miRNA和新预测的miRNA与玉米的基因组序列信息，用Target Finder软件进行靶基因预测。对MiR164、MiR171等miRNA的靶基因进行预测，靶基因登录号见表4.1表4.1 Target Finder预测部分miRNA靶基因信息表miRNA编号预测得到的靶基因IDzma-mi R164a-5p GRMZM2G114850;GRMZM2G139700;GRMZM2G063522;GRMZM2G393433zma-mi R166a-3pGRMZM2G109987;GRMZM2G042250;GRMZM2G135175;AC187157.4_FG005;GRMZM2G499154;GRMZM2G469551;GRMZM2G003509zma-mi R167e-5pGRMZM2G112769;GRMZM2G042623zma-mi R171d-3pGRMZM2G011947;GRMZM2G037792;GRMZM2G110579;GRMZM2G051785;GRMZM5G825321;GRMZM2G098800;GRMZM2G418899zma-mi R398a-5pGRMZM5G824689第2节 5RACE验证2.1 实验材料及仪器2.1.1 材料：上一章获取的总RNA样品。2.1.2 试剂：5-Full RACE Kit试剂盒（TaKaRa,takara code:D315）。2.1.3 仪器：1000L移液枪、200L移液枪、50L移液枪、不同规格移液枪枪头若干、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、PCR仪。2.2 实验方法2.2.1去磷酸化处理使用Alkaline Phosphatase（CIAP）对Total RNA中裸露的5磷酸基团进行去磷酸反应。（1）按下表所述配制实验所需反应液。Total RNA（1 g/L）RNase Inhibitor（40 U/L）10Alkaline Phosphatase Buffer（MgCl2 Free）Alkaline Phosphatase（Calf intestine）（16 U/L）RNase Free dH2O2 L1 L5 L0.6 Lup to 50 L（2）50反应1小时，然后加入20微升的3M CH3COONa（pH5.2），130微升的RNase Free dH2O后，充分混匀；（3）加入200 L的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1），反复晃动使其充分混匀，离心机13,000g室温离心5分钟，之后取出全部上层水相转移至新的离心管（Microtube）中；（4）向上述反应液加入20微升的氯仿，上下反复颠倒充分混匀，离心机13,000g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的离心管中，之后加入2微升的NA Carrier后反复颠倒均匀混合，再向反应液中加入200微升的异丙醇，并充分混匀反应液，冰上冷却10分钟。离心机13,000g 4离心20分钟，弃上清。（5）加入500 L的70%冷乙醇（RNase Free dH2O配制）漂洗，13,000g 4离心5分钟，弃上清后干燥。加入7 L的RNase Free dH2O溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。2.2.2 5RACE Adaptor的连接（1）按照下表配制溶液：CIAP/TAP-treated RNA 5RACE Adaptor（15 M）RNase Free dH2O5 L1 L4 L（2）恒温水浴锅65保温5分钟之后，将反应液移至冰上放置2分钟，之后按照下表加入试剂：RNase Inhibitor（40 U/L）5RNA Ligation Buffer40% PEG#6000T4 RNA Ligase（40 U/L）1 L8 L20 L1 L（3）16反应1小时。加入20L的3M CH3COONa（pH5.2），140 微升的RNase Free dH2O后，充分混匀。加入200 微升的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），反复颠倒充分混匀，离心机13,000g室温离心5分钟，取出全部上层水相转移到新的离心管中，并标记；（4）向（3）中的离心管中加入200微升的氯仿，反复颠倒充分混匀后离心机13,000g室温离心5分钟，取出全部上层水相转移至新的离心管中，并标记；（5）加入2 微升的NA Carrier后均匀混合。向离心管中加入200 微升的异丙醇，反复颠倒充分混匀后，移至冰上冷却10分钟。离心机13,000g 4离心20分钟，弃上清。加入500 L的70%冷乙醇（RNase Free dH2O配制）漂洗，13,000g 4离心5分钟，弃上清后干燥；（6）加入6 L的RNase Free dH2O溶解沉淀，得到Ligated RNA。