（发酵工程专业论文）ε聚赖氨酸生产菌株的选育与发酵工艺的研究.pdf

天津科技大学硕上学位论文 摘要 本文以白色链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b u l u s ) 为聚赖氨酸的生产菌株，以 提高e 一聚赖氨酸产量，优化e 一聚赖氨酸发酵工艺主要研究目标，研究内容包 括：e 一聚赖氨酸生产菌株的选育；分批发酵中搅拌转速、p h 、通风比和 温度对e 一聚赖氨酸发酵的影响；流加补料发酵条件的研究以及e 一聚赖氨酸 空间结构的预测。 1 用紫外线( u v ) 对白色链霉菌s t r e p t o m y c e s a l b u l u s9 - 5 进行诱变处理。 首先确定紫外线诱变最佳诱变剂量为4 5 s ，紫外诱变后，经初筛、复筛得到 一株产量为1 0 8 5 9 ，l 的突变株u v 3 9 ( a e c 7 ) ，比出发菌株9 5 的e 聚赖氨 酸产量提高1 5 2 ，遗传性状稳定。采用5 l 自动发酵罐发酵结果表明突变株 u v 3 9 要比原始菌株9 5 的发酵性能有所提高，主要体现在：菌株生长的延 滞期缩短，对数期延长，菌体适应能力增强，生长速度快，e 一聚赖氨酸的合 成能力比原始菌株9 5 提高1 3 。 ( 向培养基中适量添加生物素( 2 0 0 ug l 5 0 0 “g l ) 分别可提高菌株 聚赖氨酸产量3 5 2 采用5 l 自动发酵罐，对一聚赖氨酸分批发酵中搅拌速率、p h 、通风 比和温度的影响进行了研究。发现搅拌速率提高对菌体生长和s 。聚赖氨酸的 合成有显著的促进作用；但搅拌速率过高会将菌体打碎，导致细胞死亡，e 聚赖氨酸产量下降。实验证明当搅拌速率维持在3 5 0 r m i n 左右时，y 。 最高 为0 0 6 8 8g 8 - p l g s u b 。 ( p h 值对菌体生长和e 聚赖氨酸合成具有明显影响，当p h 维持4 5 以上， 有利于菌体生长；当p h 低于3 5 时，对菌体生长有抑制作用；但p h 对e 一 聚赖氨酸合成的影响却相反，p h 为4 0 时，促进一聚赖氨酸的合成，而p h 为6 0 时，没有一聚赖氨酸的合成。 一定通风比下一聚赖氨酸产量与通风比成正比，通风比为1 ，2 5 v v m 时， e 一聚赖氨酸产物得率和比生成速率最高，分别为o 0 7 2g 一p l g s u b 和0 0 0 7 9 。p l j g c e l l h ；当超过1 2 5 v v r f l 后，随着通风比增加d o 提高；通风比为 2 6 7 v v m 时，d o 维持6 0 以上，有利于菌体生长，y 小达到0 3 9 32 c e l l g s u b ， 但葡萄糖消耗速率降低，至9 6 h 残糖仍为1 0 5 ，e 聚赖氨酸的产量下降， 发酵时间延长。 2 8 。c 时对细胞生长非常有利，菌体得率y x 5 达到0 4 2 9g c e l l g s u b ，发酵 结束时菌体量最高为1 0 0 7 l ，但e 聚赖氨酸产量仅0 7 9 l 。3 0 。c 下菌体量 较高，且e 一聚赖氨酸的产量和e 聚赖氨酸产物得率y 眯远高于前两个控制条 件，分别为2 4 4 9 l 和0 0 7 3 9 - p l g s u b 。 摘要 优化条件下( 搅拌转速3 5 0 r m i n ，3 0 x 2 ，初期通风比o 8 v v m ，当d o 降 至3 0 后，调节通风比为1 2 5 v v m ，初始p h 6 8 ，自然降至p h 4 0 后以1 0 氨水控制p h 4 o ) 进行发酵实验，实验所得菌体产量、e 一聚赖氨酸产量、e 一 聚赖氨酸相对葡萄糖得率和比生成速率n 分别为1 0 8 4 9 l 、3 0 2 9 l 、o 0 7 5 9 、 一p u g s u b 和0 , 0 1 6 9 p u g c e l l h 。卜 3 采用了三种不同流加方式对流加培养发酵e 一聚赖氨酸进行了研究， 分别是有反馈控制的间歇流加培养和变速流加培养，以及恒速流加培养。前 两种流加方式通过建立流加数学模型进行控制，间歇流加的数学模型为v 1 x c s l + f x fs 1 = v 2 c s 2 ；变速流加的数学模型为f = d q d t = k ( t - - t 。) ( t - - t l ) 乖i q = c k ( c 为常数) 。流加基质为葡萄糖和硫酸铵，流加阶段葡萄糖浓度控制在 l o g l 。 流加发酵实验表明，变速流加优于其他两种流加方式，其e 一聚赖氨酸产 量和菌体量分别达到6 9 3 l 和1 9 s o l ，恒速流加的一聚赖氨酸产量为 5 2 9 l 。另外间歇流加方式的发酵结果最不理想，e 一聚赖氨酸产量仅为 3 , 7 7 9 l 。但是从发酵动力学参数考察变速流加和恒速流加方式，后者要优于 莳者，因此还需进一步对这两种流加方式做深入研究d 一7 4 借助生物信息学和网络预测服务，对具有抑菌功能的异型短肽e 一聚 赖氨酸进行了二级结构和空间结构预测。考察了链长对e 聚赖氨酸结构的影 响，基于相似蛋白的结构模拟了2 0 m , 、3 0 a a 和4 0 a ae 一聚赖氨酸的三级结构； 同时依照s h o j is h i m a 等人关于e 一聚赖氨酸一级结构与其活性的关系，初步 推断出a 螺旋及其在整个肽链中的比例对e 聚赖氨酸的抑菌活性有重要作 用。 