（食品科学专业论文）免疫亲和净化高效液相色谱法测定粮食中镰刀菌毒素分析方法的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名 导师签名 时间： b 时间：z 穰盯 年i a6 日 年月留日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：彳匀 导师签名： 哆 时间：_ 卿年月g 日 时间：z f 年月g 日 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 呕吐毒素和t 一2 毒素是不同类型镰刀菌毒素的典型代表，它们广泛的存在于小麦、 大麦、玉米等谷物之中，是污染粮食的主要真菌性毒素。真菌毒素存在的广泛性、剧烈 的影响以及潜在的致癌性使得对于可能存在污染的主要食品和相关产品必须制定最大 允许限量的强制标准。因此，目前我国急需建立一个快速、准确、灵敏的毒素检测方法。 本课题主要采用目前国际先进的免疫亲和技术等前处理手段，以h p l c 法为测定方法， 建立简便易行，灵敏可靠的快速、准确定性、定量谷物中呕吐毒素( d o n ) 和t 一2 毒素 的高效液相色谱检测和质谱确证方法。 呕吐毒素方法为：样品用水提取，提取物通过免疫亲和柱进行富集和挣化，以c 1 8 柱为分离柱，乙腈+ 水( 1 + 9 ) 混合溶剂为流动相进行高效液相色谱分离和检测，利用 大气压化学电离质谱( a p c i ) 进行阳性结果的鉴定和确认。在小麦、大麦等样品中，本 方法在o 卜l o u g g 添加范围内的回收率大于8 0 ，相对标准偏差小于o 0 3 ，检出限为 o 1 u g g 。 t 2 毒素方法为：样品用甲醇+ 水( 8 + 2 ) 混合溶剂进行提取。提取物通过免疫亲 和柱进行净化，净化后的毒素与卜a n 和d m a p 进行衍生化反应，以c 1 8 柱为分离柱，乙 腈十水( 8 + 2 ) 混合溶剂为流动相，荧光检测器( 激发波长3 8 1 硼，发射波长4 7 0 衄) 进 行高效液相色谱分离和检测，利用大气压化学电离质谱( a p c i ) 进行阳性结果的鉴定和确 认。在小麦、大麦、大米、玉米等样品中，本方法在0 0 5 1 5 u g g 添加范围内的回收 率大于8 5 ，相对标准偏差小于2 2 ，检出限为o 0 0 5 u g g 。 1 关键词：h p l c ，眍吐毒素， 卜2 毒素，衍生化，免疫亲和柱 a 嚣s 融e f a 8 s 了然e 了 d o na n d7 r - 2t 0 捌曲i st h e 好i c a in l o d e lb yd i 妊b r e n tf u s a r i u m 。t h e i re x t e n s i v ee x i s t e n c e i s 也e m 茁牲鼬垂专o x 氇t 搬l p o l l 啦嚣靠| b 砥遮e o 精翮穗雒w k a 圭 b 磷e y 勰d 糖。i 糙确舀 t o 】【j ht h ee x i s t e te ) 舳i v e ，“o l a l ti n n l | e n c e 甜i dl a 托n tc 锄c e r - 销雌s i gm a k e st h ep o u u t i n g 艘l 主n i o 碡b c 氆e 毯g g e s tt oa 珏。擀c a p 姆稍如潮8 t c dp 嘲u c e s t a b l i s 渤髓ll 酝耄 臻芦s s 玲l e e x i s t e n c eo fc o m 口u l s i v es t 铂1 d 踟畦t b e 】f b r c ，也eo u rc o m m y 丑e o d s 姗du paf a s t ，a c c u 瑙l e 掇破i 船l l i g e n 主t o x 证e x 烈虹撤i 傩m 硇傩i 唧订y 耄oc 疆嬲垃y - 翻畦s 毒。奔em a i 垃y8 翻p 括 伽盯锄t l y 啦ei m m u n o a m n i 坶l 删 1 i it o 王l a n d l em e a n sb e f o r cw a i t i ，i m 慨h n j q i i l 珙髓。轧 t a k i n g 珊l ，cm e 娃谢躺t om g u 牌s eam e 畦l | 。d ，b u i 韬l l pas i m p l eg oe a s i 现试t e 珏i g e n t 甜e d i b i l i t 、ro f 蠡l s ta n da c c u r a t es c t d ei nd o 】q 锄dt _ 2t o x i n i 1 糟n l e 日1 0 do fd o ni s ：龇s a m p 重cw i 口n 如：l l w s 、釉畦罅墙哺e 毛w i 翻妇、 纛n g8t l l i 赴gt o p a s si 飙m u n o 捌船t op u r i 母1 柚【ec 1 8p m a r s e s 嚣协辩弘嘲瞳ep 豇l 犯a 协n i 城l e - w a 冬既( 1 + 9 ) m i ) 【sm e 血ga g e