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摘要 摘要 本课题以米糠为原料,通过酶法水解制备米糠分离蛋白,研究了提取米糠蛋白所需的 酶类,以及晟佳水解工艺,并对米糠蛋白的功能性质作初步的探讨。 试验所采用的原料为黑龙江五常稻米加工厂的米糠,对原料进行了测定,结果为蛋 白质:1 2 2 8 、脂肪:2 0 0 1 、纤维素:2 3 9 5 、淀粉:1 5 4 4 、水分:1 07 8 。 酶本身就是一种蛋白质,因此在提取米糠蛋白的过程中,要选择合适的方法灭酶,通 过试验,选择灭酶方式为:调p h = 4 ,5 0 ,3 0 m i n 。 关于米糠蛋白的等电点,各文献中没有详细报道,本试验采用测定不同p h 下米糠蛋 白浓度的方法,对米糠蛋白的等电点进行了测定,结果米糠蛋白的等电点为p h = 4 6 。 不同的酶水解米糠有不同的作用方式,对细胞破壁酶类和蛋白酶类进行选择,以蛋白 收率为指标,水解度为参考指标,比较各种酶水解米糠制蛋白的效果,认为纤维素酶和复 合蛋白酶水解效率高,因此选择这两种酶为水解用酶。 、( 分别对纤维素酶、复合蛋白酶、植酸酶的水解效果进行分析,在p h 、温度为各酶最 适条荆,时间、底物浓度相同的情况下,采用酶添加量的单因素试验,比较在最佳酶用量 的情况下的蛋向收率,结果蛋白收率不是很高。同时根据各种酶最佳用量,可确定配料试 验中各种酶的添加范围。 采用配料试验,将纤维素酶、复合蛋白酶、植酸酶的添加量范围折合成每种酶所占的 百分比,应用二因素二次旋转正交回归设计,在底物浓度1 5 、温度4 5 c 、p h = 5 5 、添加 量2 、时间2 小时的条件下,以蛋白收率为指标,水解度为参考指标,建立回归模型 y = 7 07 6 + i 5 8 x l + 2 4 0 x 2 - 0 9 x i 2 + 1 2 8 x l x 2 、 y :蛋白收率x :纤维素酶添加量x 2 :复合蛋白酶添加量j 通过检验证实回归模型与实际情况拟和较好。通过频数分析及变量变换,选择的各种 酶用量的百分比分别为纤维素酶为6 5 8 4 、蛋白酶为1 8 5 2 、植酸酶为1 5 6 4 。 采用正交试验和单因素试验,确定复合酶的反应条件为,温度:4 5 c 、时间2 小时、 底物浓度2 0 、酶添加量4 、p h = 5 5 。 测定米糠蛋白的乳化性、起泡性、粘度,并与大豆蛋白进行了比较,结果米糠蛋白的 乳化性优于大豆蛋白,而起泡性和粘度不及大豆蛋白。 关键词:米糠蛋白水解酶法功能性质 。,:,。:,! 童i ! 窑些奎兰三篓罂圭兰堡鎏兰 , s t u d i e so n e n z y m a t i c p r o c e s so f p r e p a r i n g r i c e b r a np r o t e i ni s o l a t e a b s t r a c t t h er e s e a r c hw a sc o n d u c t e do ne n z y m e h y d r o l y s i si np r e p a r i n gp r o t e i nf r o mr i c eb r a n s e v e r a le n z y m e sw e r es e l e c t e da n dh y d r o l y s i s t e c h n i q u ew a so p t i m i z e d t h e f u n c t i o n a l p r o p e r t i e so f r i c eb r a np r o t e i nw e r ep r i m a r y s t u d i e d t h em a t e r i a lw a s p r o d u c e db yw uc h a n g r i c em a n u f a c t o r y t h ec o m p o s i t i o no fr i c eb r a n w a st h a tp r o t e i n :1 2 2 8 、t h t :2 0 0 1 、e e i l u l o s e :2 3 9 5 、s t a r c h :1 5 4 4 、m o i s t u r e :1 0 7 8 e n z y m ei sak i n do fp r o t e i n ,s ot h es u i t a b l em e t h o dw a ss e l e c t e db yt e s t i n g , w h i c hc a n e f f e c t i v e l yi n a c t i v a t ee n z y m e i tw a s 西a tp h :4 0 、t e m p e r a t u r e :5 0 c 、t i m e :3 h a sp io fr i c eb r a np r o t e i nw a sn o tr e p o r t e db yr e f e r e n c e s i tw a sd e t e r m i n e db yt e s t i n g p r o