2.2.3 反转录反应（1）按下表所述配制实验所需反应液：Ligated RNA Random 9 mers（50 M）5M-MLV Buffer dNTP（10 mM each）RNase Inhibitor（40 U/L）Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（200 U/L）6 L 0.5 L 2 L 1 L 0.25 L0.25 LTotal Volume 10 L（2）反转录反应条件如下：30 10 min42 1 hr70 15 min（3）反应后产物-20保存。2.2.4 Outer PCR反应（1）按下表所述配制Outer PCR反应液：上述1.2.3的反转录反应液 1cDNA Dilution Buffer II 10PCR Buffer II（Mg2+ Free）MgCl2（25 mM）rTaq（5 U/L）GSP1（10 M）5RACE Outer Primer（10 M）dH2O5L5L4L3L0.25L2L2L28.75LTotal Volume 50L（2）PCR反应条件如下：2.2.5 Inner PCR反应（1）按下表所述配制Inner PCR反应液：Outer PCR反应液 10PCR Buffer（Mg2 Free）MgCl2（25 mM）dNTP Mixture（2.5 mM each）rTaq （5 U/L）GSP2（10 M）5RACE Inner Primer（10 M）dH2O1L5L5L8L0.5L2L2L26.5LTotal Volume 50L（2）PCR反应条件如下：第3节 靶基因降解组测序3.1 电泳回收PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，回收使用天根公司琼脂糖凝胶回收试剂盒（cat: DP209）。采用琼脂糖凝胶电泳的方法，检测回收产物浓度。3.2 连接转化连接T载体使用TaKaRa公司的pMD18-T Vector Cloning Kit （cat：6011）。方法如下：（1）配制反应溶液组分体积pMD18-T Vector1LInsert DNA（回收产物）0.1pmoL0.3pmoLddH2Oup to 5L（2）加入5微升（等量）的Solution I。（3）16反应30分钟。（4）使用移液枪将全部溶液（10微升）放入100微升Top10感受态细胞中，并将加入反应溶液的感受态细胞冰中放置30分钟。（5）42加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。（6）加入890微升LB培养基，37振荡培养60分钟。（7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。（8）挑选白色菌落，将其全部加入1毫升的液体LB培养基（含Amp抗性）中振荡培养6小时。3.3 PCR进行菌液检测及测序采用PCR检测，取菌液1微升为模板，检测体系及反应过程、程序与5 RACE inner PCR相同。挑选PCR检测合格的菌液样品送华大基因公司进行测序。第4节 结果与分析4.1 两轮巢式PCR引物设计与产物检测4.1.1 Outer PCR引物设计与产物检测（1）引物设计正向引物（试剂盒提供）反向引物（GSP1）CATGGCTACATGCTGACAGCCTACCTTGAGGTAGGAAGCGGAGC（2）产物质量检测采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法，获得的产物较为均匀，长度均在150250bp之间，切合实验要求。图4.1 Outer PCR产物电泳检测注：B0：常温处理B73玉米苗提取的RNA反转录产物cDNA PCR泳道B12：412h处理B73玉米苗提取的RNA反转录产物cDNA PCR泳道4.1.2 Inner PCR（1）引物设计正向引物（试剂盒提供）反向引物（GSP2）CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATGGGAGCACGAGCGAGTGGTCAG（2）产物质量检测采用琼脂糖凝胶电泳检测的方法，选择出长度在150250bp之间的产物进行回收，低温保存备用。图4.2 Inner PCR产物电泳检测注：B0：常温处理B73玉米苗提取的RNA反转录产物cDNA PCR泳道B12：412h处理B73玉米苗提取的RNA反转录产物cDNA PCR泳道4.2 降解产物RACE验证采用RLM-RACE技术，进一步对miRNA的靶基因进行验证，将得到的PCR片段进行胶纯化回收，连接T载体，挑43个单菌落进行测序，通过将测序片段比对到玉米基因组上，研究成功发现了玉米中miR171n-3p 的剪切产物如下图（图 4.3）所示：图4.3 miR171n-3p降解位点示意图注：斜线前后的数字分别代表对应位点的菌落数和测序菌落总数结 论实验结果表明玉米的miR171n-3p靶向降解GRMZM2G037792-T01 （gras79）、GRMZM5G825321 （gras31）、GRMZM2G098800（gras80）、GRMZM2G110579 （gras10）、GRMZM2G317338 （scarecrow-like）等五个基因，这五个基因均为GRAS基因家族成员，测序结果证明剪切位点大多位于10-11位和11-12位之间。