（法医学专业论文）大鼠死后看家基因mrna降解规律与晚期死亡时间推断的相关性研究.pdf

山西医科大学博士学位论文 大鼠死后看家基因m r n a 降解规律与晚期 死亡时间推断的相关性研究 摘要 目的：本研究从基因库中筛选出两种稳定表达于不同个体与组织细胞中的看家基因 g a p d h 和b a c t i n ，采用实时荧光定量r t - p c r 技术研究大鼠死后不同时间和不同脏器中 两种看家基因的m r n a 降解规律，建立m r n a 降解的程度与死亡时间关系的回归方程。 探索用于晚期死亡时间推断较为理想的组织，并试图建立标准化的r n a 提取与定量检测 方法。希望能最终应用于法医学实践中。 方法：( 1 ) 选取s d 大鼠2 8 只，按不同死后经过时间分对照组( 死后即刻) 和实验组 1 6 ( 死后1 天、3 天、5 天、7 天、9 天、1 2 天) ，每组4 只，对照组脊椎脱臼法处死后 快速取出心、肝、脾、肺、肾、脑，称量多个小块( 1 9 ) 组织置于液氮中保存备用。实验 组脊椎脱臼法处死后置于人工气候箱内，设定条件为温度2 0 ，湿度5 0 ，白天、黑夜 各1 2 小时。分别于l 天、3 天、5 天、7 天、9 天、1 2 天后各取出4 只大鼠的心、肝、脾、 肺、肾、脑，称量多个小块( 1 9 ) 组织置于液氮中保存备用。( 2 ) 采用以膜提取技术( 不 含苯酚) 为基础和以异硫氰酸胍，苯酚法为原理的两种商品化试剂盒对大鼠心、肝、脾、肺、 肾、脑组织进行总r n a 的提取，并进行总r n a 的评价与鉴定，以分析评价两种提取方法 的优劣及适用范围。( 3 ) 对组织中g a p d hm r n a 和1 3 - a c t i nm r n a 进行一步法r t - p c r 检 测，应用凝胶图像分析系统分别对各组织中g a p d hm r n a 和1 3 - a c t i nm r n a 扩增产物电 泳图目标条带进行灰度扫描和光密度分析，计算出各条带相对灰度值和光密度值，结果以 相对灰度( r e l a t i v eg r a y s c a l e ) 和积分光密度值( i n t e g r a lo p t i c a ld e n s i t y ，i o d ) 表示，并筛选 出在死后较长时间段仍能检出的组织脏器。( 4 ) 根据一步法r t - p c r 扩增后产物凝胶电泳 的实验结果，本文选取了在死后5 天内仍能检测出扩增产物的脑组织和脾脏，使用s y b r g r e e ni 嵌合荧光法实时荧光定量r t - p c r 技术，根据荧光信号的累积情况实时监测 g a p d hm r n a 和1 3 - a c t i nm r n a 不同时间点的r t - p c r 进程，并将p m i 延长至1 2 天，结 果用循环阈值( 简称c 。值) 表示，分析死后经过时问与c 。值的线性关系，并最终建立死 亡时间推断回归方程。( 5 ) 为探讨同一种看家基因上的不同位点，其降解速率是否也有一 定规律性，本文选取了在死后较长时间内仍能检测出扩增产物的脑组织，对g a p d hm r n a 的6 个不同位点进行不同时闻点的实时荧光定量r t - p c r 监测，这些位点依次分布于 g a p d hm r n a 的5 37 端。并将p m i 时间延长、间隔增加( 死后即刻、i 天、5 天、9 天、1 2 天) ，结果用循环闽值( 简称c 。值) 表示。通过检测大鼠死后不同时间脑组织中各 位点g a p d hm r n a 的降解，分析不同位点的降解规律及其与死后经过时间的相关性，试 图寻找单一看家基因的降解规律。 结果：( 1 ) 总r n a 评价与鉴定均以对照组为例作比较，采用t r l z o l 试剂盒与s vt o t a l r n a i s o l a t i o n s y s t e m 提取的总r n a 纯度与得率均可满足下一步实验要求。各组织o d 2 6 叭鲫 均在1 9 2 1 之自j ，结果无显著性差异( p 脾脏 心脏 大脑 肾脏 肺脏。均可满足下一步实验要求。( 2 ) g a p d hm r n a 、b a c t i nm r n a 进行 r p c r 反应后，扩增产物的相对灰度与积分光密度值随死后经过时间的延长丽逐渐减小， 且与死亡时间显著相关，从扩增产物电泳图中可见大鼠脾脏和脑组织g a p d hm r n a 和 b a c t i nm r n a 在死后5 天内可被检出，心脏和肾脏在死后3 天内可被检出，而肝脏和肺脏 g a p d h m r n a 和b a c t i n m r n a 降解较快。仅在死后l 天内被检出。以脾脏和脑组织检出 时间最长。( 3 ) 使用s y b rg r e e ni 嵌合法实时荧光定量r t - p c r ，根据荧光信号的累积实 时监测脑组织和脾脏g a p d hm r n a 和p - a c t i nm r n a 不同时间点的r t - p c r 进程，经线性 回归分析，g a p d hm r n a 和b a c t i nm r n a 的c t 值均与p m i 之间存在显著的相关性，并 得出死亡时间推断的回归方程( 脑组织g a p d h ：p = 1 5 3 1 2 + 1 5 3 1 x ，r 2 卸9 4 3 ；脑组织 b a c t i n ：y = 1 5 6 0 9 + 1 7 5 0 x 。