关键词：e 聚赖氨酸，白色链霉菌，生物防腐剂，分批发酵，流加补科发酵， 生物信息学，蛋白质结构预测 天津科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h ee s s a ys t r e p t o r n y c e sa l b u l u sw a sc o n s i d e r e da st o o lo f p r o d u c t i o n ，i no r d e r t oi m p r o v et h ep r o d u c t i v i t yo f - p l , o p t i m i z et h ep r o c e s so ff e r m e n t a t i o n ，m a k e o u tt h er u l e so fb a t c hf e r m e n t a t i o na n df e d b a t c hf e r m e n t a t i o no f 一p l ，w o r k s w e r ed o n ea sf o l l o w s ：t h e b r e e d i n go f t h es t r a i np r o d u c i n g8 一p l t h ee f f e c t o fs t i rv e l o c i t y , p h ，a e r a t i o na n dt e m p e r a t u r eo nt h es y n t h e s i so f 一p li nb a t c h f e r m e n t a t i o n t h ef e d b a t c hf e r m e n t a t i o nw a ss t u d i e da n dt h es e c o n d a r ya n d s p a c es t r u c t u r eo f 一p lw a sp r e d i c t e db yu s i n go fb i o i n f o r m a t i c sa n di n t e r a c t p r e d i c t i o ns e r v e s t r e p t o m y c e sa l b u l u s9 - 5w a st r e a t e db yu v t h eo p t i m u mi r r a d i a t i o nt i m ew a s 4 5 s a f t e rm u t a t i o n ，i n i t i a ls e l e c t i o na n dr e p e a ts e l e c t i o n ，am u t a n tu v 3 9 ( a e c r ) p r o d u c i n g 8 一p l1 0 8 5 9 lw a so b t a i n e d t h em a i n f i n d i n g st h a tt h ec a p a b i l i t yo f f e r m e n t a t i o no fu v 3 9w a s h i g h e rt h a n9 - 5 a r ea sf o l l o w s ：t h ep r o c r a s t i n a t ep e r i o d o fu v 3 - 9w a sd e c r e a s e d ，a n dt h e l o g a r i t h mg r o w t hp e r i o do fu v 3 9 w a si n c r e a s e d ； t h es t r a i n s g r e wr a p i d l ya n dt h ec a p a b i l i t yo f 一p l - p r o d u c i n gw a si n c r e a s e d ， w h i c hi s 1 3 h i 曲e rt h a no r i g i n a ls t r a i n 9 5 i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h eg e n e t i c s t a b i l i t y , t h em u t a n tw a s t e s ta f t e rf i v ec o n t i n u o u si n o c u l a t i o n t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h em u t a n tc o u l dt r a n s f e rt h eg e n e t i ci n f o r m a t i o nt ot h es o n g e n e r a t i o n b ya d d i n gd b i o t i n ( 2 0 0 5 0 0 “g l ) ，t h ec a p a b i l i t yo f 一p l - p r o d u c i n gc a n a l s ob ei n c r e a s e d3 5 t h er e s e a r c h e ss h o w e dt h a tt h es t i rv e l o c i t y , p h ，a e r a t i o nr a t i oa n dt e m p e r a t u r e p l a y o n i m p o r t a n t r o l e si nt h e f e r m e n t a t i o no fe p li n5 一la u t o m a t i c f e r m e n t a t i o nj a r h i g hs t i r s p e e dw o u l di m p r o v et h eg r o w t ho fc e l l s a n dt h e s y n t h e s i so fe p lh o w e v e r o v e rh i g hs t i rs p e e dc o u l db r e a kt h em y c e l i