（发酵工程专业论文）维生素c发酵营养与环境条件优化.pdf

摘要 摘要 维生素c - i - 业发酵中普通生酮基古龙酸菌( k e t o g u l o n i g e n i u mv u l g a r e ，俗称小 菌) 在其伴生菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ，俗称大菌) 的作用下，利用自身的酶系将l 山梨糖转化为维生素c 的前体2 酮基l 古龙酸( 2 k l g ) 。本论文在实验室规模以 细胞和2 k l g 的高产量、高得率和高生产强度为研究目标，对2 k l g 分批发酵过 程中k e t o g u l o n i g e n i u mv u l g a r e 和b a c i l l u sm e g a t e r i u m 的营养与环境条件进行了系 统优化，主要研究结果如下： ( 1 ) 分析了添加金属离子对细胞生长和2 k l g 合成的影响，发现仅f e 3 + 、m n 2 + 和 m 9 2 + 能促进细胞生长或产酸，确定了单独添加时的最佳浓度。以2 k l g 产量为目 标函数，建立二次多项式数学模型，发现当f e 3 + 、m 孑+ 、m n 2 + 浓度分别为o 2 1 m m o l l 、4 2 3m m o l l 和9 9 8m m o l l 时，2 - k l g 产量达到6 5 1g l ，与优化前比较， 提高了1 4 4 4 。 ( 2 ) 不同溶氧浓度对2 k l g 分批发酵的影响有较大差异，通过研究不同溶氧水平 条件下2 k l g 发酵的各种参数变化过程曲线及溶氧对2 k l g 合成关键酶活性的 影响，发现高溶氧水平( d 0 9 0 ) 适合菌体生长，2 - k l g 积累情况较差。而低溶氧 水平( d 0 5 0 ) 菌体生长情况逊于高溶氧水平，但更适合菌体产酸。 ( 3 ) 提出了分阶段供氧模式，即在整个发酵过程中采用0 2 0h 控制较高的d o ( 9 0 ) ，2 0h 至发酵结束降低d o 至5 0 的方式进行分批发酵。2 - k l g 产量最大值达 到5 8 7g l ，分别是d 0 9 0 、7 0 和5 0 时的1 4 6 、1 2 3 和1 1 7 倍。发酵强度为 o 9 2g l h ，分别是d 0 9 0 、7 0 和5 0 时的o 9 6 、1 0 6 和1 2 3 倍。表现出较好的 发酵状态。测定了分阶段供氧模式不同时期的体积传质系数钆a ，为工业放大提 供一定的理论依据。 ( 4 ) 确定了足v u l g a r e 与b m e g a t e r i u m 单独培养时适宜的菌龄，即kv u l g a r e 3 1 3 2h ，b m e g a t e r i u m 为8h 。确定了接种量1 0 ( v v ) ，接种比例1 ：1 为kv u l g a r e 与b m e g a t e r i u m 单独培养时最适的接种量与接种比例。 ( 5 ) 提出两阶段p h 控制策略：发酵o 16h 控s e j p h8 0 ，发酵16h 后切换至p h6 0 并 保持到发酵结束。分阶段p h 控制策略的实施，可以进一步促进k f g 口，p 生长、 提高2 k l g 的合成能力同时缩短发酵周期。 江南大学硕士学位论文 关键词：2 酮基l 古龙酸，k e t o g u l o n i g e n i u mv u l g a t e ，b a c i l l u sm e g a t e r i u m ， 发酵条件优化 a b s t r a c t a b s t r a c t k e t o g u l o n i g e n u mv u t g a r e a n db a c i l l u s m e g a t e r i u m w e r ec o - e x i s t e da n d c o - g r o w t hi nt h ee s t a b l i s h e di n d u s t r i a lp r o c e s so fv i t a m i ncp r o d u c t i o n a m o n go f t h e m ，kv u l g a r e , ag r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a ，c o u l dc o n v e r tl - s o r b o s ei n t oh i g ht i t e ro f 2 - k e t o - l g u l o n i ca c i d ( 2 - k l g ) ，t h ep r e c u r s o ro fv i t a m i nc i nt h ec u l t u r eb r o t h ，晰也 t h eh e l po f 丑m e g a t e r i u i nt h i st h e s i s ，t h en u t r i t i o n a la