r 2 = 0 9 5 3 脾脏g a p d h ：y = 1 9 5 7 1 + 1 4 5 3 x ，r 2 = 0 8 5 2 ； 脾脏1 3 - a c t i n ：p = 2 1 7 6 9 + 1 2 7 4 x ，r 2 = o 8 0 8 ) 。( 4 ) 经线性回归分析，脑组织中各位点 g a p d hm r n a 均与死后经过时间有相关性，但不同位点的m r n a 降解速率不同。各位点 线性回归方程如下： g a p d hm r n a l ：y = 1 5 5 0 1 + 1 5 7 7 xr 2 ：0 9 6 8 ，斜率为1 5 7 7 g a p d i q m r n a 2 ：矿= 1 5 7 1 7 + 1 5 9 6 xr 2 - - 0 9 8 0 ，斜率为1 5 9 6 g a p d i - im r n a 3 ：y = 1 5 7 7 2 + 1 5 5 3 x r l = 0 9 7 3 ，斜率为l 5 5 3 g a p d h m r n a 4 ：矿= 1 5 4 8 7 + 0 9 3 6 xr 2 ：o ，9 6 5 ，斜率为o 9 3 6 g a p d hm r n a 5 ；矿= 1 5 5 8 0 + 0 8 9 2 x r 2 = o 9 4 9 ，斜率为o 8 9 2 g a p d hm r n a 6 ：y = 1 5 5 7 0 + 0 8 2 9 xr 2 - - - 0 9 5 6 ，斜率为0 8 2 9 各个线性回归方程中，g a p d hm r n a i g a p d hm r n a 3 的斜率为l 5 7 7 、1 5 9 6 、1 5 5 3 ， 这三个位点的降解速率基本相同。g a p d hm r n a 4 g a p d hm r n a 6 的斜率为0 9 3 6 、 0 8 9 2 、0 8 2 9 ，这三个位点的降解速率基本相同。但与前三个位点相比，斜率减小，说明 后三个位点m r n a 的降解速率要慢于前三个位点。以g a p d hm r n a 6 作为外标，g a p d h m r n a l g a p d hm r n a 3 与其的比值同p m i 之间存在显著的相关性( 回归方程分别为 矿= 1 0 1 5 + 0 0 2 9 x ，r 匈8 9 8 ：矿= 1 0 2 8 + 0 0 3 0 x ，r 2 = o 8 7 1 ：p = 1 0 3 1 + 0 0 2 8 x ，r 锄8 7 9 ) 。 而g a p d h m r n a 4 和g 触d h m r n a 5 与作为外标的g a p d h m r n a 6 的比值同p m i 之间 无相关性。 结论：( 1 ) 在研究机体死后m r n a 降解规律的实验中，总r n a 的提取是实验成功与 否的关键，而不同商品化提取试剂均可满足实验要求，但从法医学实验室质量控制及检验 结果是否具有可比性的角度出发，s v t o t a l r n a i s o l a t i o ns y s t e m 效果更好。( 2 ) 与一步法 r t - p c r 技术相比，s y b rg r e e ni 嵌合法实时荧光定量r t p c r 在定量分析m r n a 降解的 山西医科大学博士学位论文 研究中是一个更理想的技术手段。选用看家基因作为p m i 推断的研究对象，可在法医检案 中消除其它基因因为个体差异带来的误差，更具实用性。c 。值作为动态监测机体死后不同 时间点的客观指标，与死后不同时间点的线性关系良好，推断死后经过时间尤其是晚期死 亡时间较为理想，( 3 ) 死后m r n a 特别是看家基因m r n a 的组织差异性研究表明，脑组 织和脾脏中m r n a 稳定性较好，适用于p m i 特别是晚期p m i 的推断。除环境温度外，环 境湿度也是死亡时间推断研究中的重要影响因素，在今后的研究中应加以考虑。( 4 ) 同一 种组织中，同一种看家基因的不同位点存在降解速率的差异性。造成这种差异性的原因可 能是机体死亡后，在保证r n a 分子完整性的前提下，m r n a 的降解可能是从5 端向37 端 进行的。因此选取看家基因作为引物时，应尽量选取靠近3 喘的位点，这些位点降解速率 慢，可能更适于研究晚期死亡时间的推断。同时在实验室结果比较中，也应将引物序列标 准化，便于不同实验室的结果比较与评价。( 5 ) 采用r n a 尤其是m r n a 作为研究目标进 行死亡时间推断为此研究领域提供了一个新的思路。 