致 谢时间总是过得那么快，转眼间，大学四年的生活时光伴随着论文的完成即将结束。四年的大学生活，我不仅收获了丰厚的知识，更重要的是我遇到了让我一生难忘的良师益友，因为他们给了我在学习、生活、工作上无尽的帮助，也正因为他们让我的大学时光变得多姿多彩，成为一生中最美好的回忆，在这里请接受我最真挚的谢意。感谢我的导师李世鹏老师，有幸成为李老师的学生，从事玉米相关的研究工作是我倍感荣幸的事情。导师在我大学期间给予我严格的科研训练，奠定了我研究工作的全部基础。导师工作作风严谨，对事要求极高，工作忘我，是我一生的学习榜样。导师对我成长进步的每一步都关怀备至，值此毕业之际对李老师致以最深的谢意！感谢吉林大学植物科学学院四年中带给我无尽知识和传授我做人道理的每一位老师，谢谢你们四年来对我的辛勤栽培，为我倾注的心血！感谢实验室各位已经毕业和还在就读的师兄师姐，感谢你们在我实验过程中为我答疑解惑，不断鼓励我不畏失败、勇于尝试，感谢你们一直以来的支持以及在实验当中给予我的各种帮助。特别感谢薛英杰师兄在实验方面的帮助。感谢吉林大学植物科学学院各级领导对我的关心与帮助。特别感谢我的辅导员王庆老师，感谢您在生活中给予我的全部帮助，有您的陪伴，我的大学生活充满的生机活力！感谢我的父母，为了我你们付出了一切，让我在漫长的人生中使得心灵有了虔敬的归依。养育之恩，无以回报，在未来的日子里，我会更加努力的学习和工作，不辜负你们对我的期望。感谢2013级生物技术（植物）的兄弟姐妹们，谢谢你们陪伴我走过大学四年的美好时光，谢谢你们在我困难的时候带给我最温暖的关心。四年的友谊和回忆会伴随我一生，谢谢你们！最后，再次向吉林大学植物科学学院所有老师和同学表示感谢，谢谢你们！参考文献1Chinnusamy V,Zhu J,Zhu J K.Cold stress regulation of gene expression in plantsJ.Trends Plant Sci,2007,12（10）:444-451.2高懋芳,邱建军,刘三超,et al.我国低温冷冻害的发生规律分析J.中国生态农业学报, 2008, 16（5）:1167-1172.3马树庆,刘玉英,王琪.玉米低温冷害动态评估和预测方法J.应用生态学报,2006,17（10）: 1905-1910.4Reinhart B J,Weinstein E G,Rhoades M W,et al.MicroRNAs in plants J.Genes Dev,2002,16(13):1616-1626.5Guddeti S, Zhang D C, Li A L, et al. Molecular evolution of the rice mi R395 gene family J. Cell Res, 2005, 15(8): 631-638.6Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification of plant micro RNAs and their targets, including a stress-induced mi RNA J. Mol Cell, 2004, 14(6): 787-799.7Aukerman M J, Sakai H. Regulation of flowering time and floral organ identity by a Micro RNA and its APETALA2-like target genes J. Plant Cell, 2003, 15(11): 2730-2741.8Xie Z, Allen E, Fahlgren N, et al. Expression of Arabidopsis MIRNA genes J. Plant Physiol,2005, 138(4): 2145-2154.9Kurihara Y,Watanabe Y.Arabidopsis micro-RNA biogenesis through Dicer-like 1 protein functions J.Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(34):12753-12758.10Lee Y,Ahn C,Han J,et al.The nuclear RNase III Drosha initiates micro RNA processing J.Nature, 2003,425(6956):415-419.11Lim L P,Lau N C,Weinstein E G, et al. The micro RNAs of Caenorhabditi