n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s f o rh i g ht i t e r , h i g hy i e l sa n dh i g hp r o d u c t i v i t yo f2 - k l ga c c u m u l a t i o nw e r ec a r e f u l l y i n v e s t i g a t e d ，a n dt h em a i nr e s u l t sw e r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： ( 1 ) i nt h ef i r s to p t i m i z a t i o ns t e pt h ei n f l u e n c eo fs i xm e t a li o n sw a se v a l u a t e d u s i n gaf r a c t i o n a lf a c t o r i a ld e s i g n f e 3 + ，m g + ，m n 2 + i n f l u e n c e dv i t a m i ncp r o d u c t i o n p o s i t i v e l y t h e n ，t h ep a t ho fs t e e p e s ta s c e n ta n d t h eb o x b e n h n k e nd e s i g nw e r eu s e d f o rf u r t h e ro p t i m i z a t i o no nt h e s et h r e ef a c t o r s t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n so ft h e v a r i a b l e sw e r ed e t e r m i n e da s ：f e 3 + ：0 2 1m m o l l ，m n 2 + ：9 9 8m m o l l ，m 9 2 + ：3 9 3 m m o l l u n d e rt h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n , t h ey i e l do ft h e2 - k e t o - l - g u l o m ca c i d i n c r e a s e db y14 4 4 ( 2 ) t h em o d eo fo x y g e nc o n c e n t r a t i o nc o n t r o li sa ni m p o r t a n tf a c t o rf o rb a t c h 2 - k l gf e r m e n t a t i o n i tw a ss h o w nt h a th i g hl e v e lo fo x y g e nc o n c e n t r a t i o ni m p r o v e d c e l lg r o w t hb u ti n h i b i t e d2 - k l gy i e l d l o wl e v e lo fo x y g e nc o n c e n t r a t i o nw a s o p p o s i t et ot h eh i g hl e v e l ( 3 ) 1 1 1 ee f f e c to fo x y g e nc o n c e n t r a t i o n , v a r i e df r o md 0 5 0 t od 0 9 0 ，o nt h e b a t c hf e r m e n t a t i o no f2 - k l gw a si n v e s t i g a t e d o w i n gt ot h ed i f f e r e n c eo c c u r r e di n t h eo p t i m a lo x y g e nc o n c e n t r a t i o nf o rc e l l g r o w t h a n d2 - k l gp r o d u c t i o n b y t h o r o u g h l ya n a l y z i n gt h ek i n e t i c so fb a t c h2 - k l gp r o d u c t i o nu n d e rd i f f e r e n td o ，a t w o - s t a g eo x y g e nc o n c e n t r a t i o nc o n t r o ls t r a t e g y , i nw h i c ht h ed ow a sk e p ta t9 0 d u r i n gt h ef i r s t2 0h o u r so fc u l t i v a t