关键词：法医病理学，死亡时间推断，m r n a 降解，看家基因，实时荧光定量r t - p c r i 山西医科大学博士学位论文 a s s o c i a t i v i t ys t u d yb e t w e e nh o u s e k e e p i n gg e n e sm r n ad e g r a d a t i o n r e g u l a r i t yi nd e a dr a t sa n da d v a n c e ds t a g ep o s t m o r t e mi n t e r v a l s a b s t r a c t 0 b j e e t i v e i no r d e rt oe x p l o r ei d e a lt i s s u ef o rd e t e r m i n a t i o no ft h el a t et i m eo fd e a t h ，a n d e s t a b l i s hl i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o nb e t w e e nm r n ad e g r a d a t i o na n dp o s t m o r t e mi n t e r v a l s ，t h e r a t eo fm r n a d e g r a d a t i o nf r o mh o u s e k e e p i n gg e n eg a p d h a n dp a c t i ni n v e s t i g a t e d o n es t e p r t - p c rt e c h n i q u ea n dr e a lt i m er t - p c rt e c h n i q u ea r ea p p l i e di ne v a l u a t i n gt h ec o r r e l a t i o n b e t w e e nr a t eo fm r n a d e g r a d a t i o ni ns dr a t sa n dp o s t m o r t e mi n t e r v a l s ，e s p e c i a l l yi na d v a n c e d s t a g ep m i m e t h o d s ( 1 ) at o t a lo f2 8s dr a t sw e r eg r o u p e da n dl e f ti na r t i f i c i a lc l i m a t eb o xa t2 0 a n d h u m i d i t y5 0 ，d a ya n dn i g h te a c hf o r1 2h o u r s e a c h4r a t sw e f ek i l l e da n dc o r p s e sw e r ek e p t i na r t i f i c i a lc l i m a t eb o xf o r0 ，1 ，3 ，5 ，7 ，9 ，1 2d a y s t h eh e a r t ，l i v e r , s p l e e n 。l u n g 。k i d n e ya n d b r a i nw e r es t o r e da t 一8 0 i m m e d i a t e l ya f t e rf r o z e ni nl i q u i dn i t r o g e n ( 2 ) t o t a lr n aw a s e x t r a c t e df r o me a c hs a m p l eu s i n gt r i z o lr e a g e n t ( i n v i t r o g e n ，u s a ) a n ds vt o t a lr n ai s o l a t i o n s y s t e m ( p r o m e g a ，u s a ) a c c o r d i n gt ot h em a n u f a c t u r e r 7 si n s t r u c t i o n c o n c e n t r a t i o na n dy i e l d s o ft o t a lr n ai nt h ee x t r a c t sw e r em e a s u r e d ( 3 ) t o t a jr n aw a sr e v e r s et r a n s c r i b e du s i n g o n e s t e pr t - p c rk i t ( t a k a r a ，j a p a n ) a c c o r d i n gt ot h em a n u f a c t u r e r si n s t r u c t i o n i n t e g r a l o p t i c a ld e n s i t y ( i o d ) ，r e l a t i v eg r a y s c a l e ( r g ) w e r em e a s u r e db yt h ei m a g ea n a l y s i si nt h eg e l i m a g ea n a l y t i c a ls y s t e m s p l e e na