血液病基因检测的临床意义 ppt课件.ppt

髓细胞系恶性肿瘤 根据细胞形态学 免疫学 细胞遗传学 分子生物学以及临床特征WHO分型法将髓系肿瘤分为骨髓增生性疾病 MPD 肿瘤 MPN 骨髓增生异常 骨髓增生性疾病 肿瘤 MDS MPD MDS MPN 骨髓增生异常综合征 MDS 急性髓细胞白血病 AML 四大类 1 PH染色体 t 9 22 q34 q11 BCR ABL 阳性的慢性髓系白血病 CML 慢性中性粒细胞白血病 CNL 慢性嗜酸粒细胞白血病 高嗜酸粒细胞综征 CEL HES 真性红细胞增多症 PV 慢性原发性骨髓纤维化 伴髓外造血 CIMF 原发性血小板增多症 ET 不能分类骨髓增生性疾病七类 骨髓增生性肿瘤 MPN 2 骨髓增生异常 骨髓增生性肿瘤 MDS MPN 是一种克隆性造血干细胞疾病 特点表现为MDS与MPD交叠 有多种 有效 造血及病态造血存在 慢性粒 单核细胞白血病 CMML 不典型慢性髓系白血病 aCML 幼年型粒 单核细胞白血病 JMML 不能分类的MDS MPD四类 3 骨髓增生异常综合征 MDS MDS也是克隆性疾病 以无效造血为其特征引起血细胞减少 骨髓及血象一至多系细胞病态造血 4 MDS亚型分类亚型外周血象骨髓象1 难治性贫血贫血 未见或罕见仅红系增生异常 RA 原始细胞原始细胞 5 环形铁粒幼细胞 15 2 难治性贫血伴贫血 未见或罕见仅红系增生异常 环形铁粒幼细胞原始细胞原始细胞 5 环形铁粒幼细胞 15 3 难治性血细胞减少血细胞减少 二系或二系或多系细胞增生异常伴多系增生异常全系 未见Auer小体 10 原始细胞 5 RCMD 未见或罕见原始细胞 未见Auer小体 单核细胞 1 109 L环形铁粒幼细胞 15 4 难治性血细胞减少血细胞减少 二系或二系或多系细胞增生异常伴多系增生异常和全系 未见Auer小体 10 原始细胞 5 环形铁粒幼细胞单核细胞 1 109 L未见Auer小体 RCMD RS 环形铁粒幼细胞 15 5 亚型外周血象骨髓象5 难治性贫血伴血细胞减少 一系或多系细胞增生异常 原始细胞增多1型原始细胞 5 原始细胞5 9 RAEB 1 未见Auer小体 未见Auer小体 单核细胞 1 109 L6 难治性贫血伴血细胞减少 一系或多系细胞增生异常 原始细胞增多2型原始细胞5 19 原始细胞10 19 RAEB 2 Auer小体 Auer小体 单核细胞 1 109 L7 未归类的MDS血细胞减少 单一髓系细胞增生异常 MDS U 未见或罕见原始细胞 原始细胞 5 未见Auer小体 未见Auer小体 8 5q 综合征贫血 少叶核巨核细胞正常或增多 del 5q 血小板计数正常或增高 原始细胞 5 原始细胞 5 细胞遗传学检测仅见del 5q 异常 未见Auer小体 6 AML是髓系原始细胞克隆性增生疾病 WHO分型将AML分为 1 伴有特殊染色体的AML2 伴有病态造血的AML3 治疗相关的AML和MDS 4 不伴特殊细胞遗传易位的AML四亚型 急性髓细胞白血病 AML 7 1 伴有特殊细胞遗传易位的AML 1 伴有t 8 21 q22 q22 AML AML1 CBF ETO的AML 2 伴有inv 16 p13 q22 或t 16 16 p13 q22 CBF MYH11的骨髓嗜酸粒细胞增多的AML 3 伴有t 15 17 q22 q11 12 PML RAR 及变异的急性早幼粒细胞白血病 APL 4 伴有11q23 MLL 异常增生的AML 8 2 伴有多系血细胞增生异常的急性髓细胞白血病 1 由MDS或MDS MPD转化而成 2 发病前无MDS病史 9 3 治疗相关的AML和MDS 1 与烷化剂相关 2 与拓扑异构酶 抑制剂相关 一些可以是淋巴系 3 其他 10 4 不伴特殊细胞遗传易位的AML 1 未分化AML 2 未成熟AML 3 成熟AML 4 急性粒 单核细胞白血病 5 急性单核细胞白血病 6 急性红白血病 7 急性巨核细胞白血病 8 急性嗜碱细胞白血病 9 伴骨髓纤维化的急性全髓增生 10 髓细胞肉瘤 11 12 淋系肿瘤 B系肿瘤和T NK细胞系肿瘤又可分为两大类型 前体淋巴细胞肿瘤 淋系白血病 外周或成熟淋巴细胞肿瘤 淋巴瘤 