i o n ，f o l l o w e db yas h i f tf r o m9 0 t o5 0 ，t h e n m a i n t a i n e da t5 0 u n t i lt h ee n do ft h ec u l t i v a t i o nw a sd e v e l o p e di no r d e rt oe n h a n c e t h ep r o d u c t i o no f2 k l gn l er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e2 一k l gp r o d u c t i o nw a s5 8 7 g l ，w h i c hw a sr e s p e c t i v e l yi n c r e a s e d1 4 6 ，1 2 3a n d1 17t i m e st h a nt h a ta td 0 9 0 ， 7 0 a n d5 0 ，a n d2 - k l gp r o d u c t i v i t yw a si n c r e a s e d0 9 6 ，1 0 6a n d1 2 3t i m e st h a n t h a ta ta b o v et h r e eo x y g e nc o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n e d 甩au n d e rt w o s t a g eo x y g e n c o n c e n t r a t i o nc o n t r o ls t r a t e g y , p r o v i d e dac e r t a i nd e g r e eo fa m p l i f i c a t i o nt h e o r yf o r i i i i n d u s m j 江南大学硕士学位论文 ( 4 ) 1 h eo p t i m a li n d i v i d u a lc e l la g eo fkv u l g a r ea n db m e g a t e r i u m w e r ed e t e r m i n e d ， t h es t o c ki n c u b a t i o nt i m eo ff o r m e ro n ea n dl a t e ro n ew a s31 - 3 2ha n d8hs e p a r a t e l y t h e o p t i m a lc o n d i t i o nw a s a sf o l l o w ：i n o c u l u ms i z e10 ，i n o c u l u mr a t i o1 ：1 ( 5 ) at w o s t a g ep h c o n t r o ls t r a t e g yw a sd e v e l o p e d ，i nw h i c ht h ep hw a sk e p ta t8 0 d u r i n gt h ef i r s t16h o u r so fc u l t i v a t i o n ，f o l l o w e db ya s h i f tf r o m8 0t o6 0 ，t h e n m a i n t a i n e da t6 0u n t i lt h ee n d ，i no r d e rt oe n h a n c et h ep r o d u c t i o no f2 一k l gi tw a s s h o w e dt h a tt h ep hc o n t r o ls t r a t e g yc o u l di m p r o v e dc e l lg r o w t h ，2 - k l gy i e l da n d s h o r t e nf e r m e n t a t i o np e r i o d k e y w o r d ：2 - k e t o - l - g u l o n i c ea c i d ，k e t o g u l o n i g e n i u mv u l g a r e ，b a c i h u sm e g a t e r i u m ， o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 纪觊 日 期： 2 0 07 易膳 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 丝鱼地 导师签名： 日 期： 第一章绪论 1 1 概述 1 1 1 维生素c 的性质 第一章绪论 维生素c c ) 又名l 抗坏血酸( l a s c o r b i ca c i d ，l a a ) ，它是含有内酯结构的 水溶性维生素，其特点是具有可解离出旷的烯醇式羟基，因而其水溶液有较强的 酸性。维生素c 可脱氢而被氧化，有很强的还原性。