n db r a i nw e r ep i c k e do u tt ou s ef o rr e a lt i m er t - p c r ( 4 ) t h e t a r g e tg e n em r n a s w e r ed e t e c t e db yr e a l t i m ep c rf r o mt h es a m p l e s w h i c hk e p ti na r t i f i c i a l c l a m i t eb o xu pt o1 2d a y s b yt h i sm e t h o d s ，t h er e l a t i v em r n al e v e lw a si n d i c a t e da st h ec t v a l u e ，t h ec cv a l u ec o r r e l a t e si n v e r s e l yt oa m o u n to ft a r g e tm r n ai nt h es a m p l e t h e c o r r e s p o n d i n gr e g r e s s i o ne q u a t i o nw a so b t a i n e d ( 5 ) i no r d e rt oo b s e r v ed e g r a d a t i o nr e g u l a r i t yo f d i f f e r e n ts i t e si nt h es a l t l eh o u s e k e e p i n gg e n eg a p d h ，s y b rg r e e nir e a l t i m er t - p c rw a s u s e dt om e a s u r eg a p d h m r n af r o mt h e57 一m r n ac a ps t r u c t u r et ot h e3 一e n di ni n t a c t m r n a b y 6 p a i r o f p r i m e r s p o s t m o r t e m i n t e r v a l s w e r ee x t e n d e d t 0 0 ，1 ，5 。9 ，1 2d a y s r e s u l t s( 1 ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti o da n dr go fa m p l i f i c a t i o np r o d u c t sb yo n es t e p r t - p c ri ng a p d ha n di b - a c t i nm r n ad e c r e a s e do v e rt i m ew i t ht h es i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o no f p o s t m o r t e mi n t e r v a l s a m p l i f i c a t i o np r o d u c t so ft w oh o u s e k e e p i n gg e n e sw e r ed e t e c t e da tf i v e d a y sp o s t m o r t e mi nt h es p l e e na n db r a i n ，t h r e ed a y sp o s t m o r t e mi nt h eh e a r ta n dk i d n e y , o n ed a y p o s t m o r t e mi nt h el i v e ra n dl u n go fr a t s ( 3 ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec 【v a l u e so fg a p d h m r n aa n di l a c t i nm r n ab ys y b rg r e e nir e a lt i m er t - p c rc o r r e l a t e sw i t ht h ep o s t m o r t e m p e r i o d s t h u s ，w eg o tt h ee q u a t i o n so fc o r r e l a t i o nb e t w e e nr a t eo fm r n ad e g r a d a t i o na n d i v 山西医辩大学博士学位论文 p o s t m o r t e mp e r i o d s t h e e q u a t i o n s a r ea sf o l l o w s ： b r a i ng a p d h ： p ：1 5 3 1 2 + 1 5 3 1 x r 2 = o 9 4 3 b r a i np - a c t i n ：矿= 1 5 6 0 9 + 1 7 5 0 x r 2 = o 9 5 3 s p l e e n g a p d h ：矿= 1 9 5 7 1 + 1 4 5 3 x r 2 = o 8 5 2 s p l e e nb a c t i n ： y = 2 1 7 6 9 + 1 2 7 4 x ，r 。