t e i nc o n c e n t r a t i o na td i 髓r e n tp h t h e r e s u l to f f i c eb r a n p r o t e i np iw a sp h = 4 6 d i f f e r e n te n z y m eh a sd i f f e r e n th y d r o l y s i sp r o c e s s t h ek i n do fb r o k e nk e r n e l se n z y m e s a n dp r o t e a s e sw e r es e l e c t e di nt h ep r o c e s so f p r e p a r i n gr i c eb r a np r o t e i n c o m p a r i n gn i t r o g e n r e c l a i m a n d d e g r e e o f h y d r o 瞵i s ,c e l t u l a s e a n d p r o t a m e x w e r e f i t t e d c e l l u l a s e 、p r o t a m e x 、p h y t a s ew e r ed i f f e r e n t l yu s e dt oh y d r o l y s i sr i c eb r a nu n d e rt h e o p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp h ,t h et i m ea n ds u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw e r eu n d e rt h es a m e c o n d i t i o n ,s i n g l ef a c t o rw a sa d o p t e dt od e t e r m i n eo p t i m u me n z y m ec o n c e n t r a t i o no fe v e r ) e n z y m e ,a n dt h er e s u l ts h o w e dn i t r o g e nr e c l a i mo fs i n g l ee n z y m ew a sn o th i 曲u n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n a tt h es a m et i m e , i nt h ei n g r e d i e n tt e s t t h e r a n g eo fe v e r ye n z y m e c o n c e n t r a t i o nw a sd e t e r m i n e db ya b o v er e s u l t i nt h ei n g r e d i e n tt e s t , t h er a n g eo fs i n g l ee n z y m ec o n c e n t r a t i o nw a st r a n s f o r m e dt ot h e p e r c e n to f t o t a l 。t h e nr e v o l v i n g , o r t h o g o n a la n dt r o p i c a ld e s i g no ft h es e c o n dp o w e ro ft w o f a c t o r sw a sa d o p t e dt o s t u d yt h ep e r c e n to fe e l l u l a s e 、p r o t a m e xa n dp h y t a s e u n d e rt h e c o n d i t i o no fs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n 1 5 t e m p e r a t u r e4 5 ,p h = 5 。5 , t i m e2 ha n de n z y m e c o n c e n t r a t i o n2 。t h em o d e lw a se s t a b l i s h e d : y = 7 07 6 + 1 5 8 x 1 + 2 4 0 x 2 0 9 x i 2 + 1 2 8 x 1 x 2 y :n i t r o g e nr e c l a i mx l :c e l t u l a s ec o n c e n t r a t i o n x 2 :p r o t a m e xc o n c e n t r a t i o n f 1 e s tw a su s e dt ov e r i t yt h em o d e l 1 1 l er e s u l ti n d i c a t e dt h et e s t i n gg o o d n e s so fi t t h e r e s u l to f f r e q u e n c ya n a l y s i sa n dv a r i a b l et r a n s f o r ms h o w e dt h a tt h eo p t i m u me n z y m ep r o p o r t i o n w a st h a tc e l l u l a s e6 5 。