单增李斯特菌PFGE快速分子分型实验室标准操作程序.docx

单增李斯特菌PFGE分型实验室标准操作程序生物安全警示：目前李斯特菌感染剂量尚不确定，取决于宿主的易感性。高风险感染群体为孕妇、婴儿、免疫力低下病人和老人。所以，接触李斯特菌的实验人员必须意识到潜在的风险并且注意相关的建议。Day 0受试培养物单菌落划线于脑心浸液平板，于37培养14-18 h。建议利用螺口管保存菌种一支，并且用同一接种环划线平板。确保需要时可以对同一培养物进行试验。Day 11. 开启水浴摇床（54-55）、水浴箱（55-60）和分光光度计。2. 准备TE buffer（10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0），配方如下：10 ml 1 M Tris，pH 8.0，2 mL 0.5 M EDTA，pH 8.0，稀释于1000 mL无菌超纯水（临床实验室试剂用水）。注意：TE buffer用于SeaKem 琼脂糖胶栓制备、悬浮细胞和洗涤裂解的PFGE胶栓。3. 准备溶菌酶（sigma L7651）母液（20 mg/mL），配方如下：a. 称量100 mg溶菌酶（器皿放置于冰上保持低温）b. 加入5 mL TE buffer，涡旋混合。c. 分装（250 L）于eppendorf管中，冷冻备用。4. TE buffer (10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0)制备1% SeaKem 金琼脂糖+1% SDS，配方如下：a. 20% SDS储液置于55-60水浴箱预热；b. 称取0.25 g SeaKem 金琼脂糖，加入25 ml TE buffer，温和混匀，微波加热至完全溶解；c. 加入2.5 ml 10% SDS，混匀，置于55-60水浴箱中备用。5. 将培养物编号标记于Falcon2054管，吸取2 mL TE buffer于管中，用灭菌棉签或接种环刮去培养物，轻轻转动接种环（棉签）将培养物悬浮于TE buffer中，尽量避免产生气泡。注意：细胞悬浮液体积大小取决于细胞浊度测定仪的使用体积。6. 将细胞调至以下浓度：a. 分光光度计法：OD610nm=1.0（0.8-1.0）；b. Dade Microscan 浊度仪：0.40-0.45（Falcon2054管测定） 0.58-0.63（Folcon2057管测定）c. bioMerieux Vitek 色度计: 17-18% 透过率（Falcon2054管测定）注意：6a、6b、6c的细胞浓度值在CDC试验中得到满意的实验结果，如果利用不同的仪器或者试管，可以根据自己实验室优化细胞浓度已得到最优试验结果。胶块制备将培养物编号标记于PFGE胶栓进行胶块制备。注意1：未用完琼脂糖可以保存于室温，重复利用12次。中低档微波10-15s，混匀，直到琼脂糖完全溶解。注意2：蛋白酶K溶液（20 mg/mL）可以商业购得，也可以利用无菌超纯水溶解蛋白酶K粉末制得。为了得到最好的实验结果，分装（300-500 L）储存于-20备用。使用前先冻融并放置冰上保持低温状态。如果蛋白酶K储液由粉末制得，丢弃剩余的蛋白酶K。1. 移取400 L细胞适当浓度的悬浮液至1.5 mL离心管中。2. 加入20 L冻融的溶菌酶（20 mg/mL）储液，温和混合。将离心管置于55-60水浴箱中水浴10-20 min。丢弃剩余的溶菌酶。3. 加入20 L蛋白酶K（20 mg/mL），用移液枪温和混匀。4. 加入400 L溶解的1% SeaKem 金琼脂糖于400 L细胞悬浮液中，来回上下颠倒几次温和混匀。在55-60水浴箱中水浴使得金琼脂糖胶保持溶解状态。5. 迅速将琼脂糖胶注入胶栓中，避免产生气泡。每个样品制备两个胶栓胶块作为平行实验。室温下放置10-15 min（4下5 min）至金琼脂糖凝固。注意：利用一次性胶栓模块制备胶块，200 L细胞悬浮液，10L溶菌酶（20 mg/mL）10 L蛋白酶K（20 mg/mL），200 L金琼脂糖可以制备4块胶块。注意：细胞悬浮液和胶块制备要在短时间内进行，防止细胞提前裂解。如果制备大批量的样品，推荐一次处理10个样品。当第一批样品处于细胞裂解温育阶段，即可进行下一批样品制备，直到样品制备完毕，增加裂解时间对细胞裂解效果影响不大。细胞胶块内裂解注意：同一菌株的两个胶块（重复利用胶栓制备）或者3-4块胶块（一次性胶栓制备）可以在同一50 mL离心管中进行裂解。1. 将培养物编号标记于50 mL螺口离心管中。2. 