n t 如rf o l wt oc a f r yo nl i q l | i dm u t l i a l l yt h ec o l o rt a b l e 辅p 毒唿t e 姐de x a m 硒， 黼a k i n 辑u s eo f a p c i 重oc a r 搿o n 勰a 础翩薹i _ 嗯芏eo f 也em 硒戗l l i n e 粼蹑d e fr e s u l tw i 也c o i 正r m i nt h es a m p l e s ，s u c ha sw h e a ta 玎db a r l e y r 麝c o v e r i c s 丘o md i 爵a 薯b tc e i _ e 硝ss p i k e dw i m ) n 鑫tl e v e l s 捌浮n g 躺mo 。lt ol 妇g 缝蝴m o 辑魄m8 0 ，碱也叫a 畦v es t a n d 8 l d d e v i 丽o n so fl e s st h a n0 0 3 ，t h el i m i to fd l j t e c t i o nw a so 1 u g ，b a s e do nas i g r l a l - t o - n o i s e 燃i oo f 3 ：1 。 n 伦m l 。t l l o do fb 2t o x i ni s ：1 i h es 籼叩王ew i n 岫融w s 、i t hn l cm 蚰崾m 0 1 w a t e r ( 3 + 2 ) ， 蛾蛙匹糯w 遮鐾基巍i 矬壁沁p 畦豁抽艇瞰】l = 【o a | 夏i 珏主锋l op 越舅p f e - c 融翔l 撒嘲v 剐玉蛾o nw i 魄1 a n a n d 辨l c 埘m = f l u o r e s c e n c ed 神e c t i 彻f o r 由删nd 鼬就m i n 触o n 1 m c ec 18 衍l l s e sa st o s e 辨删e 委珏麟a 姆砥辅纠醐缎s 2 ) 蛹x s 糙端a g e 狂l 薹醣曩o w 毒oc 箍班y 嘴l i q 城d 瑚h t i l 硝1 yt l l ec o l o r 忸b l es e p 黻蕾l l e 觚de l m i n e ，瑚a i d n gu s eo fa p c it oc a r r yo na n 建堪b e | l 蛞c a 捃o f & 整橱s e 堪i f l e 黛臼妇r ! e s 落t 赫t ho 瞳l 蠡凇k h es a 翔瓣e s ，s 毛瑶ha sw l l e 8 熏矗藏d b 锄1 e y r e c o v 耐e s 丘o md i h 两删a 。r e a l s8 静揪e d 、砘t ht 二2t o x j l la tl e v e l s 瑚咀函gf o 玎10 0 5t o 1 5 u 黛w e 揩m o 群氇髓8 5 诚氇嘲矗v e 嘲耐翔畦如嘱a 童i 摊s 醴l e s s 酝硅2 3 ，莰e 溉t 。f 舶惦c 6 0 nw 黼o 0 0 5 u g ，b 舔e do nas i 卿l a l w t o n o i s er a 娃oo f 3 ：1 量诵州。岖： 咿l c ，o 渊，t 吨t o x i n ，0 e r i v a t i 鞠t i 帅， i 椰剐n f f i n i t y 2 沈阳农业大学硕士学位论文 刖罱 1 真菌毒素及其特点 真菌毒素是某些丝状真菌在适宜的温度和湿度条件下产生的具有生物毒性的次级 代谢产物，这屿产毒真菌主要是霉菌。产毒真菌污染食品后，在食品中产生真菌毒素， 会使食用者中毒。自然界中的真菌分布十分广泛，几乎所有的食品上都有可能有真菌生 存，也就存在着真菌毒素的威胁。在油料种子、水果、干果、肉类制品、乳制品、发酵 食品、动物饲料中均发现过真菌毒素，其中农产品特别是粮食作物极易受到污染，在人 们的食品中，玉米、大米、花生、小麦被污染的真菌毒素的种类是最多的。产毒真菌分 布于各级食物链，包括不丽纬度、甚至极地选域的产粮区。有数字表明，每年大约有 2 5 的农作物受到不同程度的真苗毒素的污染，这已经对农作物、家禽甚至于国民经济 产生深刻的影响( 白清云，1 9 9 5 ) 。据保守估计，由于真菌毒素存在的原因对饲料和家 畜业的影响，仅在美国和加拿大每年造成的损失就有5 0 亿美元。在发展中国家，食物 中的真菌毒素的存在甚至能影响人口数量，并缩短人的平均寿命( 李群伟，1 9 9 7 ) 。 自有历史记录以来，人类就认识了真菌毒素及其对人畜的危害性。早在中世纪，人 们就广泛地描述过麦角中毒，目前国际上已经确定了由3 5 0 种真菌产生的3 0 0 种以上的 真菌毒素，但其中对农业生产最为重要的真菌毒素主要有黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌 烯醇、镰刀菌烯醇、t 一2 毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、伏马毒素和展青霉素等多 种毒素( 石岩，1 9 9 9 ) 。