8 4 ;p r o t a m e x1 8 + 5 2 :p h y m s e1 5 。“ t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n ds i n g l ef a c t o rt e s tw e r eu s e dt od e t e r m i n e dt h eo p t i m u m c o n d i t i o no f m u l t i p l ee r l z y m e , i tw a ss u b s w a t ec o n c e n t r a t i o n 2 0 ,t e m p e r a t u r e 4 5 c , p h = 5 5 ,t i m e 2 h ,e n z y m ec o n c e n t r a t i o n4 氟 e m u l s i o nc a p a e i t y , f o a m i n gc a p a c i t ya n dv i s c o s i t yo fr i c eb r a np r o t e i nw e r et e s t e da n d - 1 1 w e r ec o m p a r e dt os o y b e a n p r o t e i n t h er e s u l t sw e r et h a te m u l s i o nc a p a c i t yo f r i c eb r a np r o t e i n w a s h i g h e rt h a ns o y b e a np r o t e i n ,a n df o a m i n gc a p a c i t ya n dv i s c o s i t yw e r el o w e r t h a ni t p o s t g r a d u a t e :w a n gx u e f e im a j o r :f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r :a s s o c i a t ep r o f y ug u o p i n g k e y w o r d s :r i c eb r a np r o t e i n h y d r o l y s i se n z y m a t i cp r o c e s s f u n c t i o n a lp r o p e r t i e s i i i 前言 1 前言 蛋白质是生命的基础,生命的本质是以蛋白质为中心不断的新陈代谢。合理营养是身 体健康的先决条件,而在诸多营养成分中以蛋白质最为重要。随着技术的改进和研究的深 入,人们对蛋白质的提取以及功能性质已有充分认识。我国米糠资源丰富,米糠蛋白营养 价值高。过去米糠仅作为饲料应用,造成极大的浪费,如能将米糠中的蛋白质和其他营养 成分提取出来,将会有可观的经济效益。近些年来采用酶法提取米糠蛋白在国内外已有所 兴起,这种方法反应条件温和,蛋白提取率高,对米糠蛋白营养价值破坏作用小,具有可 行性。在我国膳食结构由温饱型向营养型过渡的阶段,建立适应中国国情的科学合理的膳 食结构及发展优质蛋白质的生产,显得特别重要。 1 1 米糠 1 1 1 米糠资源 从地球上有人迹开始。稻米就成为人类主要的食物。其天赋的丰富营养哺育着人类世 世代代健康的成长和生存。我国的第一大粮食品种就是稻谷,其播种面积大、种植水平高、 品种多、产量高。总产量在1 8 亿2 亿吨左右,占全国粮食总产量的4 2 ,占世界稻谷 总产量的3 5 左右( 周雅平等,1 9 9 9 :徐红华,2 0 0 0 ) 。米糠是稻谷加工中最重要的一类 副产品,目前我国米糠资源粘拥有量在1 0 0 0 万吨左右,资源十分丰富,是一种量大面广 的可再生资源。联合国工业发展组织( u n i d d ) 把米糠称为一种未充分利用的原料( a n u n d e ru t i l i z e dr a wm a t e r i a l ) ( 陈正行等,2 0 0 2 ) 。 尽管我国米糠资源量居世界之首,但米糠的深度开发利用及相应的理论研究和高科技 产品的开发尚处于低水平,就我国的米糠利用而言,目前大部分用于饲料,只有不足1 0 左右的米糠用来制油或提取植酸钙、肌醇、谷维素等价值高的产品( 姚惠源,2 0 0 2 ) ,虽 取得了一定的经济效益,但与当前发达国家对米糠的综合利用深度和高新技术的应用差距 仍很大,并且从碾米工业上来看,虽然近2 0 年来引进了技术设备,加工水平有较大提高, 但资源的综合利用仍处于起步时期。目前,我国稻米加工业对稻谷资源的增值率仅为1 : 1 3 ( 刘军海,2 0 0 1 :王立,2 0 0 2 ) ,大大低于国际的先进水平。