前者指淋巴细胞分化的早期阶段起源的肿瘤后者是分化成熟阶段来源的肿瘤 13 B细胞系肿瘤前体B细胞肿瘤前体B淋巴母细胞白血病 淋巴瘤 B ALL LBL 成熟 周围 B细胞肿瘤B 慢性淋巴细胞性白血病 小淋巴细胞淋巴瘤 B CLL SLL B 细胞幼淋巴性细胞白血病 B PLL 淋巴浆细胞淋巴瘤 LPL Burkitt淋巴瘤 BL 多毛细胞白血病 HCL 浆细胞骨髓瘤 浆细胞瘤 PCM PCL 脾边缘区B细胞淋巴瘤 绒毛状淋巴细胞 SMZL 结外边缘区B细胞淋巴瘤 MALT型 MALT MZL 结型边缘区B细胞淋巴瘤 单核细胞样B细胞 MZL 滤泡性淋巴瘤 FL 套细胞淋巴瘤 MCL 弥漫性大B细胞淋巴瘤 DLBCL 14 T细胞和NK细胞系肿瘤前体T细胞肿瘤前体T淋巴母细胞淋巴瘤 白血病 T LBL ALL 成熟 周围 T细胞肿瘤T 细胞幼淋巴细胞白血病 T PLL T 大颗粒淋巴细胞白血病 T LGL 侵袭性NK细胞白血病 ANKCL 成人T细胞淋巴瘤 白血病 ATCL L 结外NK T细胞淋巴瘤 鼻型 NK TCL 肠病型T细胞 淋巴瘤 ITCL 肝脾 T细胞淋巴瘤皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤蕈样真菌病 Sezary综合征 MF SS 间变性大细胞淋巴瘤 ALCL 15 霍奇金淋巴瘤 霍奇金病 结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤 NLPHL 经典型霍奇金淋巴瘤结节硬化型霍奇金淋巴瘤 1和2级 NSHL 富于淋巴细胞经典霍奇金淋巴瘤混合细胞型霍奇金淋巴瘤 MCHL 淋巴细胞消减型霍奇金淋巴瘤 LDHL 16 白血病基因检测 17 基因突变是指由于DNA分子中发生碱基对的 而引起的 的改变 增添 替换 缺失 D d1 d2 d3 增添 缺失或替换 基因结构 基因突变一定会导致生物性状的改变吗 18 mRNA GAA 甲乙丙丁 DNA碱基对替换 不一定引起蛋白质结构的改变 结论 碱基对替换一定会导致蛋白质结构的改变吗 氨基酸 天冬氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 缬氨酸 GAU GAC GUA 19 1 二战时 美国在日本的广岛 长崎投下两颗原子弹 导致白血病患者出生率增加 2 苏丹红进入人体可产生致癌作用 3 乙肝病毒使肝细胞进一步变异 肝细胞不凋亡 而且不断地再生 就形成了肝癌 内因 DNA复制时自身也偶尔发生错误 物理因素 化学因素 生物因素 基因突变原因 20 基因突变的特点 大多数基因突变对生物体是有害的 只有少数是有利的 有些既无害也无益 多数有害 21 结果 增殖过度 分化阻断 凋亡受抑 22 白血病的分子检测 SouthernblotNorthernblotWesternblotFISHPCR测序芯片 23 白血病的分子检测 PCR方法优点快速灵敏特异PCR方法缺点假阳性假阴性 24 白血病的分子检测 PCR 仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内 2kb 如T ALL中SIL TAL1 RT PCR 可用于染色体断裂点跨越很大的区域的融合基因 巢式RT PCR 可显著提高反应的特异性 增加扩增效率 RQ PCR 可定量扩增产物 25 白血病分子检测的临床应用 白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义 补充MIC检查的不足发现新的亚型监测白血病的微小残留病灶 MRD 为研究白血病的发病机制打下基础 26 白血病分子检测的临床应用 PCR方法检测MRD常用的分子标志 27 28 29 30 AML1 ETO t 8 21 q22 q22 6 8 原发性AML 在M2中的阳性率为20 40 在M2b中阳性率为90 少见于M4和M1 极少见于MDS和骨髓增生综合症AML1 ETO 白血病细胞有一定程度的分化能力 能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞 且对化疗反应较敏感AML1 