氧化型维生素c 还可以接收 氢而被还原。维生素c 还有不对称碳原子，具有光学异构体，自然界存在的有生 理活性的是l 型抗坏血酸。 c i h 2 0 h h c m o h o h oo h 图1 1 维生素c 结构示意图 f i g u r e1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f v i t m i nc 1 1 2 维生素c 的用途 维生素c 作为维生素及抗氧化剂广泛用于制药和食品工业中，表1 1 所示u 】。 目前，维生素c 总产量的5 0 用于医疗上补充维生素c 及医药制剂，2 5 用于食 品和饮料产业，1 0 用于饲料产业。维生素c 是一种人体必需维生素，自然界的 大多数动物可以利用葡萄糖以合成维生素c ，人类、灵长类动物和豚鼠由于体内 缺少合成维生素c 的古洛糖酸内酯氧化酶( a l d o n o l a c t o n ed e h y d r o g e n a s e o x i d a s e s ) ， 所以不能合成维生素c ，而必须依赖食物供给。但是维生素c 在体内储存甚少， 因而必须经常供给。 江南大学硕士学位论文 表1 1 维生素c 及其衍生物的主要用途 t l b l e1 1a p p l i c a t i o no fv i t a m i nca n di t sd e r i v a t i v e s 用途 示例 制药工业 食品工业 饮料工业 化妆品工业 饲料工业 生化试剂 用于治疗乙型脑炎惊厥、特发性血小板减少性紫癜、动脉硬化、病毒性心肌炎；用 于治疗癌症；用于治疗继发性红皮病，抗皮肤过敏等；治疗亚硝酸中毒、支气管哮 喘和急性病毒性肝炎； 防止氧化褐变：改变食品风味；食品护色；防止罐壁腐蚀；防止油脂氧化； 作为添加剂具有防腐保鲜功能； 用于治疗黄褐斑；清除自由基，延缓衰老； 用于提高动物抗应激能力，增强免疫功能，促进骨骼发育，提高繁殖率； 用于磷的测定。 1 1 3 维生素c 的市场情况 维生素c 的工业化生产已有7 0 多年的历史。目前，巴斯夫、罗氏制药和中 国的四大维生素c 生产企业( 石药集团、华北制药集团维尔康制药、东北制药集 团和江山制药) 形成了三足鼎立的竞争格局，占据着维生素c 市场的主导地位。 2 0 0 4 年全球产量有近1 2 万t 。二步发酵工艺是我国独创的维生素c 生产工艺， 曾居世界领先水平。从1 9 9 8 年开始出口量逐渐提高，如1 9 9 8 年出口2 3 5 万吨， 1 9 9 9 年3 0 3 万吨，2 0 0 0 年3 3 万吨，2 0 0 1 年3 9 万吨，2 0 0 2 年4 3 万吨。目前 我国的v c 生产规模占世界总生产规模的1 3 1 2 ，是我国医药领域的一项支柱 产业【2 1 。采用发酵法生产维生素c 一般不能直接合成v c ，而是合成v c 的前体 2 酮基l 古龙酸( 2 i c l g ) ，2 - k l g 再经过内酯化、烯醇化反应生成维生素c 。 二步发酵工艺包括两个发酵步骤，第一步是在醋酸菌( 如生黑醋杆菌或氧化葡萄 糖酸杆菌等) 的作用下d 山梨醇氧化为l 山梨糖( 醇糖转化) ，在莱氏法中已得到 广泛应用，其转化机制目前国外已经研究得很清楚。第二步微生物发酵法是中 国科学院微生物研究所与北京制药厂合作【3j 在2 0 世纪7 0 年代建立起来的，是 在一种混合茵系的作用下将l 山梨糖进一步氧化为v c 的重要中间体2 酮基l 古龙酸( 俗称糖酸转化) 。上述混合菌系包括两种微生物，直接负责山梨糖生物 氧化的微生物俗称小菌，最初曾被鉴定为氧化葡萄糖杆菌( g l u c o n o b a c 胞r o x y d a n s ) ，2 0 0 1 年u r b a n c e 4 j 等经系统分类学研究对其分类位置重新作了确定， 该菌被更名为普通生酮基古龙酸菌( k e t o g u l o n i g e n i u mv u l g a r e ) 。另一种微生物俗 称大菌，本身不能转化山梨糖，作为伴生菌起到辅助小菌生长和产酸的作用。 许多微生物具有这种伴生菌的作用，生产中多使用芽孢杆菌。 2 第一章绪论 1 2 维生素c 合成的国内外动态 1 2 1 莱氏法 1 9 3 3 年，德国化学家r e c h s t e i n 发明了“莱氏法” 5 1 ，其主要工艺流程见图1 2 。 “莱氏法”是一种化学合成与一步发酵相结合的生产方法，生产工艺路线成熟， 生产原料便宜易得，产品质量好，收率高。因此至今瑞士的r o c h e 、日本的t a k e d a 、 德国的e m e r k 和b a s f 等国外生产维生素的主要公司均采用该方法。但该方法也 有不足之处，尽管一分子的葡萄糖应该被转化为一分子的v c ，但即使随着近年 来化学工艺的改进，“莱氏法”合成v c 的实际转化率大约为5 0 ，同时伴随着如 生产工序多、过程长，难以连续化操作；使用大量有毒、易燃化学药品，造成环 境污染等一系列问题。 自二十世纪6 0 年代以来，各国科学家对“莱氏法”的改进做了大量工作，试 图简化或以生物氧化法替代以化学合成为主的“莱氏法 ，目前已取得了许多重 要成果。