由于真菌毒素食物中毒的临床表现较为复杂，有急性中毒，有 慢性中毒，有些毒素可以诱导基因突变和产生致癌性，有些能显示出对特定器官的毒性， 而有些具有其他的毒性机理，因此就必须要尽量避免人畜接触真菌毒素。即使是在现今 拥有先进的农业技术和食品加】_ _ i _ = 艺的条件卜，在作物种植、收获、储藏和加工过程中， 仍然无法避免和防止产毒真菌的危害。在适宜的温、湿度条件下，这些产毒真菌就会着 生在粮食( 如谷物、油料种子、食用坚果、干燥水果等) 上生长繁殖，产生真萤毒素； 真菌毒素也可能因畜禽食用了含真菌毒素的粮食而进入其乳、蛋中从而再次带入食物 链。 2 董刀菌毒素的分类及结构特点 镰刀菌毒素是真菌毒素的一大类，它主要是镰刀菌属产毒菌株产生的非蚩白质和非 甾类的次生代谢产物倍半萜( 烯) 化合物，全世界范围每年都会遭受到镰刀菌属对玉米和 甾类的次生代谢产物倍半萜( 烯) 化合物，全世界范围每年都会遭受到镰刀菌属对玉米和 h 黼 小麦蛉不翅穰痰豹侵染，产囊毒素，号l 起谷镑数减产，嗣聪搜粮食受到污染不戆食用， 引起人畜中毒，严重的危害着人们的健康。目前已经从污染的谷物中分离出1 4 0 多种毒 素( 癸瘩宁，1 9 9 6 ) 。镰乃蘩毒素势必疆大类，萁串纛型霾转鍪镰刀藩毒素缭校及葵籀 似区别仪在于n 、b 位存在一个不饱和的羰旗，结构见图l ，在已分离的镰刀菌毒素中 有l o o 多种毒豢属予这两种类型。而a 类的襄型代表为下一2 毒素，b 癸静典麓代表为躯 吐毒素( a n g e l o v i s c o n 糕c ，2 0 0 0 ) 。 c h l 、 十 r - 驰 i ，辨 t 巾制舢性哪! ，计ht 嘲柚胖惜瞄 糖 粪疑8 粪董露慧毒素鹩然梅垂 f i g1t s t r u 吼u r eo ft 伸_ a n dbt r i c h o t h 黼怕s 2 1t 一2 毒素 t 一2 毒素燎由不f 阔镰刀菌属，主爨是辘革镰刀菌产生的一种高零性的a 一裂单端獭撵 烯族纯合秘。羊一2 毒繁霆一秘嫠半黎烯纯会戆，学名舞4 彝一l ，5 一二忍醚氧綦- 8a 一 3 一 甲基丁酰氧纂卜3 一羰基一1 2 ，1 3 一环氧单端孢霉一9 一烯，分子式为c ：。h 。o 。分子量为 4 6 6 。2 2 ( j j 。辩8 t e o ，2 0 0 2 ) 。幺私尧： 娜丫专。、一一 ，一能。 c 蛐辨嗨( 3 c o r ”氛。毛。 o 弭擀h t t 一2 鞣 蒺中r l 、怒、r 3 、r 毒蒸濯与代瀑关系褰翅。t 2 毒素熬缝晶炎鑫色锌状绪燕钵， 熔点1 5 卜1 5 2 ，易溶于极性溶剂。该毒素性质稳定，一般的食物烹调加热方法不能破 坏其络构，褒塞溢下藏鳖6 7 年或燕熬至2 o 卜2 h 毒办餐不减弱，薅在碱性条箨下次 氯酸钠可使之失去毒性，其筑环和双键被认为是活性单位。t 2 毒素通常产生在谷物如 小麦、玉米、燕麦、大麦、大米、商粱、大擞及以此为原料酌产品中，特剐楚在托方气 嫉遗鄹靛遣聪易发生。 t 一2 毒索毒性强烈，可以引起家畜的出赢性疾病的爆发，1 9 4 2 一1 9 4 7 年间俄国人由 4 沈阳农业大学硕士学位论文 于食用贮存过冬的谷物而引起致命性的疾病a t a ，最终证实t 一2 毒素就是引起该病的主 要原因。自然界中农作物致病菌可以产生t 一2 毒素，其大多来自镰孢菌属，如早熟禾拟 分枝孢镰孢菌、梨孢镰孢菌和三隔镰孢菌等，产毒能力随真菌种类而异，同时受环境的 影响。t 一2 毒素通过不同途径进入机体均可引起中毒，中毒症状主要为恶心、呕吐、体 重减轻、虚弱无力等，毒素的反应强弱与动物种属差异、成熟程度、染毒途径及剂量有 关。暴露于毒素下会导致皮肤疼痛、瘙痒、变红、产生小泡、坏疽、骨疽、表皮脱落、 恶心、呕吐、体重减轻以及腹泻。严重的中毒会引起虚弱无力、运动性共济失调、混乱、 精神崩溃、心脏的输出量减小、休克以及死亡( 郑晓东，2 0 0 0 ) 。 对于动物的毒理学研究表明，免疫系统是t 一2 毒素攻击的主要目标，其主要作用于 增殖活跃的细胞，如骨髓、肝、黏膜上皮和淋巴细胞等，对淋巴细胞的损害最为严重。 该毒素能抑制细胞蛋白质及d n a 合成，干扰生物体能量和脂质代谢，对生物膜功能及多 种酶活性也有明显作用，同时，卜2 毒素还可引起机体过氧化损伤。此外，t 2 2 毒素可 能还与我国某地区食管癌、克山病和大骨节病的高发病率有关。t 一2 毒素是单端孢霉烯 族化合物中毒性较大的一种，毒性分级为剧毒。它能引起动物呕吐，可导致外周血白细 胞缺乏，具有明显的细胞毒和对蛋白质、d n a 合成的抑制作用，并有肯定的致畸性和致 突性，国际上对此毒素十分的重视。 2 2 呕吐毒素 呕吐毒素又称d o n 毒素是f 镰刀菌的二级代谢产物。这类真菌大多在低温、潮湿和 收割季节，在谷物、庄稼中慢慢生长。d o n 是一种全球性的谷物污染物，它主要是链孢 霉属在缺乏营养物质时舍成的活性物质，通常在大麦、小麦、燕麦和玉米等农作物中浓 度较高，在黑麦、高梁、大米中浓度相对较低。d o n 也是一种倍半萜烯化合物，化学名 称为3a 、3b 、7 ，1 5 四羟基辘草镰刀菌一9 烯一8 一酮，分子量为2 9 6 ( d a n v i dm w 订s o n ， 2 0 0 2 ) 结构为： 呕吐毒素 h 前寄 易溶于水、乙醇等溶剂中，性质稳定，是一种钟状结晶，熔点为1 5 1 1 5 2 ，具有较强 熬抗熬麓力，麴热裂1 1 8 才耱被破螺，1 2 l 寒压趣热2 妇i n 仅毒少藿被玻鼹。