ETO 患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好 具有较高的缓解率 无病生存期长 预后较其他AML亚型 M3除外 好 31 AML1 ETO 对初发患者进行t 8 21 和AML1 ETO融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要AML1 ETO定性结果不能用于评价患者MRD情况RQ PCR能实时反映体内AML1 ETO水平 连续定量AML1 ETO转录本水平可判定有高复发风险的患者 以便及早治疗干预以防血液学复发 32 33 PML RAR t 15 17 q22 q21 98 M3患者阳性继t 15 17 之后 又先后发现4种M3特异的累及RAR 的变异性染色体易位 t 5 17 q35 q21 t 11 17 q13 q21 dup 17 q21 3 q23 t 11 17 q23 q21 分别产生NPM RAR NuMA RAR 和PLZF RAR STAT5b RAR 融合基因临床上 具有PLZF RAR 或STAT5b RAR 融合基因患者对ATRA治疗不敏感 其余三种染色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解 34 PML RAR APL累及的RAR 基因及其伙伴基因结构示意图 35 PML RAR 由于PML基因断裂点不同 产生3种不同的PML RAR 异构体约55 的M3患者为L型 40 为S型 5 为V型 且每位患者只表达一种PML RAR 融合蛋白形态学上S型白血病细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常 V型APL患者的白血病细胞体外对ATRA的敏感度低 36 PML RAR RT PCR检测PML RAR 是敏感且特异的APL诊断方法 还能用于治疗后MRD监测 PML RAR 阳性提示的分子复发常早于临床复发3 6个月 为临床采取进一步治疗措施提供了保障RQ PCR能有效反映患者在发病 治疗 缓解 复发整个过程的白血病细胞负荷 在MRD监测中比RT PCR具有更高价值 37 38 FLT3基因突变 Fms relatedtyrosinekinase3FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族 还包括c FMS PDGFR 和c KIT 成员之一 该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用据报道 FLT3 ITD和D835突变在AML中阳性率分别为24 385 1585 和7 30 429 总阳性率超过30 使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因许多临床研究发现 FLT3突变还与临床预后密切相关 尤对60岁以下的AML患者 FLT3突变患者预后较差 且可独立于核型之外 39 CBF MYH11 inv 16 p13 q22 及t 16 16 p13 q22 主要见于M4Eo 10 不伴异常嗜酸细胞M4 少见于M2CBF MYH11融合蛋白通过干扰核心结合因子 corebindingfactor CBF 的转录激活作用而致病具有CBF MYH11的患者对化疗敏感 预后较好 故提高检测率尤具临床意义 40 CBF MYH11 CBF MYH11具有多种变异型 其中最常见的为A型 占80 RT PCR检测CBF MYH11进行MRD监测显示 大部分患者在完全缓解时PCR转阴 但仍有小部分长期存活者PCR仍为阳性最新研究采用RQ PCR检测CBF MYH11转录本水平来评价M4Eo患者MRD情况 预示复发 41 42 DEK CAN t 6 9 p23 q34 主要见于M2或M4 也见于M1 MDS RAEB伴DEK CAN的患者年龄一般较轻 且预后较差此类患者进行分子监测有助于判断患者预后 调整治疗方案 43 WT 1基因高表达 Wilmstumor1是无特异分子异常的急性白血病患者理想的MRD检测指标伴此基因高表达者预后差 