如“艾杜糖酸转化法 、“l 古龙酸转化法”、“山梨醇直接发酵法、 “葡萄糖直接发酵法”、“山梨酮转化法 等，从利用生物转化生产逐步向完全 生物转化发展。 h 口葡萄糖i d _ 山梨醇 生黑醋酸杆菌丙酮 三- 山梨糖1 i i 一双丙酮也- 山梨糖 一双丙酮2 酮基古龙酸旦2 酮基也古龙酸j 墼维生素c 图1 - 2v c 的莱氏合成路线 f i g u r e1 2 “r e c h s t e i n s y n t h e s i sp a t h w a yo f v c 1 2 2 从葡萄糖一步发酵生产2 - k l g 以葡萄糖作底物生产2 k l g 的途径，先由欧文氏菌( e r w i n i as p ) 转化葡萄糖 生成中间产物2 ，5 二酮基d 一葡萄糖酸( 2 ，5 d k g ) ，再经棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) 最终转化为2 酮基l 古龙酸( 2 k l c o ) ，称为“葡萄糖串联发酵法”( 图1 - 3 ) 。研究 发现葡萄糖在单个微生物内是经过细胞膜上一系列的不依赖n a d p 的脱氢酶催 化，经过d 葡萄糖酸( 简称g a ) 和2 酮基d 葡萄糖酸最后才氧化为2 ，5 d k g ， 发酵液经s d s 处理后直接被一株突变的棒杆菌再发酵生成2 k o a ，在1 0l 的罐上 总转化率可达8 4 6 【6 】。但是该方法周期较长，中间产物2 ，5 d k g 不稳定对热不稳 定【7 1 。用s d s 处理降低菌数时要损失1 5 的2 ，5 d k g ，另一方面在代谢途径上需 经一个比2 k l g 氧化态更高的2 ，5 d k g ，因而效率低，成本高。与生产实践还有 江南大学硕士学位论文 一定的距离。 d 一葡萄糖坠奎垦堕，2 ，5 二酮基d 一葡萄糖酸墅干三2 酮基一三古龙酸 图1 3 葡萄糖“串联发酵法”合成2 k l g 反应途径 f i g u r e1 - 3r e a c t i o np a t h w a yo fg l u c o s e - f e r m e n t a t i o ns e r i e s ”s y n t h e s i so f2 - k l g 8 0 年代后期，采用重组d n a 技术，在“葡萄糖串联发酵”途径基础上构建 相应的代谢工程菌，实现利用葡萄糖一步发酵直接产生2 k l g ( 图1 4 ) 。 口葡萄糖兰坚已2 酮基z 古龙酸 图1 - 4 葡萄糖“一步发酵法”合成2 - k l g 反应途径 f i g u r e l - 4r e a c t i o np m h w a yo f g l u c o s e - “o n e s t e pf e r m e n t a t i o n s y n t h e s i so f 2 - k l g 1 9 8 5 年a n d e r s o n 掣8 】人纯化和鉴定了棒杆菌a t c c 3 1 0 9 0 中2 ，5 d k g 还原酶i ， 分析了该酶n 末端的4 0 个氨基酸序列，人工合成兼并探针，用原位杂交法从部分 基因文库中筛选出了不完全的一个基因片段。然后，他们用已知片段为探针克隆 到完整的基因，插入能在大肠杆菌中有效作用的t 印启动子和人工合成的核糖体 结合位点( r b s ) ，使之在前一步发酵产生菌欧文氏菌( e h e r b i e o l a a t c c 2 1 9 9 8 ) 中有效表达，该法在1l 发酵罐中生成2 k l g 的收率可达3 3 3 ，但由于基质浓度 较低，仅获得1g l 的产物。1 9 8 7 年，h a r d y 等【9 】用类似方法从另一株棒杆菌s h s 7 5 2 0 0 1 中纯化得到2 ，5 d k g 还原酶i i ，进行氨基酸测序并合成探针，一次性从基 因组中克隆了另一个2 ，5 d k g 还原酶基因，用p 1 启动子在柠檬欧文氏菌( e c i t r e u s s h s 2 0 0 3 ) 中表达，1 l 罐发酵转化率为4 9 4 ，7 2h 发酵可获得2 0g l 的2 k g a 。 1 9 8 6 年，l a z a r u s 1 0 】揭示了欧文式杆菌中由葡萄糖到2 k l g 的代谢途径( 图1 5 ) ： 葡萄糖被位于欧文式杆菌细胞周质空间的3 个膜结合脱氢酶转化为2 ，5 d k g ，这 个过程有可能还与细胞色素c 反应链相关。第一个酶是葡萄糖脱氢酶g d h ，产物 为葡萄糖酸( g a ) ：第二个酶是葡萄糖酸脱氢酶g a d h ；产物为2 酮基d 葡萄糖 酸( 2 k d o ) ；第三个酶是2 k d g 脱氢酶2 k d g d h ，产物为2 ，5 d k g 。2 ，5 d k g 被 转运至细胞质中，被重组表达得2 ，5 d k g 还原酶还原为2 k l g 。 