= o 。8 0 8 ( 4 ) t h e c t v a l u e so f g a p d h m r n aa t d i f f e r e n ts i t e s f r o m t h e5 一m r n a c a ps t r u c t u r e t o t h e3 7 一e n d ( g a p d hm r n a l g a p d hm r n a 6 ) i nb r a i na l lc o r r e l a t e sw i t ht h ep o s t m o r t e m p e r i o d s ，w h i l ed i f f e r e n ts i t e ss h a r et h ed i f f e r e n td e g r a d a t i o nr a t e t h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o n s a r ea sf o l l o w s ： g a p d h m r n a l ：矿；1 5 5 0 1 + 1 5 7 7 x r 2 = o 9 6 8 ，s l o p er a t e w a s1 5 7 7 g a p d h m r n a 2 ：y = 1 5 7 1 7 + 1 5 9 6 x r 2 = o 9 8 0 ，s l o p er a t e w a s1 5 9 6 g a p d hm r n a 3 ：p = 1 5 ，7 7 2 + 1 5 5 3 x r 2 = o 9 7 3 ，s l o p er a t ew a s1 5 5 3 g a p d hm r n a 4 ；矿= 1 5 4 8 7 + 0 9 3 6 x r ? = 0 9 6 5 ，s l o p er a t ew a s 0 9 3 6 g a p d hm r n a 5 ：y ；1 5 5 8 0 + 0 8 9 2 x r = o 9 4 9 ，s l o p er a t ew a s0 8 9 2 g a p d hm r n a 6 ：p = 1 5 5 7 0 + 0 8 2 9 x r 2 = o 9 5 6 ，s l o p er a t ew a s0 8 2 9 t h es l o p er a t eo fg a p d hm r n a4 6d e g r a d a t i o nw e r el o w e rt h a ng a p d hm r n a1 - 3 i fw e u s e dg a p d hm r n a6a se x t e r n a ls t a n d a r d ，t h er a t i oo fg a p d hm r n a1 - 3 g a p d hm r n a6 w e r ec o r r e l a t e dw i t hp o s t m o r t e mp e r i o d s t h er e g r e s s i o ne q u a t i o n sa r ea sf o l l o w s ： g a p d hm r n a1 1 g a p d hm r n a6 ：矿= 1 , 0 1 5 + 0 0 2 9 x 。r z = 0 8 9 8 g a p d hm r n a 2 g a p d hm r n a 6 ：矿：1 0 2 8 + 0 ，0 3 0 x ，r 2 = o 8 7 1 g a p d hm r n a3 g a p d hm r n a 6 ：p ：1 0 3 1 + 0 0 2 8 x ，r 2 = 0 8 7 9 h o w e v e r , t h er e l a t i o nb e t w e e ng a p d h4 5 g a p d h6a n dp o s t m o r t e mp e r i o d sw e r en o t o b s e r v e d c o n c l u s i o n s ( 1 ) t h ee x t r a c t i o no ft o t a lr n a w a st h em o s tk e y s t e pi nr e s e a r c h i n gf o rm r n a d e g r a d a t i o ni nf o r e n s i ce x p e r i m e n t s t h et w od i f f e r e n tc o m m e r c i a l i z er e a g e n t sa r eb a s i c a l l y s a t i s f i e dw i t hr t - p c r h o w e v e r , f r o