随着大米精加工技术的发 展,大米加工的副产品米糠的综合利用成了决定粮食工业持续稳定发展后劲的主要因 素之一。 我国加入w t o 后,要求我国的稻谷加工业,在整个生产体系上,尽快的提高技术含 量,兼顾环境和经济效益,充分利用副产资源,研发生产可广泛应用的各种新产品,更大 程度地提高全部产品的附加值。 1 1 2 米糠的营养价值 米糠的重量只占稻米重量的6 8 ,却含有6 4 的营养成分以及9 0 以上的人体 必需元素,除了含有丰富的蛋白质( 1 4 1 6 ) 、脂肪( 1 5 2 3 ) 、糖类、维生素、膳 食纤维( 吴莺,2 0 0 1 ;胡国华,2 0 0 2 ) 和矿物质等营养成分外,还含有生育酚、生育三稀 东北农业大学工学硕士学位论文 酚、脂多糖、二十八烷醇、a 硫辛酸、y 谷维醇( 唐传核,2 0 0 0 ;龚院生,2 0 0 1 ) 、角鲨 烯等多种天然抗氧化剂和生物活性物质,对人体健康和现代文明病的预防和治疗具有重要 意义( d o nr 等,1 9 9 9 ;朱文华等,2 0 0 0 ;顾华孝,2 0 0 1 ) 。因此,米糠是研究开发米糠 油、米糠保健食品及多种生物活性物质的宝贵资源,世界上称米糠为“天赐营养源”( 蔡 东联,2 0 0 0 :姚惠源,2 0 0 2 ) 。如能将其各组份分开利用,米糠将大幅增值,经济效益十 分显著。 1 2 米糠蛋白 1 2 1 米糠蛋白的组成 米糠中蛋白质的含量占1 2 1 6 ( 大米中为7 ) ( s a u n d e s ,1 9 9 0 ) 相当于禽蛋中的蛋 白质含量。本世纪初,o s b r o n 提出了按溶解特性对小麦蛋白质进行分类的系统( 连续提取 方法) ,此方法同样适用于其他谷物蛋白( 陈正行,2 0 0 2 ) 。按o s b r o n 的分类方法,米糠 蛋白可分为如下四类:清蛋白( a l b u m i n ) ,可溶于水的蛋白质。热凝,在化学组成上含色 氨酸较多:球蛋白( g l o b u l i n ) ,去除清蛋白,可溶于稀盐的蛋白质,一般动物性的球蛋白 加热凝固,又称优球蛋白,植物性的球蛋白加热不凝,又称拟球蛋白;醇溶蛋白( g l i a d i n ) , 去除清蛋白和球蛋白后,可溶于7 0 乙醇的蛋白质。这种蛋白质加热不凝。在组成上含脯 氨酸和酰胺较多,非极性的侧链远比极性侧链多,它们存在于植物种子中;谷蛋白 ( g l u t e n i n ) ,去除上述三种蛋白后,可溶于稀酸或稀碱的蛋白质,热凝,仅存在于植物种 子中。这四种蛋白质在米糠中的大致比例是:清蛋白为3 7 、球蛋白为3 6 、谷蛋白为 2 2 、醇溶蛋白为5 。对这四种蛋白质进行的生化研究表明,清蛋白和球蛋白为代谢活 性物质,在发芽早期可迅速启动进行生理作用,是由单链组成的低分子量蛋白质,其相对 分子量分别为1 0 2 0 0 k d a 和1 6 1 3 0 k d a 之间。醇溶蛋白和谷蛋白为贮藏蛋白,醇溶蛋 白是由一条单肽链通过分子内二硫键连接而成的,其相对分子量为7 1 2 6 k d a ,而后者 是由多肽链彼此通过二硫键连接而成的大分子组成,其相对分子量在1 9 9 0 k d a 之间, 更高可达上百万( jsh a m a d a ,1 9 9 7 ) 。 表1 - 1 主要谷物蛋白组成 t a b l e l 1c o m p o s i t i o n so f m a i nc e r e a lp r o t e i n 2 - 前言 从表1 - 1 中可以看出,与其他谷物相比,米糠中可溶性蛋白质含量较高,约占7 0 , 与大豆蛋白接近,即米糠可能具有与大豆蛋白相似的功能特性。 1 2 2 米糠蛋白的营养价值 蛋白质是由多种氨基酸构成的大分子化合物,成年人必需的氨基酸( 体内不能合成) 有8 种,婴幼儿有9 种。蛋白质营养价值的高低,主要取决于所含必需氨基酸种类是否齐 全,比例是否适宜( 符合人体需要) 。种食物中含蛋白质数量多,必需氨基酸种类齐全, 比例适宜,在人体内消化、吸收和利用率高,这种蛋白质的营养价值就高,相反,营养价 值就低( t a t s u y am o r i t a , 1 9 9 3 ;王宏新,2 0 0 2 ) 。 表1 - 2 几种谷物蛋白必需氨基酸组成( g l o o g 蛋白质) t a b l e - 2a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no f s e v e r a lc e r e a lp r o t e i n 米糠蛋白其必需氨基酸组成接近于人体需要量模式( 如表l 一2 ) ,尤其是赖氨酸、蛋 氨酸含量高于大米及其他谷物的含量( j u l i a n o ,1 9 8 5 ) ,这补偿了谷物蛋白中氨基酸不足 的缺陷,大大提高了米糠蛋白的营养价值,使其成为可与动物蛋白比拟的优质蛋白质( 刘 玮,2 0 0 0 ) 。米糠蛋白质功效比值为2 0 2 5 ,牛乳蛋白为2 5 ,它的营养价值可与鸡蛋蛋 白相媲美( 顾华孝,2 0 0 1 ) ,它的应用性功能,如乳化性、溶解性、稳定性等可与大豆分 离蛋白相媲美。