对于该途径我国学者也进行了大量的研究工作【11 - 1 3 】，尹光琳等【1 3 筛选诱变得 到欧文氏菌s c b l 2 5 和棒杆菌s c b 3 0 5 8 ，实现了从葡萄糖串联发酵生成2 - k l g 的 成功。在此基础上，采用p c r 技术，从棒杆菌s c b 3 0 5 8 克隆到两个2 ，5 d l g 还原 酶基因，其序列与前面报道的基本一致，但略有突变，其, 9 2 ，5 d k g 还原酶i 在 p 1 启动子和c 1 8 5 7 m 蛋白控制下，通过提高温度诱导在大肠杆菌d h 5 a 和欧文氏菌 s c b l 2 5 中表达的酶比活力相当高。2 ，5 d k g 还原酶i i 基因在t 7 启动子控制下也在 大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中成功地高表达，表达的酶比活更高。 4 第一章绪论 e r w i n i ac e l l s 图1 - 52 - k l g 在欧文氏菌内的合成示意图 f i g u r e1 - 5p a s s w a yo f2 - k l gi ne r w i n i as p p 1 ，g d h ；2 ，g a d h ；3 ，2 - k d g d h 利用构建的基因工程菌从葡萄糖直接发酵生成2 k l g ，工艺虽然简单，但是 目前的转化率还不能另人满意，离大规模工业生产还有较大的差距。 1 2 3 由山梨醇直接转化2 - k l g 在“莱氏法 路线的第一步中，d 葡萄糖高压加氢生成d 山梨醇。山梨醇可 直接发酵生成2 k l g 。能完成该转化的菌株有醋酸杆菌以c t o b a c t e rs p ) 、葡萄糖 酸杆菌( g l u c o n o b a c t e rs p ) 、假单孢杆菌( p s e u d o m o n a ss p ) 等【1 4 - 1 5 ，它们也可作为 v c - - - 步发酵的第一步菌。1 9 7 5 年m a k o v e r 等1 1 6 j 对生黑葡萄糖酸( g 肌p 肠刀d 朗以螂) 和恶臭假单胞菌( p p u t i d e ) 的研究表明，该步转化遵循“l 山梨酮途径 ( 图1 6 ) ， 经过许多学者多年探索，该途径已经研究得比较清楚。 在葡萄糖杆菌中负责糖酸转化的脱氢酶主要有两种，l 山梨糖脱氢酶( s d h ) 可催化l 山梨糖转化为l 山梨酮，后者在l 山梨酮脱氢酶( s n d h ) 作用下进一步 氧化为2 k l g 。1 9 9 1 年s a ga _ w a 等【1 7 j 从生黑葡萄糖酸杆菌( g m e l a n o g e n u s ) 的突 变株u v 4 0 中分离纯化了膜结合的l 山梨糖脱氢酶。该酶由4 个分子量为5 8 k d 的相 同亚基组成，以f a d 作为电子受体，对l 山梨糖有很高专一性。h o s h i n o 等【l 8 ，1 9 j 分离纯化了l 山梨酮脱氢酶，该酶主要存在于胞浆中，由4 个分子量5 0 k d 的相同 亚基组成，以n a d p 为电子受体。s h i n j o h 等 2 0 , 2 1 】将醋杆菌膜结合的山梨酮脱氢酶 克隆入氧化葡萄糖杆菌，使两步转化在氧化葡萄糖杆菌中完成。但是构建的工程 菌发酵2 k l g 的产量较野生型的生黑葡萄糖酸杆菌( g m e l a n o g e n u s ) u v l 0 并没有 较大的提高。 江南大学硕士学位论文 。 c y t o p l a s m i c s l d hs d hd h m e m b r a n e ? 朗? s r ：l - s o r b o s er e d u c t es n r ：l - s o r b o s 孤cr 酣u c e 9 “：擎 s n u h ：r b 。s o n ed e h y d r 。g 舢ek g r ：2 k e t o - l - g u l 。t l a t el e d u c t a s e 。i s l d h ：d - s o r b i t o ld e h y d r o g e n a s es d h ：l - s o r b o s ed e l a y d t o g e n a s e c o ，k t p 1 d h = 卜试o n i cd e h y d r o g 。h a s 。 图卜6 葡萄糖杆菌“山梨酮途径”代谢图 f i g u r el 6m e t a b o l i s mg r a p ho fs o r b o n o s ep a t h w a y 氧化葡萄糖酸杆菌( g o x y d a u s ) t 1 0 0 在含有质量分数为5 d 山梨醇发酵培 养基中进行转化，仅仅获得2 k l g7 叽。经过诱变技术企图获得转化能力更高 的突变株，但未获成功，诱变结果转化率低于1 3 。1 9 9 7 年s a i t o 等【2 2 】分离了氧化 葡萄糖酸杆菌t 1 0 0 中的山梨糖脱氢酶及山梨酮脱氢酶，经s d s p a g e 电泳转膜， 测定氨基酸序列。