且表达程度与预后相关 44 BCR ABL t 9 22 q34 q11 15 30 成人ALL及3 5 儿童ALL9号染色体的断裂点与CML相同 但22号染色体断裂点具有异质性此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要强 在转基因试验中观察到p190诱发的白血病具有起病早 发展快和恶性程度高的特点BCR ABL ALL患者预后差 5年存活率 20 因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗 45 BCR ABL 对于自体或异体移植ALL患者 移植前后BCR ABL的有无以及BCR ABL的转录本类型与预后有关 46 47 E2A PBX1 t 1 19 q23 p13 5 6 儿童ALL和3 成人ALL此类患者具有高的白细胞计数 高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状 预后差 平均无病生存期 DFS 仅6个月 3年DFS为20 需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后核型和E2A PBX1检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要E2A PBX1的预后价值需更多的临床研究证实 48 TEL AML1 t 12 21 p13 q22 25 儿童ALL 是儿童ALL中最常见的分子异常目前为止尚未在T ALL AML或NHL中发现t 12 21 在婴儿白血病中极少报道 在成人白血病患者中频率很低 2 此类患者发病年龄小 2岁 10岁 WBC计数低 50000 L 免疫表型为前B ALL此类患者对治疗反应佳 完全缓解时间长 预后好 49 TEL AML1 由于12p和21q末端在常规显带中很相似 因此常规细胞遗传学方法检出率仅0 05 需应用FISH或RT PCR方法提高检测阳性率TEL基因重排是独立预后因素 RT PCR检测TEL AML1融合基因能将低危险度与高危险度的ALL患者区分开来 因此早期检测TEL AML1融合基因对临床预后 确定合适的治疗方案都有重要意义 50 MLL相关融合基因 累及MLL基因的分子异常见于5 2 AML 22 ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤 还可见于治疗相关白血病 尤接受topoisomeraseII抑制剂治疗的患者MLL基因涉及五十余种染色体易位 产生不同的融合蛋白 且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关 最常见的有 t 4 11 q21 q23 MLL AF4融合基因ALLt 9 11 p22 q23 MLL AF9融合基因AMLt 11 19 p13 q23 MLL ENL融合基因AML及ALL 51 MLL相关融合基因 MLL相关融合蛋白的致病性还不清楚 推测其可能具有双重作用 融合蛋白可能获得新的功能 促使细胞转化 MLL发生断裂后 缺失锌指结构域的MLL不能与DNA结合 失去其转录活化功能 使受MLL调节的靶基因 HOX基因 表达异常 也影响造血细胞的发育 52 MLL AF4 t 4 11 q21 q23 t 4 11 的发生率在不同年龄段是不同的 在婴儿ALL中最多见 为50 70 而在儿童和成人中较低 分别为2 和3 6 此类患者发病年龄低 通常 2岁 白细胞计数高 常伴有内脏巨大并累及中枢神经系统此类患者病情凶险 预后差 患者对标准治疗方案很可能无效 需给予强化治疗 目前应用高剂量Ara C治疗 使这些患者预后有所提高 53 MLL AF4 对 2岁的婴幼儿急性白血病患者应常规进行MLL AF4融合基因的检测以筛选出高危患者 给予强化治疗提高生存率RT PCR可在所有t 4 11 患者初发时检测到MLL AF4融合基因 由于该融合基因累及的2个基因的断裂点变异性较大 因此PCR应包括所有断裂点以免产生假阴性结果 54 TAL1基因重排 1 t 1 14 p32 q11 