基因工程工具酶教学PPT.ppt

1 40 限制性核酸内切酶 dna聚合酶 连接酶 核酸酶 基因工程的工具酶 2 40 核酸酶 nucleases 核酸外切酶2 核酸内切酶 3 40 dna分子糖 磷酸主键的破坏称为切口 nick dna分子中核苷酸缺失称为缺口 gap 连接修复3 端羟基和5 端磷酸基团 形成3 5 磷酸二酯键 连接酶dnaligase t4噬菌体dna连接酶 4 40 t4 dna连接酶 t4 dnaligase 来源于t4噬菌体感染的大肠杆菌 连接双链dna上的单链口 nick 亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端 连接平头双链dna速度很慢 在高浓度的底物和酶的作用下方可进行 分子之间的连接 反应条件 ph为7 5 7 6 平端连接用20 25 粘端连接用12 左右 use 5 40 animationoftheligationprocess whenthestickyendsoftwodnafragmentscometogetherandhydrogenbondthroughthea tandg cpairing theenzymeligasewillformcovalentbondsbetweenthetwofragments 6 40 thespecificcuttingandligationofdna ecori dnaligase ecoristickyend ecoristickyend 7 40 dna聚合酶 以dna为模板合成dna rna聚合酶 以dna为模板合成rna 逆转录酶 以rna为模板合成dna 聚合酶 polymerase 8 40 大肠杆菌dna聚合酶i 大肠杆菌dna聚合酶i klenow片段 t4dna聚合酶 t7dna聚合酶 taqdna聚合酶 反转录酶 dna聚合酶 9 40 一 大肠杆菌dna聚合酶i 1三种酶活性 1 dna聚合活性 dttp 3 1 聚合反应具有方向性 5 3 2 dna聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合 只能在一段寡核苷酸的3 oh逐个添加脱氧核苷酸 使核苷酸链不断延长 10 40 3 3 引物 11 40 2 核酸外切酶活性 12 40 5 3 2应用 1 切口移位法标记dna在dnase的作用基础上产生链内切口 应用此酶的5 3 聚合酶活性和5 3 外切核酸酶活性的同步联合反应 使切口沿dna链从5 端向3 端移动 若用于聚合反应的原料dntp带有放射性核素 32p 就能使生成的双链带有标记物 13 40 14 40 5 3 5 3 2 3 粘端的末端标记先利用此酶的3 5 外切核酸酶活性 切除凸出的3 粘端 形成5 凸出粘端 再以其5 3 聚合酶活性使其补平 在高浓度的dntp条件下 使3 端的外切反应与dntp的搀入反应达到平衡 若dntp中有放射性标记的核苷酸 即可使产物成为3 末端带标记的dna 15 40 裂解变性 显影 16 40 3合成cdna的第二链 cdna 5 3 5 3 17 40 5 3 聚合酶活性 催化单核苷酸到dna3 oh端 3 5 外切酶活性 从游离的3 端降解单核苷酸 5 3 外切酶活性 从游离的5 端降解双链dna成为单核苷酸 大肠杆菌dna聚合酶i e colidnapoli 1 随机引物标记核酸探针2 5 粘端补平或3 端标记3 合成cdna的第二链4 dna序列分析5 3 端的末端标记 应用 18 40 小片段 n端 c端 大肠杆菌dna聚合酶i 19 40 蛋白酶降解dna聚合酶i获得其大片段称为klenow片段 只有5 3 聚合酶活性 3 5 外切酶活性 use 催化dna切口平移反应 制备探针对dna分子进行末端标记 20 40 催化以rna为模板的dna聚合反应 催化合成出互补dna cdna 可构建cdna文库 use complementarydna 二 反 逆 转录酶 rna依赖 指导的dna聚合酶 21 40 催化dntp dna分子中3 oh端 给载体或cdna加上互补的多聚体尾巴 dna片断3 末端标记 在mg2 条件下 选择3 oh端单链dna为引物加成核苷酸 在co2 存在的条件下 选择3 oh端双链dna为引物加成核苷酸 形成多聚核苷酸尾 末端转移酶 tdt 5 p 3 ho oh3 p5 tdt mg2 datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaaaoh3 p5 不需要模板的dna聚合酶 随机掺入dntps 22 40 5 p 3 ho oh3 p5 tdt co2 datp 5 p 3 hoaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaoh3 p5 5 p 3 ho oh3 p5 tdt co2 datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaaaaaoh3 p5 aaaaaaaaaaa 23 40 催化切除dna rna和dntp上的5 磷酸基团 切除5 磷酸防止自身连接标记前去除5 磷酸 use 5 p dna5 oh dna pi5 p rna5 oh rna pi 碱性磷酸酶 去除5 p 常用的碱性磷酸酶 细菌碱性磷酸酶 bacterialalkalinephosphatase bap 小牛肠碱性磷酸酶 calfintestinalalkalinephosphatase cip 24 40 use 标记dna链的5 端连接反应中磷酸化 将ntp的 磷酸转移到ds ssdna rna的5 oh 来源于t4噬菌体感染的大肠杆菌 t4 多核苷酸 磷酸 激酶 t4 polyn