制备细胞裂解液（50 mM Tris:50 mM EDTA, pH 8.0+1% Sarcosyl），配方如下：25 mL 1 M Tris, pH 8.050 mL 0.5 M EDTA, pH 8.050 mL 10% sarcosyl (N-laurolsarcosine, Sodium salt)稀释于500 mL 无菌超纯水中。3. 计算所需细胞裂解/蛋白酶K缓冲液体积：a. 每个50 mL离心管需要5 mL 细胞裂解液（50 mM Tris:50 mM EDTA, pH 8.0+1% Sarcosyl）。b. 每个50 mL离心管需要25 L（20 mg/mL）蛋白酶K储液。c. 将适当比例的细胞裂解液和蛋白酶K储液混合均匀。注意：裂解液中蛋白酶K的终浓度为0.1 mg/mL，不同于细胞悬浮液中终浓度（0.5 mg/mL）。4. 往50 mL离心管中加入5 mL蛋白酶K /细胞裂解液。5. 利用刀片小心切去胶栓中多余的琼脂糖胶，小心将胶块移至相应的离心管中。注意：多余胶块、模块、刀片受到污染则丢弃或适当灭菌。6. 重复利用胶栓处理，将胶栓、刀片等于70%乙醇中浸泡15min灭菌处理，冲洗干净。丢弃一次性模具，如果重复利用则用10%漂白剂处理30-60 min，冲洗干净。7. 将50 mL离心管置于54-55恒温摇床中，150-175 rpm处理2 h。如果水浴处理，确保水浴液面高于管内裂解液液面。8. 用10-15 mL 54-55预热无菌超纯水洗涤胶块。琼脂糖胶块洗涤注意：大部分实验室的胶块在54-55下都可以保持足够稳定。但是，如果你的胶块边缘出现缺口或者破裂，以下步骤可以在温度为50进行。1 从水浴箱中取出离心管，小心倾去裂解液于回收容器中，胶块留在离心管内。注意：必须完全倾去离心管中的裂解液，剩余少量裂解液可以用滤纸吸干。2 加入54-55预热的10-15 mL无菌超纯水，54-55水浴摇床中温育10-15 min。3 倾去洗涤液，重复第二步。a54-55预热足够的TE buffer，用于洗涤胶块4次，每次10-15 mL。4 倾去洗涤液，加入10-15 mL54-55预热的TE buffer，54-55水浴10-15min，重复四次。5 倾去洗涤液，加入5-10 mL无菌TE buffer，进行限制酶酶切步骤或者加入TE buffer 于4保存。注意：如果酶切步骤在同一天进行，完成以下酶切步骤的1-3步。DNA胶内酶切注意：整块胶块或者切成小块都可以进行酶切。建议切成小片进行胶内酶切，更少的酶获得更好的酶切效果。多余的胶块可以用于如Asc酶切。1. 将培养物编号标记于1.5 mL离心管中。a 可选预酶切温育步骤：制备酶切缓冲液如下：试剂L/胶块L/10小胶块L/15小胶块无菌超纯水180 L1800 L2700 L酶切缓冲液20 L200 L300 L总体积200 L2000 L3000 Lb 加入200 L酶切缓冲液于离心管中。c 小心将胶块移至无菌平板或者载玻片上，用刀片切成2.0-2.5 mm宽的胶片，然后移至离心管中，并确保胶片在酶切缓冲液中。多余的胶块放置5 mL TE buffer中，4保藏。注意：胶片形状和大小取决于梳子孔的大小。PulseNet推荐10 mm宽的梳子，在计算机分析过程中得出的结果比5.5 mm宽的梳子更为准确。所切胶片的完整情况、数量取决于操作员的熟练程度。d. Marker H9812的胶块切去3-4块2.0 mm宽的小胶块，移至稀释缓冲液中，并确保胶片在酶切缓冲液中。多余的胶块放置5 mL TE buffer中，4保藏。e. 将胶块于25（Apa ）或37（Asc ）温育5-10min或室温下温育10-15min。f. 用移液枪将缓冲液移去，注意不要损坏小胶片或在吸取缓冲液过程中带走胶片。2. 按照产品说明书准备酶切缓冲液，根据下面表格加入相应浓度的限制性内切酶Apa（50 U/样品）或Asc（40 U/样品）。在离心管中充分混匀。试剂L/胶块L/10胶块L/15胶块无菌超纯水173L1730 L2595 L限制酶切缓冲液20 L200 L300 LBSA2 L20 L30 LApa（10 U/L）5 L50 L75 L总体积200 L2000 L3000 L试剂L/胶块L/10胶块L/15胶块无菌超纯水174L1740 L2610 L限制酶切缓冲液20 L200 L300 LBSA2 L20 L30 LAsc（10 U/L）4 L40 L60 L总体积200 L2000 L3000 L注意：限制性内切酶始终置于冰上或者绝缘保温盒（-20）中。3. 每支离心管加入200 L限制性内切酶缓冲液，温和混匀，确保胶块处于缓冲液中。