因此米糠蛋白是理想的营养健康食品的蛋白质强化剂和功能性蛋白 ( t a t s u y a ,1 9 9 3 ;刘雄,2 0 0 1 ) 。 米糠蛋白的另一个突出豹特点是低过敏性,是已知谷物中过敏性最低的蛋白质( r a v i n 等,1 9 9 5 :mw a n g 等,1 9 9 9 ) 。近几年来,以婴幼儿为主的过敏患者激增,其中以食物 引起的过敏晟为突出。日本厚生省的研究报告显示,3 5 小儿和2 2 的成人都曾患过不同 程度的花粉症、哮喘、鼻炎等过敏疾患。米糠蛋白具有低过敏性的特点,目前,还未见儿 童对大米有过敏反应的报道。因此米粉是最常见的婴幼儿辅助食品。将从米糠中提取的蛋 白质作为低过敏性蛋白质原料用在婴幼儿食品中是可行的( 陈正行等,1 9 9 9 ) 。 1 2 3 米糠蛋白的提取方法 传统的米糠蛋白的提取方法是采用碱法提取( 张晖等,1 9 9 8 :王亚林等,2 0 0 2 ) 。由 于米糠蛋白含有较多的二硫键,以及与植酸、纤维素等聚集作用,米糠蛋白较难被普通溶 剂( 如盐、醇和弱酸等) 提取出来。p h 是影响米糠蛋白溶解度的最重要因素之一。米糠 蛋白的等电点为p h = 4 6 。低于4 ,米糠蛋白溶解度只有小幅上升。但在p h 值 7 时,其溶 解度可显著上升。高浓度的碱会水解米糠中的氢键、酰胺键、二硫键,从而释放出更多的 蛋白质,当p h 大于1 2 时,9 0 以上的米糠蛋白可溶出( 王立,2 0 0 2 ) 。早在1 9 6 6 年c a g a m p a n g e t a l ,就采用碱法从米糠中提取蛋白质。1 9 7 7 年,b e 乜c h a r ce t a l 、1 9 9 5 年g n a n a s a m b a n d a m 和h e t t i a r a c h c h y 采用同样的方法提取米糠蛋白( m w a n & 1 9 9 9 ) 。1 9 7 7 年b a r b e r 和d e b a r b e r 发现米糠蛋白较其它油料种子蛋白难提取,而且,要获得较理想的蛋白提取率,要在高碱 的条件下进行。1 9 8 5 年,j u l i a n o 研究表明不同的碱提取条件会产生不同的蛋白提取率。 碱法提取虽然简单易行。但在碱液浓度过高的情况下,不仅影响产品风味和色泽使蛋白提 取物的颜色深暗( 陈季旺,2 0 0 3 ) ,同时在碱性条件下会产生不利反应,并会改变蛋白质 营养特性( mw a n g 等,1 9 9 9 ) 。1 9 8 9o t t e r b w m 就曾报道过,在碱性条件下,蛋白质的半 胱氨酸和丝氨酸残基会转变成脱水的丙氨酸,与赖氨酸的e 一氨基酸结合形成赖丙氨酸 ( a n s h a r u l l a h ,1 9 9 7 ) 。在1 9 8 5 年c h e t = t e l 等曾报道赖一丙氨酸不但有毒而且还会引起营 养物质的损失,丧失营养价值。w o o d d a r d 和s a l u n k h e ( 1 9 7 3 ) 研究还发现这种物质对小 鼠的肾脏有破坏的作用。除此之外,高碱条件下还会产生以下不利反应:蛋白质变性和 水解。加速美拉德反应,产生黑褐色物质。提取物中非蛋白质含量增加,分离效果 降低( f r e d e d c kfs h i h ,1 9 9 7 ) 。 目前在工厂里,植物蛋白的生产工艺中一般要求在高温( 5 0 ) 条件下,应避免使 用过高的碱浓度( p h 9 5 ) ( b o e e v s k a m ,1 9 9 3 ;陈正行,2 0 0 0 ) 。基于以上原因,近些年 来用采用酶法提取蛋白的研究相当活跃( rs e n g u p t a ,1 9 9 6 魏众述,1 9 9 9 ) 。1 9 9 5 年, h a m a d a 采用碱性蛋白酶分离米糠蛋白,蛋白质提取率随着其水解度的增加而增加,但是, 蛋白质的功能和营养特性却随蛋白水解度增加而降低( 一般 5 的水解度为最佳) ,因此, 此方法没有很好的实效性。直到1 9 9 7 年,a n s h a r u l l a h 提出采用糖酶,破坏植物细胞壁来 改善植物蛋白的提取率( a n s h a r u l l a h 等。1 9 9 7 :f r e d e r i c k ,2 0 0 0 ) 。1 9 9 9 年,h e t t i a r a r a c h c h y 将此法应用于米糠中,采用半纤维素酶和植酸酶联合使用,提取米糠蛋白,蛋白收率可达 9 2 。国内对这方面的研究近几年有所兴起,王立、陈正行等( 2 0 0 2 ) 报道分别采用蛋白 酶、糖酶提取米糠蛋白其蛋白收率仅在6 0 左右,国内对采用两种或两种以上复合酶提 取米糠蛋白还未见详细报道( 王文高等,2 0 0 2 ) 。酶法提取米糠蛋白反应条件温和,对蛋 白质的破坏作用小,能更多的保留其营养价值( 王璋等,1 9 9 4 ;李汴生,1 9 9 7 :刘志强, 1 9 9 9 ) 。 1 2 4 酶法提取米糠蛋白的依据 相关资料研究表明,目前用于提取米糠蛋白的酶主要有三类:糖酶、蛋白酶、植酸酶 各种酶有其不同的作用方式和作用机理,下面进行阐述。 4 前言 1 2 4 1 糖酶 糖酶的作用方式是通过破碎植物细胞壁,使其中内溶物充分游离出来而达到提取蛋白 的目的( f r e d e r i c k 等,1 9 9 7 ;刘志强等。