mt h ep o i n to f v i e wi nq u a l i t yc o n t r o la n dc o m p a r a b i l i t yo f r e s u l t s ，s vt o t a lr n ai s o l a t i o ns y s t e mi sb e t t e rf o rf o r e n s i ce x p e r i m e n t s ( 2 ) t h es y b rg r e e n ir e a l t i m er t - p c rw a sar e l i a b l et e c h n i q u ef o rr e s e a r c h i n gm r n a d e g r a d a t i o nc o m p a r et oo n e s t e pr t - p c rt e c h n i q u e a d o p t i o no ft h eh o u s e k e e p i n gg e n e sf o ru s i n gt or e s e a r c hm r n a d e g r a d a t i o ne l i m i n a t e ds y s t e m a t i c a le r r o r so fo t h e rg e n e s a st h eo b j e c t i v ei n d e x ，c tv a l u e sh a v e ag o o dc o r r e l a t i o nw i t hp o s t m o r t e mp e r i o d s 。i tw a sai d e a li n d e xf o re s t i m a t i n gp o s t m o r t e m i n t e r v a l se s p e c i a l l yi na d v a n c e ds t a g ep m i ( 3 ) t h er e s u l t so ft i s s u ev a r i a b i l i t yr e s e a r c h i n g s h o w e dt h a tm r n a so fb r a i na n ds p l e e ni nr a t sw e r em o r es t a b l et h a nt h a tf r o mo t h e ro r g a n s e s p e c i a l l yi na d v a n c e ds t a g ep m ia l t h o u g ha m b i e n tt e m p e r a t u r ea n dh u m i d i t ys h o u l db e c o n s i d e r e da st h ei m p o r t a n tf a c t o r si ne s t i m a t i o no fd e a t ht i m e ( 4 ) t h ed i f f e r e n ts i t e so ft h e v 山西医科大学博士学位论文 s a m eh o u s e k e e p i n gg e n ei nt h es a m et i s s u es h a r et h ed i f f e r e n td e g r a d a t i o nr a t e s ，t h er e a s o n m i g h tb et h ed e g r a d a t i o ns t a r t e df r o mt h e5 一m r n ac a ps t r u c t u r et ot h e37 一e n di nt h e c o n d i t i o no fr n a i n t e g r a l i t y t h u s 。s e l e c t i o no ft h ep r i m e rp a i r ss h o u l db en e a rt ot h e3 一e n do f m r n a t h es e q u e n c eso fp r i m e r ss h o u l db ei d e n t i c a ls of i t st oe a s i l yc o m p a r et or e s u l t sa m o n g d i f f e r e n tf o r e n s i cl a b s ( 5 ) w ep r o v i d ean o v e la p p r o a c ha n dn e wv i e wt oe s t i m a t ed e a t ht i m eb y m r n ar e a lt i m er t - p c ra n a l y s i si nf o r e n s i cc a s e w o r k k e yw o r d s f o r e n s i cp a t h o l o g y ，p o s t m o r t e mi