在相应的最适酶切温度下水浴酶切2-3 h。a Apa最适酶切温度为25。b Asc最适酶切温度为37。制备SKG琼脂糖胶1. 确保水温处于55-60。2. 根据下表准备足够的0.5TBE缓冲液。5TBE试剂体积（mL）5TBE200210220230240250试剂级纯水1800189019802070216022500.5TBE20002100220023002400250010TBE 试剂体积（mL）5TBE100105110115120125试剂级纯水1900199520902185228023750.5TBE2000210022002300240025003. 用0.5TBE制备1%金琼脂糖凝胶，步骤如下：a 称取适量SKG于三角瓶中；b 加入相应体积的0.5TBE，摇匀，微波加热直至完全溶解；c 将溶解的SKG置于55-60水浴备用。4. 2-5 mL的55-60SKG用于封闭注入的酶切胶块。未用完的SKG置于室温下保存，可以重复利用。5. 制备SKG，在水平桌面上倾注溶解的SKG，梳子插入深度大约为2 mm。6. 55-60的SKG水浴15-20min，倾注于制胶模块中，避免产生气泡。7. 在电泳槽中注入2.2 L0.5TBE，盖上顶盖。8. 在跑胶前30 min开启冷却槽（14），供电开关和循环水泵（1 L/min）预冷电泳缓冲液。9. 从37水浴中移出酶切胶块，弃去酶切缓冲液并加入200 L 0.5TBE，室温下温育5 min。10. 待SKG完全凝固之后拔出梳子，将相应的酶切后胶块注入相应的梳子孔中，轻轻将胶块推至梳子孔底部并且置于梳子孔的前端，避免产生气泡。a 将marker H9812胶块置于1、5、10梳子孔（10孔梳子）中或者1、5、10、15（15孔梳子）梳子孔中。b 其他梳子孔注入样品胶块。注意：注入胶块费时费力，实验人员需要提高其注入胶块的水平以确保电泳条带单一且尖锐。11. 用预热的1% SKG封闭梳子孔，凝固3-5 min。除去侧旁多余的琼脂糖凝胶。将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，盖上顶盖。电泳程序1a. 在CHEF Mapper中选择如下电泳程序进行电泳 (Asc或Apa酶切) ：Auto algorithm49 kb-low MW450 kb-high MWSelect default values except where noted by pressing “enter”.Initial switch time = 4.0 sFinal switch time = 40.0 sChange run time to 18-19 h.1b. 选择CHEF-DR 程序：Initial switch time: 4.0 sFinal switch time: 40.0 sVoltage: 6 VIncluded angle: 120Run time: 18-19 h1c. 选择CHEF-DR程序：Initial switch time: 4.0 sFinal switch time: 40.0 sStart ratio: 1.0（if applicable）Voltage: 200 VRun time: 18-19 h注意：推荐的电泳时间仅基于CDC的仪器和试剂，不一定适用于所有实验室。可以根据H9812最低分子量迁移至离底部1.0-1.5 cm确定最佳电泳时间。注意：留意最初电泳电流大小。起初电流处于110-170 mA。如果电流大小超出范围表示0.5TBE缓冲液配制出现问题，重新配制电泳缓冲液。Day 2PFGE琼脂糖凝胶染色及图像保存1. 电泳完毕，取出琼脂糖凝胶，配制溴化乙锭染色液。40 L（10 mg/mL）溴化乙锭加入400 mL试剂级超纯水中稀释（14 cm24 cm容器），在有盖容器中染色20-30min。注意：溴化乙锭具有毒性并且致癌。溴化乙锭储液可以商业购得。溴化乙锭稀释液保存于棕色瓶中可以反复使用6-8次。CDC不建议直接将溴化乙锭倒入下水道，建议利用活性炭、焦炭或者茶包吸附溴化乙锭后再倒入下水道。2. 用500 mL超纯水脱色60-90 min，每20 min换超纯水一次；将琼脂糖凝胶置于GE CCD capture 仪器中采集图像。确保图像是整胶图像并且以.tif形式保存，便于后续分析。确保图像聚焦良好且不要曝光过度。3. 如果电泳槽在短期几天不在使用的话，倾倒电泳缓冲液并以2 L超纯水冲洗电泳槽。开启循环水泵清洗循环系统。如果在24-28 h实验操作程序中没有获得良好的实验结果请注意：1.