1 9 9 9 ) 。 ( 1 ) 植物细胞壁的组成( 颜季琼,1 9 9 9 ) 植物细胞壁分为三层,即胞间层、初生壁和次生壁,主要由纤维素、半纤维素、果胶 质、木质素等组成。胞间层主要为果胶质,把相连的细胞连成一个整体。初生壁是在细胞 生长时所形成的,由纤维素、半纤维素、果胶质和蛋白质组成。其中,纤维素和半纤维素 构成了细胞壁的分子骨架。纤维素是构成初生壁的基本结构物质,占初生壁物质的2 0 3 0 ,它是线性b 1 , 4 键连接的d - 葡聚糖。此外还可能有甘露糖残基。约1 0 0 个纤维素分 子聚集成束。叫微胶团,再由约2 0 个微胶团以长轴平行排列构成微纤丝,再由许多微纤 丝聚集成大纤丝,构成基础骨架。微纤丝的间隙充满着半纤维素和果胶质。半纤维素由葡 聚糖和和葡萄糖醛酸一阿拉伯木聚糖组成,它通过氢键连于纤维素的骨架上。分散的果胶 质是由鼠李糖聚半乳糖醛酸组成,通过中性多聚半乳糖醛酸,阿拉伯聚糖和半乳糖连接在 纤维索一半纤维素复合体上。次生壁则是指细胞近乎停止生长以后沉积在初生壁里面的部 分结构。次生壁是由纤维素、半纤维素、木质索和果胶组成。与初生壁相比,次生壁中纤 维含量增加,木质素沉积较多,果胶含量降低。 高等植物的初生壁含有各种蛋白质,其中多数为糖蛋白,例如伸展素( e x t e n s i n ) 是 细胞壁中重要结构蛋白,已有比较全面的研究。此外还含有富含甘氨酸的蛋白,富含苏氨 酸和羟脯氨酸的糖蛋白,富含组氨酸和羟脯氨酸的糖蛋白,富含羟脯氨酸重复单位的蛋白, 还有阿拉伯半乳聚糖蛋白,阿拉伯胶糖蛋白,富含含硫蛋白,瘤素和嵌合蛋白。这些蛋白 质镶嵌在植物细胞壁中,采用糖酶处理细胞壁组织,可以降解植物细胞壁的纤维素骨架以 及分解果胶质。使植物细胞壁崩溃,使植物细胞内有效成分游离,提高胞内物质的提取率。 ( 2 ) 细胞破壁酶 我们知道,酶是一种很好的生物催化剂,己在各个领域有广泛的应用。根据植物细胞 壁的组成特点,可以采用细胞破壁酶类( 糖酶) 对其进行水解( c a g a m p a n g g b ,1 9 9 6 ) 。 细胞破壁酶类主要含纤维素酶,半纤维素酶,果胶酶等,它们具有很强的降解纤维和崩溃 植物及种子细胞壁的功能,能够通过破碎细胞壁丽达到提取其中有益成分的目的( c h e nw p ,1 9 8 4 :余蜀宜,2 0 0 2 ) 。目前,对细胞破壁酶研究较多的是纤维素酶( r o b e r t s pj ,1 9 8 5 ) 。 纤维素酶并不是一种简单的酶,而是由若干种相互关联的酶组成的相当复杂的酶系 ( f r e d e r i c kfs h i h ,1 9 9 7 ) 。一般来说纤维索酶主要由三类组分构成:b 1 , 4 内切葡聚糖酶 ( e n d o 一1 ,4 b - g l u c a n a s e ,e c 3 2 1 4 ) ,又称c m 一纤维素酶,其底物为羧甲基纤维素( c m 纤维素) ,中间产物为一些水溶性的纤维寡聚糖,终产物则是葡萄糖和纤维二糖;纤维二 糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l 鹊e ,e c 3 2 1 9 1 ) 。此酶是从非还原端将其水解为纤维二糖:第三 种是b 一葡萄糖苷酶( b g l u c o s i d a s e ,e c 3 2 1 2 1 ) ,此酶水解纤维二糖和水溶性的纤维寡 聚糖形成葡萄糖。虽然它对纤维素无作用,由于它可以消除上述两种酶催化的反应终产物 对反应的抑制作用,从而大大促进反应进程,因此b 葡萄糖苷酶在纤维紊酶系中具有非 常重要的作用( 严岩,1 9 9 7 ) 。纤维素酶系统具有“协同作用”是它的一个显著特点。所 东北农业大学工学硕士学位论文 谓“协同作用”,是指几种酶的总和效能远远大于各单个酶作用效能之和。纤维素酶的作 用方式:首先由内切葡聚糖酶作用于微纤维的非结晶区,使其露出许多末端供外切型酶作 用。纤维二糖酶从非还原性末端依次分解,产生纤维二糖,然后,部分降解的纤维素进一 步由内切葡聚糖和纤维二糖酶协同作用,分解生成纤维二糖、三糖等低聚糖,最后由b 葡萄糖苷酶作用分解成葡萄糖。( 余蜀宜等,2 0 0 2 年) 研究表明,纤维素酶在浸泡大豆时 起到很好的降解大豆细胞壁的作用( 高红岩等,2 0 0 1 ) 。 1 2 4 2 蛋白酶 目前对蛋白酶的研究有很多,蛋白酶自身种类也很多,不同蛋白酶有不同的作用机理。 蛋白酶在水解蛋白的同时也会将与蛋白相连的其它物质水解掉,从而提高蛋白质的收率 ( 王立,2 0 0 2 ) 。利用各种酶制剂( 蛋白酶、糖酶、植酸酶等) 提取米糠蛋白的研究显示, 蛋白酶是提高米糠蛋白的有效手段。在p h = 9 ,4 5 c 作用条件下,水解度( d h ) 为1 0 时, 米糠蛋白的提取率达到9 2 ,与对照组相比,提取率可增加3 0 。经过蛋白酶部分水解的 米糠蛋白,其功能性质也发生了一些有利的变化,溶解性增加,乳化性和乳化稳定性也均 有提高( m a r i t at ,1 9 9 3 ;jsh a m a d a ,2 0 0 0 ) 适合于各种加工食品,特别是那些在酸 性条件下具有较高溶解性和乳化性的食品。 