根据测定结果设计兼并引物作探针，从葡萄糖酸氧化杆菌 ( g o x y d a u s ) t - 1 0 0 基因组文库中筛选相关基因。选取一株阳性克隆，以e e o ri 和 s a li 酶切，回收大约6k b 片段，克隆x p u c l 9 。分析测序结果表明：长4 6 2 4b p 的基因片段编码2 个阅读框架，并且有所重叠。两个基因组成一个操纵子，第一 个基因编码由4 9 8 个氨基酸组成的山梨酮脱氢酶，第二个基因编码由5 3 1 个氨基酸 组成的山梨糖脱氢酶。 氧化葡萄糖酸杆菌g 6 2 4 能耐受高浓度的d 山梨醇，并能将含有2 0 的山梨醇 在3 0 o c 下发酵1 0h 定量地转化成l 山梨糖。但是该菌存在k g r 活性，可将终产物 2 - k l g 还原为l 艾杜酸。s a i t o 等【2 2 】通过构建含有山梨糖脱氢酶基因的穿梭载体 p s d h 15 5 转化至l 山梨糖脱氢酶突变株g o x y d a n sg 6 2 4 中，同时用大肠杆菌t u f b 启 动子替换原始启动子；通过化学突变抑制k g r 活性，阻断l 艾杜酸途径。在含有 1 5 d 一山梨醇培养基的3 0l 发酵罐中最终2 k l g 合成量达至i 0 1 3 0g l 。重组氧化葡 萄糖酸杆菌合成2 k l g 途径见图1 7 。 s l d hs d h s n d hk g r d 山梨醇一l 山梨糖卜l 山梨酮一2 酮基l 古龙酸一l 艾杜酸 图1 7 重组氧化葡萄糖酸杆菌的2 k l g 生物合成途径 s l d h ：d 一山梨醇脱氢酶；s d h ：l 山梨糖脱氢酶；s n d h ：l 山梨酮脱氢酶；k g r ：2 - k l g 还原酶 f i g u r e1 - 7b i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f2 - k l ai nr e c o m b i n a n tgo x y d a n s s l d h ：d - s o r b i t o ld e h y d r o g e n a s es d h ：l - s o r b o s ed e h y d r o g e n a s e s n d h ：l - s o r b o s o n ed e h y d r o g e n a s ek g r ：2 - k e t o - l g u l o n a t er e d u c t a s e 6 第一章绪论 1 2 4 从山梨醇二步发酵转化2 - k l g 从山梨醇二步发酵转化2 k l g 是由中国科学院微生物研究所和北京制药厂 合作于上世纪7 0 年代初发明的【3 1 。他们从5 3 2 7 株细菌中筛选至0 1 6 4 5 株可利用l 山 梨糖的细菌，经过多次纸层析分析筛选，得到3 株能利用l 山梨糖产生2 k l g 且 产酸量在1g l 以上的菌株。其中混合菌株n 11 9 7 a 产酸量最高。纸层析分析结果 其发酵产物单一，摇瓶发酵产量可达1 0g l 。进一步研究表明，参与此过程的是 两种菌，而且只有两种茵在一起混合培养才能正常产酸。经过菌种鉴定，一种为 假单孢菌( p s e u d o m o n a ss 护砌幻) ，俗称大菌，不能产酸，但能为另一种菌的生长传 代提供条件。另一种为氧化葡萄糖酸杆菌( g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s ) ，可以产酸但 单独不能传代生长。在此后的数年时间内，我国的科研工作者为“二步发酵法 这一工艺在生产实践中的应用做了大量科研工作。自1 9 7 6 年6 月通过中试鉴定后， 已逐渐在全国范围内推广使用。目前“二步发酵法”是唯一成功应用于工业生产 的微生物转化法，已在中国、欧洲、日本和美国申请了专利，并于1 9 8 6 年成功向 瑞士的h o f f m a n n l a r o c h e 公司进行了技术转让，取得了很大的经济效益。“二 步发酵法”工艺路线如图1 8 。 葡萄糖坐山瓣竺塑山梨糖告2 聪- l - 蝴器维蟓 图1 8 维生素c “二步发酵法”工艺路线图 f i g u r e1 - 8r e a c t i o np a t h w a yo f t w o - s t e pf e r m e n t a t i o n s y n t h e s i so fv c 针对我国二步法发酵第二步需两种茵共同参与这一特性，国内学者在发酵工 艺和新技术运用上展开了大量的研究工作。魏东芝等【2 3 】研究了维生素c 二步发酵 过程的动力学，通过测定发酵中大小菌生长规律及机制和产物浓度的变化，建立 了简化的动力学模型，在一定程度上揭示了2 k l g 发酵系统的本质特征，为分析 发酵过程，指导生产及实现生产连续自动化奠定了基础。针对基质浓度不高的问 题，上海医药工业研究院采用流加糖及调控等手段增加基质浓度，提高了设备利 用率。华东化工学院生物工程系也对基质浓度、发酵罐氧浓度、p h 值等发酵行 为之间的协调定量关系进行了发酵罐的放大设计工作。