于燎粒 条件下酸性不影响其簿性，但是加碱戚高压处理可破坏部分撩素。一般的蒸煮及食物加 工都不熊破坏箕毒往，整罐蒸键承；串洗3 次，其中懿蚤港含慧茸减少6 5 6 冁鬻l m 。l 虎 的碳酸钠冲洗谷物，d o n 的含嫩可减少7 2 7 4 ，用o 1 m o l l 碳酸钠溶液浸泡裤物2 4 7 2 小时，d o n 的禽量可减少4 2 一l o 傩。 在已知豹荦端孢霉烯族化含物中，脱氧雪腐镶碍包麓烯醇的毒性是缳弱的之一，但出 于脱裁雪腐镰孢菌烯酶的广泛存在，它对人裔仍有很大的损害。已经证明，缴霉玉米中 熬瀚n 慰猿会产生毒魅，对又产生食物孛毒瞧鑫缨瑰缺乏瘥。入熬孛毒症装是箨部不邋， 恶心、呕吐、头痛、熟晕、腹痛、腹泻。还。可有全身无力、髓干、流涎，少数患者有发 巍、激嚣潮缀等症获。动蘩弼瓣孛d 溅戆串毒症获主溪表琨麓：沃食、瑟心、躯睦、羧 泻，影响免疫和繁殖机能，并导致血磷和碱性磷酸酯虢的活性下降，猪对呕吐毒毒索很 敏感，牛羊次之，家禽对其有较高的酣受力。呕吐毒毒素能弓l 起猪食欲减退或废绝，呕 吐，体重下降，流产，死胎朝弱仔，翔制是痰枫能和降低机体抵抗力。据报邀，猪日粮 中呕蛾毒毒素含量在卜2 m g k g ，即可影响其采食量和增重。中毒病理变化为猪的胃、 瑟魅鞠鹜鹱稳鼹重量壤鸯羁，食学秸璇增厚，黉爨门嚣变薄窝嚣嚣貘援馋等。家禽驱黩簿 毒素中毒后表现为采食量和增藿下降，口腔溃疡，肌谢糜烂，死亡率升高。牛d o n 中海 表瑗必采食羲下降，体震衰弱，生长缓橙，产娆量和爱孕率簿低( 王拣，1 9 9 8 ) 。 d o n 具有很强的绷胞毒性，它对艨棱细胞、真核细胞、檄物细胞、肿瘤细胞等均具 有明虢的毒性作用。窀对于生长较侠的细胞翔胃肠道辩膜细臆、淋巴细胞、鹪腺细臆、 脾缨鼹、嚣髓细胞等均有损饶作用，：羚且可以糖刳蛋恕质的念成。其拯铡枫爨为：干扰 核糖体碱基转移酶的作用，阻碍了核糖体循环并抑制了启动反应和终止反应，而且d o n 在黯测矗会戏麴涮豹弱瓣，还诱罢d 黻萃穗錾裂，毽不壤燕疆痔终熬渊矗会艘。 3 真荫毒素相关的法律法规及标准体系状况 3 黧际上襁荚静法律法麓及标准律聚状嚣 粪菌污染食品使食品的使用价值降低，撼至完全不能使用，从而造成巨大的经济损 失，鼠发作往往表现为明显的季节性和艟方髅，人和动物很w 能在一次吞食多种真蔺毒 索嚣弓l 起中毒，国际上对此十分重视。f 矗o 9 h o 食品添如裁联合专豢委员会第5 6 次会 6 沈阳农业大学硕士学位论文 议于2 0 0 1 年2 月6 一1 5 日在瑞士日内瓦召开，此次会议的主要议题是评价几种污染食品 的霉菌毒素的危险性。1 9 9 2 年于召开的f a 0 州o 国际会议和召开的联合国环境发展代表 大会上，再次强调了人类食品安全和食品中化学污染潜在危险的重要性。在1 9 9 6 年， 联合国批准了一个项目，即建立包括真菌毒素在内的一些食品中污染物作为保护和促进 人类健康的可持续发展监控指标。食品添加剂和污染物法典委员会( c c f c ) 第3 4 届会 议于2 0 0 2 年3 月l l 一1 5 日在荷兰鹿特丹召开，重点讨论食品添加剂法典通用标准 和食品污染物和毒素法典通用标准。目前，许多国家依据公共卫生意义和商业目的， 都制定了食品和饲料中真菌毒素的限量规定。在发展中国家，食品和饲料中的真菌毒素 也具有深远的经济意义。随着世界各国对真菌毒素的限量控制，出口的粮油食品和肉乳 类即便是没有关税障碍，也将受到影响而减少其市场份额，从而必然导致减少产量。 真菌毒素存在的广泛性、剧烈的影响以及潜在的致癌性使得对于可能存在污染的主 要食品和相关产品必须制定最大允许限量的强制标准，各国对食品中重要的真菌毒素都 采取了有效措施，并将其作为食品检测中的重要指标，制订了真菌毒素允许量标准。饲 料中也有相关规定，目的是减少真菌毒素转化到可食用的动物产品中去。已经有5 0 多 个国家在不同的项目上制定了真菌毒素的最大允许限量。例如世界卫生组织推荐食品、 饲料中黄曲霉毒索晟高允许量标准为1 5 u g k g 。不合格的等级有：3 0 3 5 u g k g 为低毒， 5 0 1 0 0 u g k g 为中毒，1 0 0 一l o o o u g k g 为高毒，l o o o u g k g 以上为极毒。随着人们对黄曲 霉毒素危害性认识的逐步加深，黄曲霉毒素的限量标准也在不断的更改。1 9 6 6 1 9 7 5 年 问，w h 0 f a o 就连续3 次修订了食品中黄曲霉毒素最高允许量标准，将其从3 0 u g k g 降 至1 5 u g k g 。欧盟则规定从1 9 9 8 年起进口花生原料中的黄曲霉毒素限量由3 0 u g k g ，花 生制品由l o u g k g 降至4 u g k g 。及时将对黄曲霉毒素超标的花生出口国自动关闭在欧盟 1 5 国市场之外。