TAL1 TCR 融合基因3 T ALL易位使TAL1基因与TCR 位点并置 其5 端正常转录调节被TCR 5 部分所取代 而后者在T细胞中有高表达 55 TAL1基因重排 2 1p32缺失 SIL TAL1融合基因16 26 T ALL 该重组仅见于T ALL 是T ALL的一个有用的克隆标志缺失部分可能为TAL1基因的调控序列 使TAL1基因表达失控 导致与染色体易位相似的表型常规遗传学方法检测不到这一异常 而SIL TAL1融合处特异的序列能作为这类患者特异的分子标志用于PCR检测 56 TAL1基因重排 3 TAL1异常仅见于T ALL 尚未见于B ALL AML和T细胞NHL 是儿童T ALL中最常见非随机遗传缺陷 是监测大多数T ALL的侯选基因伴TAL1异常的患者血象表现为高白细胞计数 高血红蛋白含量 免疫表型为CD2 CD10 尽管在治疗反应上 有TAL1重排患者和无TAL1重排患者无显著差异 但伴TAL1重排患者4年无事件生存率 EFS 高于不伴TAL1重排的患者 分别为59 11 和44 7 提示伴TAL1重排患者预后较好 57 HOX11基因异常表达 t 10 14 q24 q11 t 7 10 q34 q24 7 的T ALL易位使HOX11基因受控于TCR 和TCR 基因调控序列 导致其异常表达另有部分HOX11高表达患者核型正常伴有此种异常的患者对联合化疗反应好 预后也较其他T ALL患者要好 完全缓解率为100 平均无病生存期为46个月 3年无病生存率为75 58 HOX11L2基因异常表达 t 5 14 q35 q32 20 的儿童T ALL易位使HOX11L2基因处于CTIP2调控元件的控制下 而CTIP2基因在T淋巴细胞分化时高度表达在随访患者中检测到高水平HOX11L2说明白血病细胞的存在 强烈预示复发 而完全缓解患者HOX11L2表达水平迅速降低 并维持在一个低水平 可见HOX11L2的表达水平可作为MRD检测的标志 59 NOTCH1基因突变 NOTCH1信号对CLP commonlymphoidprogenitors 向T细胞定向以及前T细胞受体复合物组装是必须的35 50 T ALL患者存在此基因突变伴NOTCH1基因突变的成年T ALL患者预后较差 60 NOTCH1基因突变 生存曲线 61 BCR ABL t 9 22 q34 q11 90 CML患者BCR ABL融合蛋白 p210 的酪氨酸蛋白激酶活性较正常ABL高 可能是BCR对ABL激酶活性调节区的作用所致由于 5 CML患者为隐匿性Ph染色体 因此无Ph染色体CML患者还需使用更灵敏的分子检测手段如FISH或RT PCR检测BCR ABL融合基因RT PCR还能区分e1 a2和b2 a2 b3 a2二种BCR ABL转录本 从而区分ALL患者与CML急淋变患者 进而分别对两种不同患者采用不同的治疗方案 CML 62 BCR ABL 巢式RT PCR检测BCR ABL融合基因用于CML移植患者移植后MRD监测 可在患者血液学复发前的6 24个月骨髓检测就呈阳性 RQ PCR还能动态观察患者治疗后BCR ABL转录本水平变化情况 反映疗效 63 GATA2基因突变 调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子 维持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力CML急变患者中新发现GATA2基因突变 而CML慢性期 加速期 AML M1 M7 MDS ALL CLL 淋巴瘤和骨髓瘤患者 以及正常对照均未发现该突变 可见GATA2基因突变仅与CML急变相关 是CML疾病进展过程中的获得性突变 总发生率为12 5 5 40 且均造成CML急粒单变GATA2基因突变与CML患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明 64 JAK2基因突变 Januskinase2此基因突变主要见于MPD和MDS 另可存在于部分AML尤M2突变为V617F突变去除了JAK2JH2负性调控 导致该基因的持续活化 赋予细胞增殖存活优势JAK2可成为靶向