n t e r v a l s ( p m i ) ，m r n ad e g r a d a t i o nt h o u s e k e e p i n gg e n e ，r e a lt i m er t - p c r 山西医科大学博士学位论文 插图和附表清单 表2 1s v t o t a lr n ai s o l a t i o ns y s t e m 提取的各组织总r n a 平均产量9 图2 - l 脑组织总r n a 电泳图比较结果1 0 图2 2 死后不同时间大鼠各脏器g a p d hm r n a 扩增产物电泳结果1 0 图2 3 死后不周时间大鼠各脏器8 一a c t i nm r n a 扩增产物电泳结果1 1 表2 2 死后不同时间大鼠心脏r t p c r 扩增产物相对灰度及i o d 值分析结果l l 表2 3 死后不同时间大鼠肝脏r t - - p c r 扩增产物相对灰度及i o d 值分析结果1 1 表2 4 死后不同时间大鼠脾脏r t - - p c r 扩增产物相对灰度及i o d 值分析结果1 2 表2 5 死后不同时间大鼠肺脏r t - - p c r 扩增产物相对灰度及i o d 值分析结果1 2 表2 - 6 死后不同时间大鼠肾脏r t - - p c r 扩增产物相对灰度及i o d 值分析结果1 2 表2 7 死后不同时闻大鼠脑组织r t - - p c r 扩增产物帽对灰度及i o d 值分析结果1 2 图2 4 相对定量的标准曲线1 3 表2 8 不同梯度总r n a 定量模板数对应的看家基因c t 值1 3 图2 5 脑组织g a p d h m r n a c t 值总体均数的可信区问与预测区间示意图o ooo0 1 4 图2 - 6 脑组织8 一a c t i n m r n a c t 值总体均数的可信区间与预测区间示意图1 4 表2 ，9 不同p m i 时脑组织中两种看家基因m r n a 的c t 值结果1 5 图2 7 脾脏g a p d hm r n a c t 值总体均数的可信区间与预测区间示意图1 5 图2 8 脾脏b a c t i nm r n a c t 值总体均数的可信区问与预测区间示意图1 6 表2 1 0 不同p m i 时脾脏中两种看家基因m r n a 的c t 值结果1 6 图3 1 脑组织g a p d hm r n alc t 值总体均数的可信区阳j 与预测区间示意图3 2 图3 2 脑组织g a p d h m r n a 2 c t 值总体均数的可信区问与预测区间示意图3 2 图3 0 脑组织g a p d h m r n a 3 c 。值总体均数的可信区间与预测区间示意图3 3 图3 - 4 脑组织g a p d hm r n a 4c 。值总体均数的可信区间与预测区间示意图3 3 图3 5 脑组织g a p d hm r n a 5c 。值总体均数的可信区间与预测区间示意图3 4 图3 - 6 脑组织g a p d hm r n a 6c 。值总体均数的可信区间与预测区间示意图3 4 图3 7 脑组织g a p d h m r n a i g a p d h m r n a 6 值总体均数的可信区间与预测区间示意图3 5 图3 8 脑组织g a p d h m r n a 2 g a p d h m r n a 6 总体均数的可信区问与预测区间示意图3 5 图3 - 9 脑组织g a p d hm r n a 3 g a p d hm r n a 6 总体均数的可信区间与预测区问示意图3 6 图3 1 0 脑组织g a p d h m r n a 4 g a p d h m r n a 6 散点图3 6 图3 ，1 l 脑组织g a p d h m r n a 5 g a p d h m r n a 6 散点图3 7 山西医科大擘博士学位i e 戈 p m i g a p d h m o p s d e p c r l a r d a s c a r w r a d s a o d c d n a n t c n r t q r t _ p c r i o d c e f r e t 缩略词表 p o s t m o r t e mi n t e r v a l 死后问隔时问 g l y c e r a l d e h y d ep h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e 磷酸甘油醛脱氢酶 3 - ( m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i ca c i d 3 - 吗啉基丙磺酸 d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 二乙基焦磷酰胺 r n a l y s i sb u f f e rr n a 溶解缓冲液 r n ad i l u t i o nb u f f e rr n a 稀释缓冲液 s p i nc o l u m na s s e m b l i e s 离心柱 r n aw a s hs o l u t i o