2 0 0 2 年2 月1 2 曰，欧盟发布再次加严黄曲霉毒素限量标准的新法规， 对粮、谷、花生及其制品中的黄曲霉毒素( 包括a f t b l 、a f t ( b l + b 2 + g 1 + g 2 ) 、a f t m l ) 的限量进行了修订，再次加严上述农产品中的黄曲霉毒素的限量标准。这次修订还对上 述农产品的用途进行了区分，初步分为“供人类直接食用”和“作为食品原料进口”两 种情况，设置不同限量。2 0 0 1 年国际食品法典委员会( c a c ) 第2 4 次大会通过了黄曲霉 毒素m 1 在牛奶中的最高限量值为o 5 u g l ，并成为正式的法典标准。 f a o w h 0 食品添加剂联合专家委员会第5 6 次会议于2 0 0 1 年2 月6 1 5 日在瑞士日内 前京 瓦召开。此次会议的燕要议题是评价几静污染食晶的霉菌毒豢的危黢性。会议的基本内 容分为两部分；一是针对霉葡毒素一般性问题的讨论，包括其分析方法、采样、膳食资 搴辜戳及羲貉控铡等：= 是分裂辩4 耱霉蓦毒豢( 黄麴霉毒素骐l 、茯马懑素、稼蘧霉毒桊、 t 一2 毒索) 进行安全性评估。结论是黄灏霉毒素m l 的最大限值成该控制在0 0 5 0 5 u g k g 之闯，铰马毒豢b l 、b 2 、b 3 瓣雕d i ( 暂定每蠢耐受豢入羹) 为2 u g 屈g ，稼洼霉毒素 每周耐受摄入蹩每千巍体重( p t w i ) l o o u g 。d o n 的每日最大耐受量暂定为l u g ，t 一2 毒 素最低作用剂麓每日每千克体重为o 0 2 9 l i l g 。 食品添加割和污染物法典委员会( e c f a c ) 第3 4 矮会议予2 0 0 2 年3 月ll 1 5 嗣在 荷兰鹿特丹召开。重点讨论食品添加剂法典通用标准和食品污染物和辫素法典通 楚标溅，委爨会决定褥夸麦、丈麦亵爨麦孛瓣稼藏霉毒素矗浆量僮定为5 u g k g 。黢费 霉素在苹果汁和苹果汁制品中的最大限量定挝为5 0 u g k g ，并决定4 年后将5 0 u g k g 展 青霉綮降翻2 5 u g k g 。 蜘拿大根据制粉、加工和动物试验提出：作为非主要食品的未清理小麦，成人对d o n 的允许量2 0 0 0 u g k g ，婴，b 1 0 0 0 u g k g ，美国食鼯和医蓊管理硒规定，含d o n 达 2 0 0 0 u g a g 以上豹小燮不可用于划耪，含d o n l o o o u g k g 以上豹籁糖不熊用作食黼 ( m j i m e n e z ，2 0 0 0 ) 。 3 。2 溅斑辐关瓣法露法靛及标准体系羧提 我国卫生部门经过努力，对真菌毒素的研究和污染控制融取得了显著的效果。近年 来，璨发健真蘩毒素中毒已疑糇少发生了，蠢予经济事会发簇状况静驻鑫，我国霹藩越 真菌毒索的卫生监控工作水平还与国外发达潮家存在着差距。我国在有关真麓毒素国家 标准的研究中，尽管检测方法的工作进展较快，至今已经建赢了黄虢簿毒素b l 等7 种 真菌凑索的兔疫检溅方法，其中有些鼠经正式颁布实施，有然在审批过程中，其他爨簧 的真谪毒素也有检测方法。但是，真谪毒素允许量国家标准的制订仍然滞后，目前只有 黄熬攥毒素瑟l 、戳，袋青霉索等多数粪蘩毒豢豹兔谗整标准簇毒实撬。我嚣手挎8 5 零 加入c a c ，并于1 9 9 5 年正式成立了中豳食品法典协调小组，分别在农业部和卫生部设立 了国际耩国内协调秘书处。簿年派越来越多静专家高席c 矗c 备专鼗娄员会的会议，及辩 掌握躐际c a c 动态，并与我翻相关标准法规紧密结合。在1 9 9 9 年6 月的执调小组会议 上，遴过了尽快成立中国食品法典委员会的动议，2 0 0 0 年3 月在北京协办了第3 2 屑食 8 沈阳农业大学硕士学位论文 品添加剂和污染物法典大会。中国已经加入了食品安全国际化的领域，加入w t 0 后将更 加促进我国与f a o 、州0 及其他成员国的交流，在真菌毒素允许量国家标准与法规的制 定和相关决策过程中更应该加快脚步适应最新的国际潮流。 4 真菌毒素检测技术现状及检测方法研究进展 由于真菌毒素对人体的危害，因此对于真菌毒素的检测方法得到了快速的发展，特 别是生物化学方法，如亲和色谱法和酶联免疫吸附测定法等快速检测方法，同时由于在 进行真菌毒素的检测时，大部分的毒素标准样品不仅毒性很大，而且非常难以得到，所 以无毒素标准的方法适应了这种需求，如黄曲霉毒素荧光仪的使用。目前我国的国家标 准基本上是采用酶联免疫法或是荧光分析等半定量检测方法，但是由于毒素的分析属于 痕量分析，在仲裁中最终必须通过气相或液相色谱方法进行准确定量，所以对现有的国 家标准、行业标准和地方标准进行及时的清理和修订是当前的主要任务。 4 1 亲和色谱法 生物大分子具有能和某些相对应的专一分子可逆结合的特性，如酶蛋白与辅酶，这 种结合往往是专一的，而且是可逆的。生物分子间形成专一的可逆性结合的能力称为亲 和力。当把可亲和的一对分子的一方固定在固定相时，另一方若随流动相流经固定相， 双方即专一地结合成复合物，然后利用亲和吸附剂的可逆性，通过特定的洗脱齐j 洗脱， 可以达到分离、纯化的目的。利用生物分子间亲和吸附和解离的层析方法称为亲和色谱 法。 亲和色谱法是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。