1 2 4 3 植酸酶 在米糠中存在植酸盐,含量( 干基) 9 5 1 1 。米糠中蛋白质分子与植酸阴离子结 合会引起结构上的改变,导致形成不溶性的蛋白质一植酸复合体。1 9 8 0 年,c h e r y a n 研究 发现,植酸酶水解植酸的磷酸盐残基,有利于增加蛋白的溶解性和提高蛋白的纯度。 h h o o h o h 图1 1 植酸分子结构 f i g u r e i - 1m o l e c u l ec o n s t i t u t i o no f p h y t i ca c i d 植酸是一种强酸,分子结构如图1 1 。具有很强的螯合能力,其6 个带负电的磷酸根 基团,除与金属阳离子结合外,还可与蛋白质分子进行有效的络合,从而降低动物对蛋白 质分子的消化率( g i f f o r d 等,1 9 9 0 ;p a l l a u f 等,1 9 9 5 ;毕士峰等,2 0 0 0 ) ,当p h 低于蛋 - 6 - 前言 白质的等电点时,蛋白质带正电荷。由于强烈的静电作用,易与带负电的植酸形成不溶性 复合物。蛋白质上带正电荷的基团很可能是赖氨酸的e - 氨基、精氨酸和组氨酸的胍基。 当p h 高于蛋白质等电点时,蛋白质的游离羧基和组氨酸上未质子化的咪唑基带负电荷, 此时蛋白质则以多价阳离子如:c i “、m 9 2 + 、z n 2 + 等为桥,与植酸形成三元复合物。植酸 蛋白二元或三元复合物的形成,会改变蛋白质的结构,降低其溶解度,并进而影响其消化 率和功能( 宋金彩等,2 0 0 0 ) 。从理论上讲,植酸酶水解植酸释放出磷酸的同时,可将与 植酸络合的蛋白质释放出来,便于消化道分泌的各种蛋白酶作用,从而使其消化率得到提 高。另外植酸可与内源性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等络合,降低酶活性。从而导致蛋白质 等消化率降低。宋金彩( 2 0 0 0 年) 研究表明,向酪蛋白、豆粕、米糠中加入植酸会降低其 蛋白的溶解率若植酸在加入到蛋白质溶液前,先与过量植酸酶水浴,则可阻止络合物沉 淀的产生,其米糠蛋白质溶解率提高到5 7 ,远高于未水解时的溶解率。 1 3 蛋白质的功能性质及影响因素 蛋白质是食品的重要成分,它不但提高食品的营养价值,而且对食品的质量起着关键 的作用,这是因为各种蛋白质都有不同的功能性质。研究各种天然蛋白质的功能性质,估 测其食品加工的价值,如何在食品工业中最有效的利用各种蛋白质原料,这些都与蛋白质 的功能性质有关( 谢良等,2 0 0 0 ) 。蛋白质的功能性质通常是指蛋白质在食品加工、贮藏 和销售过程中发生作用的那些物理和化学性质。食品蛋白质的功能性质见表i - 3 ( 华欲飞, 1 9 9 9 ;孙华,2 0 0 0 ;邢小鹏,2 0 0 0 ) 。因此。研究米糠蛋白的功能性质对米糠蛋白在食品 中的应用起着重要的作用。 表l - 3 食品蛋白质的功能性质 t a b l e l - 3f u n c t i o nc h a r a c t e r i s t i c so f f o o dp r o t e i n s 蛋白质的功能性质除了受蛋白质本身影响外,还受到蛋白中其它成分和环境因素的 影响,蛋白质的功能性质正是通过在这些因素的作用下表现出的物理和化学性质而反映出 来( 韩丽华,1 9 9 8 ;王文高,2 0 0 2 ) ,其影响因素见表1 - 4 。 表l - 4 影响蛋白质理化特性和环境因素 ! ! ! ! ! ! :! ! 型! 堡垒堡! 堕竖呈巴堡垫:! ! 竺! ! ! ! ! 堂型! ! 内在因素环境因素加工处理 了解蛋白质的影响因素后,对蛋白质的提取应避免激烈的反应条件,尽量减少对蛋白 质的破坏作用,更多的保留蛋白质天然的功能特性,这在食品加工中显得尤为重要。因此, 在米糠蛋白质提取过程中,应根据米糠蛋白的组成特点分别采用盐、醇、碱溶解水解后的 米糠残渣,这样一方面可以更大程度的回收蛋白,另一方面又可最低限度的减少对米糠蛋 白的破坏。 1 4 米糠蛋白的应用 米糠蛋白以他柔和的风味,清爽的色泽、不含任何抗营养因子、良好消化性和营养性、 低过敏性,引导众多食品科研工作者研究和开发以米糠蛋白为基料的增值产品,归纳起来 主要有以下几个利用途径: ( 1 ) 利用其低过敏性,高营养性、良好消化性生产婴儿配方食品。我国2 0 0 0 多万的 婴幼儿的食物中的优质蛋白质不足问题尤为严重。目前我国婴幼儿食品发展较快,市售的 母乳化奶粉或其他一些具有生理活性的婴儿配方奶粉,其主要途径是添加免疫球蛋白和乳 铁蛋白,以期望达到提高婴儿免疫的目的然而,绝大多数婴儿食品忽略了一些敏感体质 婴儿由于摄入某种蛋白而引起的过敏现象有专家指出,在给过敏性体质的婴儿喂以蛋白 食品时要特别注意,如果给婴儿吃其它异种蛋白,一定要选择合适的蛋白食品。( 陈正行 等,2 0 0 2 ) 。因此,开发和利用低过敏性蛋白作为婴儿食品的蛋白源具有十分重要的意义。 ( 2 ) 米糠蛋白不仅可作为营养强化剂,它在食品中的应用还可使功能特性得到改善, 如结合水或脂肪的能力、乳化性、发泡性、胶凝性等。具体应用有:用于液体或半固体物 料中的稳定化和增稠作用( 姚惠源,2 0 0 2 ) ;用在蛋糕糊和糖霜中的发泡作用:用在肉制 - 8 前言 品中的乳化、增稠及粘结作用。