李国才等【2 4 】研究了维生素 c 二步发酵中大小菌的比例关系对产酸的影响，分析了零级、一级、二级种子的 生长曲线，得出了各级种子的最适培养时间，零级种子培养的初始接种量及2 种 菌的接种比例。中国科学院沈阳应用生态研究所张忠泽等【2 5 j 建立的维生素c - - 步 发酵生态调节新工艺在3 0 0t 发酵罐中实施，发酵醇酸转化率提高5 ，达8 7 ， 该成果己通过鉴定，为国际领先水平。郭振勇和蒋宇扬【z 6 】从终产物降解的角度出 发对古龙酸还原酶( k g r ) 理化及酶学性质进行了研究。通过添加稀土元素抑制 7 江南大学硕士学位论文 k g r 活性，缩短维生素c 发酵时间，提高2 k l g 转化率。研究认为由于该酶的存 在而使2 k l g 的产量至少降低3 5 。生物新技术在维生素c - - 步发酵中的应用主 要涉及细胞固定化、原生质体融合和基因工程技术。赵划2 7 】纯化了2 酮基l 古 龙酸还原酶，并对其n 末端测序。g e n e b a n k 检索，发现它在肽段序列上是全新的。 利用k g r 肽段序列合成兼并寡核苷酸进行杂交筛选，得到了古龙酸还原酶基因片 段并进行了克隆和测序，为小菌的进一步基因改造奠定了基础。吕群燕等【2 副应用 单亲本灭活的原生质体融合技术构建了维生素c 产生茵系h 1 9 s 1 9 的“工程菌 。 李越中等【2 9 】采用k m 孙n 转化子( k m s t 5 ) - 与q 13 2 大菌( k m 5 s n 进行原生质体融合 亦获得可连续转化传代的小菌，但高产酸仍需与大菌搭配。2 0 0 1 年，u r b a n c e 等 经系统分类学研究对小菌的分类地位重新作了确定。该菌被命名为普通生酮基古 龙酸茵( k e t o g u l o n i g e ，n i u mv u l g a t e ) 。2 0 0 6 年，华北制药集团与病毒基因工程国家 重点实验室合作对普通生酮基古龙酸菌进行了全基因组测序p 。测序结果显示它 的复制、转录和翻译以及碳水化合物和能量代谢系统是完整的，而修复系统不完 全。其磷酸戊糖途径是利用l 一山梨糖时的主要的提供能量的途径。细胞固定化技 术在维生素c 生产中的研究也很活跃。由江苏食品研究所主持完成的固定化生黑 醋酸杆菌制备l 山梨糖技术通过了鉴定，每毫升凝胶球活菌数达1 2 1 0 1 0 个，转 化率为9 6 。中国科学院上海生物化学研究所和华东化工学院合作进行了大茵、 小菌的共固定研究工作。他们将假单胞菌和氧化葡萄糖酸杆菌分别固定在载体 上，然后混合用于l 山梨糖发酵，已取得一定的成果。李越中等1 2 9 j 采用聚乙烯醇 海藻酸钙包埋法对大小菌进行了共固定化。获得了高于游离菌的产酸量，并采 用种子液持续活化的方法使固定化细胞半衰期延长至1 0 批次。 1 3 本论文的主要研究内容 1 3 1 国内。二步发酵法一存在的问题 “葡萄糖串联发酵法 以及“一步发酵法 虽然技术先进、工艺简单，但 是由于中间产物不稳定以及基因工程菌转化率不高等一系列原因，距离实现工 业化还有很长一段距离。目前国内企业还是以“二步发酵法”为维生素c 生产 的主力方法，“二步发酵法 自投入工业生产以来虽经广大科研工作者不断优化 与创新，但仍存在理论基础和工业生产方面的一系列问题。理论基础方面存在 的主要问题为：混合发酵中大、小茵之间的关系：大菌促进小菌生长和产酸的 机制；混合菌转化l 山梨糖为2 - k l g 的代谢途径等。而工艺条件复杂、原料利 用率低、提取收率较低和能源消耗过大等问题也始终困扰着各大维生素c 生产 企业。 第一章绪论 1 3 2 本论文的主要研究内容 本课题研究内容为8 6 3 重点项目维生素c 发酵菌种改造和代谢工程技术 f 课题编号2 0 0 6 a a 0 2 0 3 0 3 ) 及十一五支撑计划维生素c 先进发酵优化与控制 技术研究( 课题编号2 0 0 7 b a l 4 6 8 0 2 ) 的一部分，旨在通过对维生素c 发酵过 程中的环境条件和营养条件进行研究，获得最佳的发酵条件优化条件，以达到 维生素c 发酵生产的高产量( 便于下游处理) 、高底物转化率( 降低原料成本) 和 高生产强度( 缩短发酵周期) 的相对统一。主要研究内容包括： ( 1 ) 采用单因素实验和响应面优化法研究了金属离子对大小菌发酵生产2 一k l g 的 影响，并确定了金属离子的最适添加浓度； ( 2 ) 比较分析不同溶氧浓度下2 - k l g 分批发酵动力学参数，提出提高2 - k l g 产 量、节约能源的最佳供氧模式，测定该模式下不同时期的体积传质系数虹a ，为 工业放大提供一定的理论依据； ( 3 ) 考察kv u l g a r e 与b m e g a t e r i u m 单独培养时的种子生长曲线，确定单独培 养时的最适接种量和接种比例； ( 4 ) 不同p h 控制方式对2 - k l g 分批发酵的影响有较大差异。考察不控制p h 条 件及p h5 0 8 0 范围内2 - k l g 分批发酵的各过程参数，提出提高2 - k l g 产量 的p h 控制策略。 9 江南大学硕士学位论文 2 1 菌种 第二章