首先将载体 在碱性条件下用溴化氰活化，再利用化学方法将能与生物分子进行可逆性结合的物质 ( 称为配基) 结合到某种活化固相载体上，此过程称为偶联反应。将偶联反应得到的亲 和吸附剂装入层析柱中而形成亲和柱，将溶液样品通过亲和柱时，生物大分子和亲和柱 中的配基结合而被吸附在亲和吸附剂表面，而其他没有特异结合的杂蛋白可通过清洗而 流出。再用适当方法使这些生物大分子与配基分离而被洗脱下来，从而达到分离、纯化 的目的。在真菌毒素快速分析中，通常作为配基的是真菌毒素的单克隆体，将其制各成 亲和柱用来将样品中的真菌毒素分离、净化、浓缩。 4 2 酶联免疫吸附测定法 免疫酶技术是将酶标记在抗体抗原分子上，形成酶标抗体酶标抗原，称为酶结合 9 前言 物。强抗燕与抗体反威形成复合物螽，该酶缀合物豹酶作用于加入的底物使之曼色，根 据颜饿的有无和深浅，定性斌定量抗体抗原。酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 建免疫酶 技术的种。其特点怒利用浆苯乙烯微量反应板吸附抗原抗体，使之固定化。免痰反 应和酶征反应在其中送行。光论畿免疫反应遥是酶健反癍，每次反废后都要反复洗涤， 这氍像涯7 反应缎定爨关系，也避免了寒复疲豹游离技钵技琢约分离步骤。在乳i s a 法中酶促反应只进行一次，丽抗联、抗体的免疫反应可进行一次或多次，即可用二抗( 抗 抗体) 、三抗再次进行免疫反应，这就便于根据需硬自杼设计试验。所需酶标抗体、酶 标抗抗体己试剂化出售，便于各种e l i s a 测定。 4 2 1 常用的醯i s 磊涌寇法 4 - 2 l 。 阕接法 将己翘抗原吸附在阉相载体表箍，我除来嗷附抗原，加入一定量抗体与特测样品( 含 有抗原) 提取液的混合液，竞争温肖后，在固相载体表面彤成抗原一抗体复合物。洗除多 余抗体成分，然艏加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结裔物，与吸附在阐体表两的抗源 一抗体复合物稻络台，挥糖入酶豹精物。在酶的穰纯作弼下，底耪发生降解反液，产生 有色产甥，逮避薅标捡测仪，测墩鬓癜糖憨黪解鏊，款嚣推懿被测样品串瓣鼓凝量。 4 + 2 。1 2 直接法 将已知抗原吸附在阈相载体表面，洗除束吸附的抗躐，加入一定量的酶标记抗体与 样品( 含有抗原) 提取液的混台液，竞争溢育厝，在阉相载体表面形成抗原抗体酶复合 物。洗除多余部分，加入酶的底镌。在酶的髓纯作糟下，底物发生降解反应，产生套色 锈痰。逶避酶标捡溅仪，测懑酶疯耪熬蹲解爨，铁蠢接懿装测榉鑫孛豹羧滠量。 4 t 2 2 免疫瓣技术中常用的酶一底物系统 各种免疫酶技术最终都是以某种显色反应而揭示待测物质来进行定性和定髓分析。 不同酶选择不同的底物。酶结合物催化作用随时间的延长而增强。但随着酶催化时闻的 延长，某璺底物会产鼙自发盼交往，使最终的颜甑反废加深蕊干挽结果搿断。在撬嵩 娩i s 蠢法貔炭敏发方蘸，霹采用臻先将抗薄、酶标抗抗然混合，使之充分绩台嚣，秀老嚣 入到缒被抗原中。也考的采用多秘熊的放大系统，如采用形成辩卜抗体一抗原一鹣2 复合 物的谢种酶的级联放大系统，使灵敏度大大提高。e l i s a 法可检测范围在n g p g 水平， 属超微量分析技术。 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 4 3v l c 棚单克隆抗体免疫亲和技术 v i c a m 发明的单克隆抗体免疫亲和技术是唯一能产生准确定量结果的试验方法。它 应用了单克隆亲合色谱法，能够将真菌毒素从饲料、食品、谷物和果类中分离出来，将 黄曲霉毒素m 1 从奶制品中分离出来。该分析方法的特点为：快速；一次试验只需不到 l o 分钟( 不包括样品制备与提取) 。灵敏：检测限可至o 1 p p b ( 谷物和果类为l p p b ) 。测 量范围宽：最高浓度可检测到3 0 0 p p b ，方便实用：使用的提取物设备与其它真菌毒素试 验的一样。操作简单：不需要特殊的试验技能试验可以在任何地方进行。安全可靠： 与传统普通方法相比所用的材料基本无毒性。 4 4 色谱分析方法 4 4 1 气相色谱法( g c ) 有着许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器可供选择，如氢火焰离子化检测器 ( f i d ) 、e c d 、氮磷检测器( n p d ) 等，检测限一般为u g k g 级。但是大多数的毒素极性 或沸点偏高，需繁琐的衍生化步骤，限制了g c 的应用。 4 _ 4 2 高效液相色谱法( i p l c ) 几乎所有的化合物包括高极性离子型待测物和大分子物质均可用h p l c 进行测定。 肿l c 的分离机制与常规柱色谱相同，但填料更精细，需高压泵推动，柱效高、速度快、 灵敏度与o c 相近。与g c 相比，网p l c 流动相参与分离机制，其组成、比例、p h 值等 可灵活调节，如离子对色谱、胶束色谱、手性分离色谱等，使许多极难分离的待测物得 以分离。 4 4 3 色一质联用法 色一质联用作为一种发展相对成熟的检测手段，可以对物质进行进一步的定性分 析，一般只需一次提取和一次色一质检测即可。