中枢神经系统原发性淋巴瘤基因表达多态性分析及人源性B细胞淋巴瘤株对干预因素相关性的实验研究.ppt

1 中枢神经系统原发性淋巴瘤基因表达谱多态性分析 人源性B细胞淋巴瘤株建立及对干预因素反应的实验研究 神经外科王亚明2013 03 20 2 研究必要性 PCNSL占所有原发颅内肿瘤的3 5 流行病学资料显示 PCNSL的发病率近年来明显增高 在我科 每年立体定向活检病理证实病例约50例左右 已经留存约140例福尔马林固定标本 10余例液氮冻存标本 每月新增5例左右的新鲜标本 3 研究背景1 PCNSL是一种具有明显分子异质性的疾病 依照基因表达谱的特征 常为两种类型 具有正常生发中心B细胞基因表达特征的生发中心细胞型 germinalcenterB celllike GCB 表达CD10 bcl 6 Lmo 2 A myB JAW1等 致病机制涉及bcl 2癌基因 t14 18 染色体的移位 具有活化B细胞基因表达模式的活化细胞型 activatedB cell like ABC 或非生发中心型 non germinalcenterB celllike non GCB 表达MUM1 IRF 4 FOXP1 cyclinD2 Flip等 发病机制涉及NF KB的活化 叶酸代谢通路上的几个关键酶的遗传多态性 亚甲基四氢叶酸脱氢酶 MTHFD1 亚甲基四氢叶酸还原酶 MTHFR 胸苷酸合成酶 TYMS 会影响MTX的药代动力学和淋巴瘤的疗效目前对其基因突变研究少 可采用CDNA微列阵技术分析其基因表达多态性 4 研究背景2 淋巴瘤基因表达变异多 涉及多个癌基因和抑癌基因Survivin基因 凋亡抑制蛋白家族 免疫球蛋白V IgV 基因 体细胞突变 SHM 凋亡抑制基因 2 API2 淋巴瘤相关易位基因 MALT Bcl 2 Bcl 10 FOXP1 foekheadboxproteinP1 基因 Bcl 6 生发中心型 TCR基因 X box结合蛋白 1 XBP 1 信号通道的调节器 PTPRK基因 信号转导和转录激活因子6 STAT6 等 与化疗药物耐受相关的基因 GST 酸性谷胱甘肽 s 转移酶 编码基因 DNA拓扑异构酶topo 2编码基因 与放疗相关基因 XRCC1基因 DNA修复基因 x rayrepaircross complementinggroup 等 5 研究背景3 目前PCNSL治疗涉及多种化疗方案 选用化疗药物众多 CTX MTX chop方案 利妥昔单抗 洛莫司汀 甲基苄肼 替莫唑胺等 对药物反应存在个体差异 需要建立PCNSL淋巴瘤株来研究不同干预因素 包括放疗 对肿瘤的影响以及对致瘤机制进行单因素分析 目前没有人源性PCNSL的瘤株现有的商品性淋巴瘤株均来源于造血系统肿瘤 人源性Namalwa Ramos和Raji细胞系 JCRB公司 Toledo和Pfeiffer细胞系 ATCC公司 鼠源性B细胞淋巴瘤细胞株A20 本研究利用采集新鲜PCNSL标本在裸鼠上组织块接种后培养纯化出PCNSL瘤株对瘤株采取相关的干预性研究 6 课题研究的主要内容 一 PCNSL基因表达多态性检测 一 立体定向活检留取50例PCNSL肿瘤样 液氮冻存 入选标准 1 免疫力人群 有免疫缺陷的患者 如HIV感染等除外 2 有系统淋巴瘤存在着除外 3 所有标本行常规病理检测 依据标准2008版 包括HE染色及免疫组化分析 确认为PCNSL 7 课题研究的主要内容 一 二 提取DNA 1 从新鲜冷冻PCNSL肿瘤标本中 提取试验组DNA 2 留取健康男性外周血 利用淋巴细胞分离液 提取出淋巴细胞 利用免疫磁珠的方法 提取出B淋巴细胞 3 从健康男性的B淋巴细胞中 提取对照组DNA 8 课题研究的主要内容 一 三微阵 比较基因组杂交 aCGH 1 Agilent人类基因组比较基因组杂交微阵芯片 规格是Kit1 244k 2 按照芯片的试剂盒标准操作流程 实施试验样本与对照样本的杂交 3 按照Agilent单色微阵基因表达分析的实验方案实施 4 基因表达分析 利用AgilentCGH分析软件识别变异的基因组 确定候选基因 将候选基因输入到DAVID生物信息库 提取这些基因的特征以及功能 9 课题研究的主要内容 一 四 聚合酶链反应 RT PCR 提取肿瘤标本和正常人群B细胞得到的RNA DNA PCR扩增后分析其B细胞的克隆性 检测免疫球蛋白克隆性重排 各种候选基因的变异 基因重排和染色体异常 评价候选基因在不同类型PCNSL中的多态性表达 推断基因突变在成瘤机制中的作用 10 课题研究的主要内容 二 人源性PCNSL淋巴瘤细胞株的纯化培养立体定向活检无菌取材新鲜活体瘤组织 很少量标本 选取无坏死 无出血的部分用灭菌盐水洗净 修剪成1mm3小块 接种于BALB C的裸鼠皮下 形成0 5cm皮丘 待荷瘤长大后 取瘤 分离 剪碎后 做成细胞悬液 接种在10 胎牛血清的RPMI 1640培养液中进行原代培养 待生长足够量后 用磁珠单抗的进行分离纯化培养 并进行免疫组化标记鉴定 11 课题研究的主要内容 二 对培养的人源性PCNSL淋巴瘤细胞株进行干预性研究