nr n a 洗脱液 d n a s es t o ps o l u t i o nd n a 酶终止液 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 c o m p l e m e n td n a 互补d n a n ot e m p l a t ec o n t r o l s无模板对照 n o r tc o n t r o l s 无反转录对照 q u a n t i t a t i o nr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr a c t i o n 定量逆转录聚合酶链反应 i n t e g r a lo p t i c a ld e n s i t y 积分光密度值 c y c l et h r e s h o l d 循环阈值 f l u o r e s c e n c er e s o l l a n c ee n e r g yt r a n s f e r荧光共振能量传递 v 1 1 1 山西医科大学博士学位论支 大鼠死后看家基因m r n a 降解规律与晚期 死亡时间推断的相关性研究 第一章绪论 死亡时间( p o s t m o r t e mi n t e “a l ，p m i ) 的推断是法医学鉴定中要解决的首要问题，尤 其是早期死亡时伽的推断在刑事侦察、死亡医疗纠纷的仲裁、自然灾难的判断等领域具有 重要意义，也是法医病理学的研究难点和热点，受到国内外学者的广泛关注。以往的研究 中j + z a j , 多数依靠尸体现象、超生反应、法医昆虫学、尸体化学和组织化学等来迸行死亡 时间的推断，但其准确性受到许多外界因素，如环境、湿度及湿度、衣着、体态、尸体接 触物体的导热率，死亡前体温等的影响，使推断的死亡时间误差较大。此外，还有个别学 者初步研究了利用磁共振波谱、w e s t e r n 杂交等新技术“”推断死亡时间的可行性，但还 未能应用于法医学实践中。 随着组织细胞内核酸定量技术的日益成熟，国内外法医学者开始研究通过测量组织细 胞内d n a 含量变化规律来推断死亡经过时间的可行性。1 9 7 1 年，a d l e r 和b e c k h o v e 采 用化学方法结合细胞分光光度计，测定了牛死后不同时间心肌细胞核d n a 含量，最早进 行了利用尸体细胞核d n a 含量变化推断死亡时间的研究。此后的多数研究“”也表明死 后组织细胞中d n a 含量随着死亡时间的延长逐渐下降，其中在某一时问段内呈规律性改 变，同时也发现不同组织细胞d n a 含量下降的规律也不同，但目前尚未建立可靠的定量 方法检测这种变化规律。相对于其他尸体材料丽言，细胞核d n a 的变化很少受外界条件 变化的干扰，因而适合于死亡时问推断的研究已成为许多学者的共识，运用流式细胞术、 图像分析技术、单细胞凝胶电泳、彗星电泳、p c r 扩增等新技术量化不同死后经过时问的 细胞核d n a 降解后含量变化的研究已有较多报道拍”3 “，虽然在理论和技术上有了一定 的保证，但是同时也存在着些法医学实践中亟待解决的问题： ( 1 ) 各国学者所采用的实验方法和试验条件不一，加之操作人员技术上的差异，使 不同实验研究结果缺乏可比性。如何选择一种经济实用、客观性强、可重复性好的定量检 测仪器，使用相同的试剂，相同的染色技术及尽量减少实验室和操作人员之间的差异有 待标准化。目前研究比较深入的是图像分析技术的标准化问题1 3 2 - 5 | 。对于比较成熟的方法 如何建立统一的标准，如何进行实验室质量控制，都是今后需要关注和研究的问题。 ( 2 ) 以往研究，大部分实验仍然建立在动物尸体标本的基础上，在人类尸体方面的 研究有待进一步深入。并且在尸体脏器和组织的选择上，各国学者的研究中虽然基本涵盖 了各主要脏器、组织，同时对软骨、滑膜、胸骨骨髓、牙髓等组织也进行了研究。但研究 结果出入较大憎”，因此脏器和组织的比较与选择也是今后死亡时问推断研究的方向。 ( 3 ) 利用各种技术和手段推断早期死亡时间的研究已经积累了一定的经验，但在晚 期死亡时间推断尤其是腐败尸体死亡时间推断方面只是刚起步，如何选择较为理想的组 织，进一步探求较长时间段的死亡时间推断方法，将是今后研究的方向。 山西医辩大学博士学位论空 与d n a 相比，人们通常认为由于外界环境中广泛存在的r n a 酶会使r n a 在死后或 在体外迅速降解。二十世纪9 0 年代以来，国外一些学者“。1 在研究死后r n a 的降解与 稳定性的过程中发现r n a 尤其是信使r n a ( m r n a ) 和核糖体r n a ( r r n a ) 并非想象 中那样脆弱，某些器官如脑组织中的r n a 在一定条件下如4 0 保存时相当稳定，几乎不发 生降解。即使在常温下，只要组织不反复冻融，仍然可以在较长时间段内检出足够量的 r n a ，尤其是看家基因表现的更为突出。这似乎为法医学者推断晚期死亡时间研究提供了 一个新的方法和思路。随后的研究“”1 进一步证实某些看家基因的m r n a 的死后降解有 一定规律性，特别是在脑组织中m r n a 降解的程度与死亡时间有一定相关