仅使用色谱法检测需要多个检测器。色 一质联用主要有气相色谱一质谱联用( g c m s ) 和液相色谱一质谱联用技术( l c m s ) 。 5 本论文的研究意义 我国已经成为w t o 成员，在与世界各国进行贸易时必须遵循盯0 规则和相关协议。 世界各国均对真菌毒素制定了最高残留限量标准，并作为农产品进出口主要的技术壁垒 之一。目前我国已经规定了部分真菌毒素的国家标准和行业标准检测方法以及限量标 准，一些真菌毒素检测方法的研究正在进行中，另一些有真关真菌毒素的检测方法尚待 前言 立项研究，而且我国已有的真菌毒素的标准检测方法以及限量标准与国际标准检测方法 以及限量标准有相当的差距，为与国际接轨，并适应当代检验检疫的需要，有必要在开 展真菌毒素的快速检测方法基础上研究准确定性、定量检测方法。这对于打破国外的检 测技术壁垒、在合理有利的前提下更多的建立我国的检验检疫技术壁垒、以保护我国在 国际贸易中的经济利益有着重大的意义。 粮谷t 一2 毒素呕吐毒素的检测虽然有国家标准方法一生物测定方法( e l i s a ) ，但该 法只是一个筛选方法，不能准确定性、定量，并且e l i s a 试剂盒全部依靠进口，检测成 本较高，该法不能完全适应检验检疫系统进出口粮谷检验的需要。有必要建立能准确定 性、定量检验检疫行业标准检测方法。 本课题拟采用目前国际先进的免疫亲和技术等前处理手段，以h p l c 法为测定方法， 建立简便易行，灵敏可靠的快速、准确定性、定量t 一2 毒素、呕吐毒素的检测方法，以 满足日常出入境检验检疫工作的需要，本课题的研究可以填补国内真菌毒素检测方法的 空白，在应对贸易壁垒中占据主动，方便进出口，为我国经济发展带来巨大的利益。 沈阳农业大学颁士学位论文 材料与方法 1 。试验材料 1 1 试验原料凝来源 小麦窆自样品：美国￥l c 耀公霉； 小麦呕吐毒素2 p p m 质控样：美国v i c a l i 公司； 美溪软熟春麦；厂家鬟供； 美围软红冬麦：厂家提供； 澳大剩亚，j 、爱：厂家提供： 法国小麦：厂家提供； 澳大利亚大麦：厂家提供； 泰强大米： 美国玉米： 厂家提供； 厂家提供； 褥各耱粮食类群品篪壳，弱蠲夸蘩粉碎撬黪猝，全部遥过2 0 嚣簿磊，疆努法缩分。 1 2 辅品与试剂 除特殊注明外，所用试剂均为分析纯，试验用水为耋蒸馏水。 t - 2 标准晶： d o n 标准品： 美国s i g 淞公司，纯度9 瓣； 美国s i g 撇公司，纯度9 9 ； l 一戴黢蔻( 1 一糕) 耘准赫：美国s l g 融公司： 9 氰酸葸( 9 一a n ) 标准品：美国s i g m a 公司； 氧杂萘邻酮一3 一羧酸标准菇：美国s g 淞公司； 4 一甲旗氨基毗啶( d m a p ) 标准品：美国s i g m a 公司； 亚硫酰氯； 甲醵( 色谱纯) ： 美国s i g 凇公司； 天津康辩德科技蠢限公司； 材料与方法 乙腈( 色谱纯) ： 甲苯( 色谱纯) ： 乙醇( a r ) ： 二氯甲烷( a r ) 天津康科德科技有限公司； 天津康科德科技有限公司： 沈阳化学试剂厂： 沈阳化学试剂厂： 氯仿( a r ) ：沈阳化学试剂厂； 1 3 药品的配制与髑备 1 ) t 一2 标准溶液：准确称取适量的t 一2 标准物质溶于乙腈，配制成浓度为5 0 0 u g m 1 的 标准储备溶液在棕色瓶中保存，临用前取适量体积标准储备溶液用氮气吹干再用流动相 配制成适当浓度的标准工作溶液： 2 ) d o n 标准溶液：准确称取适量的d o n 标准物质溶于甲醇配制成浓度为1 0 0 u g m 1 的标准 储备溶液临用前取适量体积标准储备溶液用氮气吹干再用流动相配制成适当浓度的标 准工作溶液； 3 ) d m a p 工作液：将d 姒p 标准品溶于甲苯制成浓度为o 3 u g m l 的溶液待用； 4 ) 卜氰酸蒽( 卜a n ) 工作液：将卜a n 标准品溶于甲苯制成浓度为o 3 2 5 u g m l 的溶液待 用； 5 ) 9 一氰酸葸( 9 一a n ) 工作液：将卜a n 标准品溶于甲苯制成浓度为o 3 2 5 u g m l 的溶液待 用： 、6 ) 氧杂萘邻酮一3 一羰酰氯工作液：将氧杂萘邻酮一3 一羧酸标准品悬浮于3 0 i n l 无水二氯甲 烷中，然后向其中一滴一滴的加入1 0 m 1 的亚硫酰氯，维持4 0 i n i n ，在反应的过程中，不 断的向其中加入二氯甲烷，防止被蒸千。当反应完成后，在4 0 真空条件下将溶液蒸干。 用无水氯仿将残留物溶解，然后将溶液加热，向其中小心的添加正己烷，直到溶液呈现 浑浊为止。待冷却后得到淡黄色晶体，将溶液在室温条件下蒸千，即得到氧杂萘邻酮一3 1 4 沈阳农业大学硕士学位论文 羰酰氯，然后将其溶于甲苯，制成浓度为0 3 2 5 u g m 1 的溶液待用。 1 4 仪器和设备 安捷伦1 1 0 0 高效液相色谱仪 美国安捷伦公司； 高速均质器 德国u l t r a t u r r a x t 一2t a g “免疫亲和柱美国v i c a m 公司； d o nt e s th p l c 免疫亲和柱美国v i c a m 公司 l c qd e c ax pp l u sl c m s n 液质联用仪菲尼根公司； 高速离心机 b a m s t e a d 氮吹仪 w h 一9 0 a 型微型混合器 小型粉碎机 g g 电子天平 微量移液器 c 。