作为蛋白质类添加剂,因为是副产品的综合利用,米糠蛋 白的一个优势在于它的价格较低,将它添加到肉、乳制品中可降低产品的成本。日本化妆 品行业利用米糠蛋白的衍生物( 乙酰化多肽钾盐) 作为化妆品的原料,它有很好的表面活 性,对皮肤的刺激性小,对毛发的再生和亮泽有显著效果( 陈正行,2 0 0 2 。 ( 3 ) 酶解清蛋白制成功能性多肽。日本有研究报道,以大米中的清蛋白为原料,通 过酶解作用生成有增强免疫功能的活性肽( 八肤) 。但米糠蛋白中清蛋白的含量是米蛋白 的6 7 倍,若能利用米糠中的清蛋白开发这种活性肽。将更为经济可行( 陈正行,2 0 0 2 ) 。 ( 4 ) 酶水解米糠蛋白分离出具有谷氨酸钠的风味肽。长期以来谷氨酸及其钠盐作为 调味剂在食品中广为使用,但过量使用有一定毒副作用( p r o c t o r a ,1 9 9 4 ) 。米糠蛋白中含 有丰富的谷安酰胺和天门冬酰胺,通过蛋白酶的水解作用和脱酰胺作用,使7 6 的肽键水 解,生产谷氨酸类的风味增强剂,开发出将取代可能对人体有害的味精的风味增强剂。 1 5 课题研究的内容和意义 在人类近1 0 0 万年的进化和繁衍过程中。几乎所有能够得到的动、植物都被食用过。 但随着人类的发展,从大约一万年以前开始驯化植物,至今用作食品原料的植物( 农作物) 主要有小麦、大麦、稻谷、玉米、高粱、黄豆、花生、土豆、甘薯和各种常见果、蔬等( 李 正明等。1 9 9 8 ) 。蛋白质中动物性蛋白质主要来源于肉、鱼、奶、蛋等食物,这些食物一 方面价格较贵,另一方面由于动物肉,含有易导致心血管疾病的饱和脂肪酸和胆固醇,使 摄入量受到限制。而植物性蛋白质,是一种具有良好机能特性的食品原料,而且这些蛋白 质的组织具有类似肉的特性。由于植物蛋白具有保水性、乳化性、弹性和粘结性等特性, 既可以单独制成食品,也可以与蔬菜或肉类等配制成多种多样的食品,同时用作食品具有 安全可靠性、且微生物含量极少( 裘爱泳,1 9 9 9 ) 。 近年来,人们在研究蛋白质功能性取得_ 定进展的同时,着力开发新的质优量广的蛋 白质资源。谷物具有成本低廉、气味芳香、易于烹饪、富含矿物质和维生素等优点,引起 世界各国的广泛关注。早在十年前,发达国家对以植物为原料来生产价格合理的高质量产 品产生了兴趣,并认为谷物蛋白质是目前最丰富最低廉的蛋白资源。为了蛋白质供应充足, 许多人对谷物加工进行了研究,以更大程度的利用谷物,米糠就是其中的一种。 尽管人们早就认识到米糠的营养和药用价值,但到目前为止,人们尚未很有效利用米 糠蛋白。原因可能如下:( 1 ) 米糠中的蛋白质是一个复合的体系,米糠中舍有白蛋白、 球蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白。( 2 ) 米糠蛋白的溶解性较差,可能是由于相互间作用很 强的二硫键而使其极易发生沉淀。( 3 ) 米糠中的植酸和纤维素含量较商,这两种物质与蛋 白质紧密结合,使的蛋白质不易溶出来( 王立,2 0 0 2 ) 米糠蛋白的品质优良,在国内却未被开发利用米糠蛋白的营养价值虽然较高,但在 天然状态下,由于它与米糠中植酸、纤维素等的结合会影响其消化与吸收因此,为了提 高米糠蛋白的利用价值,宜将其从天然体系中提取出来本课题研究的内容主要有:( 1 ) 选择不同的酶提取米糠蛋白,比较提取效果( 2 ) 采用纤维索酶、蛋白酶、植酸酶三中酶 进行复配来提取米糠蛋白,确定最佳的提取工艺条件,( 3 ) 对米糠蛋白的某些功能特性进 行了研究。 9 2 材料与方法 2 i 试验材料 2 1 1 原料 米糠:黑龙江省五常稻米加工厂提供 2 1 2 酶制剂 纤维素酶:天津利华酶制剂有限公司 复合酶( 粉剂) :宁夏和氏壁生物技术有限公司 复合酶( 水剂) :宁夏和氏壁生物技术有限公司 v i s c o z y m e :丹麦诺维信公司 风味酶( f l a v o 哪e ) :丹麦诺维信公司 碱性蛋白酶( a l c a l a s e ) :丹麦诺维信公司 中性蛋白酶( n e t m a s e ) :丹麦诺维信公司 复合蛋白酶( p r o t a m e x ) :丹麦诺维信公司 植酸酶:昆宝公司 2 1 3 主要试剂 正己烷( 分析纯)乙醇( 分析纯)乙醚( 分析纯) 氢氧化钠( 分析纯)硼酸( 分析纯)盐酸( 分析纯) 浓硫酸( 分析纯)硫酸铜( 分析纯)硫酸钾( 分析纯) 无水碳酸钠( 分析纯)干酪素( 分析纯)磷酸二氢钠( 分析纯) 磷酸氢二钾( 分析纯)葡萄糖( 分析纯)3 ,5 - 二硝基水杨酸( 分析纯) 大豆色拉油( 食品级)大豆蛋白( 哈高科) 2 1 4 仪器和设备 p h s 3 c 型精密p h 计 上海雷磁仪器厂 h h s 2 1 - 4 电热恒温水浴锅: 上海医疗器械五厂 l d 4 - 2 离心机北京医疗仪器修理厂 j j 1 电动搅拌器常州国华电器有限公司 n d j - 7 9 旋转式粘度计同济大学机电厂 电子分析天平梅特勒一托利多仪器上海有限公司 1 0 - 2 0 2 型电热恒温干燥箱 7 2 1 分光光度计 l n k 8
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