色谱柱 超滤膜( o 4 5 u m ) 固相萃取装置 河南巩义英峪豫华仪器厂； 德国制造： 江苏省盐城市龙冈仪器厂： 河南巩义英峪豫华仪器厂； 德国制造； 德国制造； 美国安捷伦公司； 美国安捷伦公司 美国v i c 川公司 r e 一5 1 型数控旋转蒸发仪 日本日立公司 材料与方法 2 、试验方滚 沈阳农业大学硕士学位论文 3 试验方案设计 3 1 样品的前处理 3 ，1 1 样品的提取 分别根据呕吐毒素和t - 2 毒索的性质，通过对水、甲醇、乙醇、乙腈的不同配比来 进行试验，确定提取溶剂及最佳配比；根据目前通常使用的浸泡、均质等提取方式进行 试验，选择合适的提取方式。 3 1 _ 2 样品的净化 粮谷中的糖类、脂类、蛋白质等都会对检测存在干扰，因此样品净化的首要目的就 是将它们除去，并最大限度的保留毒素。本文中主要通过液一液萃取和固相萃取中的硅 凝胶净化柱、弗罗里硅土柱、免疫亲和柱净化法来进行对比，找出最适宜的净化方式， 并确定最优化的净化条件。 3 1 3 样品的衍生 对于t 一2 毒素，由于其在紫外并没有晟佳的吸收，所以还需要进一步的衍生，以便 进行下一步的检测。本文通过采用卜氰酸葸( 卜a n ) 、9 一氰酸蒽和氧杂萘邻酮一3 一羰酰 氯三种衍生化试剂进行对照试验，并添加d m a p 催化剂加速反应，确定适宜的衍生化试 剂。然后在此基础上对温度、时间、试剂比进行讨论，达到衍生化反应条件优化的目的。 3 2 色谱条件的建立 3 2 1 固定相的选择 根据呕吐毒素、t 一2 毒素的化学结构判断其适用的色谱分离体系。然后采用相应的 色谱柱。由于两种毒素均适用于反相色谱分离系统，所阻，采用c 1 8 、c 8 、c 6 色谱柱。 根据其不同的柱效选择合适的色谱柱。 3 2 2 流动相的选择 根据呕吐毒素和t 一2 毒素的理化性质和相应的资料，采用甲醇、乙腈、水或它们之 间不同配比的混合液进行试验，同时还考虑在其它试验条件不变的情况下，流动相中有 机溶剂配比对保留时间及柱前压的影响，以此获得最佳的流动相配比。 3 - 2 3 检测器的选择 根据呕吐毒素对紫外有吸收的特性，采用紫外检测器从1 9 0 4 0 0 n m 进行光谱扫描， 选择呕吐毒素的最大吸收波长。而对t 2 毒素则采用荧光检测器对于其激发和发射光谱 材料与方法 遴行全扫撼，选择最大吸收波长。 3 3 方法的筒靠性分析 3 3 1 方法的灵敏度 按照前筒所确定的最佳的静处理方黎及最佳的色谱条件对眍吐毒綮和卜2 簿素添 加样品进杼测定，确定其检测限。 3 3 2 方法弱精密度 通过三个标准溶液添加浓度( 呕吐毒索为o 1 0 u g 、2 0 u g 值、1 0 0 u g g ：t - 2 毒素为 棼+ 髓珏g 辔，0 。5 毪g 篷、1 5 娃酶) ，嚣次平行试验，溅定惫谱峰嚣获瓣标准穰麓帮交舅系数篷， 进行分析方法的精密度测定和计算。 3 3 3 方法豹准确凄 向小赘样品中添加三个不同浓度的标准品( 呕吐毒素为o 1 0 u g g 、2 o u g 儋、1 0 o u g ，g ； 孓2 毒素为o 0 5 哦、o 。5 l 蛾、l + 5 毽g 撂) ，簿个浓凌徽五次平簿试验，测定乎均翻牧率及 计算t - 值。 3 3 4 质谱定性确认 呕吐毒素质谱试验条件为； 离子化方式：大气压化学墩离( a p c i ) ； 离子源瀣度：2 ； a p c i 探头温度：4 5 0 ； 选择离子扫箍( s l 辩) ：穗z2 9 5 ； 全扫描范围：m z1 5 0 一5 0 0 ； 二缓袋谗：瑶z 一3 0 0 ，c l 器蕤耋2 2 。 t 一2 毒素质谱试验条件为： 离孑绽方式：大气基纯学魄离( 盎您i ) ： 离子源温度：2 0 0 ； 矗p c i 探头湿度：4 选择离予扫描( s i m ) ：m z6 6 9 ； 全扫攒范围：m z5 0 0 一8 0 0 ； 二缀质谱：m z8 0 一3 0 0 ，c i d 能量2 2 1 3 沈阳农业大学硕士学位论文 3 3 5 实际应用试验 将准备的美国软红春麦、美国软红冬麦、澳大利亚小麦、法国小麦、澳大利亚大麦、 泰i 虱大米、美国玉米分别添加2 o u g g 的呕吐毒素和1 o u g g 的t 一2 毒素，做五个平行 重复样品，将所设计的方法应用于实测中，做准确度验证试验。 4 、方法的分析评价 4 1 色谱方法的分析评价 4 1 1 色谱峰分散程度( o ) 当色谱过程接近理想条件和分配系数值恒定时，流出曲线应为高斯曲线，应具有集 中性、有限性、对称性的特点，色谱峰形的好坏，直接影响到定性及定量分析。因此， 要对色谱峰进行一些特性分析，以便判断该检测条件是否适合进行定性及定量分析。 色谱峰分散程度用标准偏差。值衡量，o 值为即峰高o 6 0 7 倍处色谱峰宽的一半， o 表示组分流出的分散程度，o 值越大( 即色谱峰越宽) ，表示组分流出越分散，色谱 柱效越低。 标准偏差与半峰宽的关系为： w l ，2 = 2 3 5 4o 标准偏差与峰宽的关系为： w ：4o