u ms oa s t og e tt h ec e l l st od e a t h t h et e s ts h o w e dt h a ta ta b o u t3 5 0 r m i no fs t i rs p e e dt h e y i e l do f p l f e r m e n t a t i o nw a st h eh i g h e s t w h e np hw a sc o n t r o l l e du n d e rl o w v a l u e ，w h i c hc o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho fc e l l s i nr e v e r s ew h e n p h w a s h i g h e rt h a n 4 5 ，w h i c hc o u l dp r o m o t et h em e t a b o l i ca b i l i t yo fc e l l s b u th i 曲p hw o u l dn o t b e n e f i tt h es y n t h e s i so f e - p l , t h er e a s o nw a sn o tc l a r i f i e du n t i ln o w t h ef i e l do fe p lw a se n h a n c e dc o m p a n y i n gw i t ht h ei n c r e a s i n go fa e r a t i o n r a t i o t h e h i g h e s ty i e l d o fg l u c o s et oe p la n dp r o d u c t i v i t yw e r e0 0 7 2 g - p u g s u ba n d0 0 0 7 9 e p l g c e l l 。hu n d e ra e r a t i o nr a t i o1 2 5 v v m u n d e ra e r a t i o n r a t i o 王6 7 v v md i s s o l v e do x y g e nc o u l dm a i n t a i no v e r6 0 ，g i u c o s ew a sc o n s u m e d s l o w l y a n ds t i l lh a d1 0 5 a t9 6 h ，y x sw a so 3 9 3 g c e l l g s u b ，b u t t h e 一p l p r o d u c i n gl e v e rw a s f e l la n dt h ef e r m e n t a t i o nc i r c l ew a s p r o t r a c t e d 一1 1 1 a b s t r a c r t h e t e m p e r a t u r ef o rs t r e p t o m y c e s a l b u i u st og r o ww a s2 8 。c ，t h ey i e l do fg l u c o s e t os t r e p t o m y c e sa l b u l u sw a so 4 2 9g c e l l g s u b ，t h ef i e l do fs t r e p t o m y c e sa i b u t u s w a s1 0 0 7 9 la f t e rt h eb a t c hf e r m e n t a t i o n t h ef i e l do f - p lw a so n l y0 7 9 9 l 3 0 w a sf i tf o rt h e 一p lp r o d u c i n g a tw h i c ht h ef i e l do f 一p la n dt h ey i e l do f g l u c o s et o 一p l ，h i 曲e rt h a nt h o s ea t2 8 。c o r3 2 。c ，w e r e2 4 4 9 la n do 0 7 3 9 8 - p l g s u b ，r e s p e c t i v e l y 。 b a t c hf e r m e n t a t i o no f p li n5 0 lb i o r e a c t o rw a sc a r r i e do u ta ts u i t a b l e c u l t u r ec o n d i t i o n s o f ：a g i t a t i o ns p e e d3 5 0 r m i n ，t e m p e r a t u r e 3 0 ，a e r a t i o n 0 8 v v ma n da d j u s ta e r a t i o n1 。2 5 v v mw h e nd ow a s 3 0 ，p h 6 8 ，a n dc o n t r o lp h 4 ，0 b ya d d i n g1 0 a m m o n i a a ss o o na sp hw a su n d e r4 0 t h ef i e l do f s t r e p t o m y c e s a l b u l u s , 一p lc o n c e n t r a t i n ，t h e y i e l d o f g l u c o s e t oe p la n dv o l u m e t r i c p r o d u c t i v i t y w e r e 1 0 8 4 9 l , 3 0 2 l 0 0 7 5 9 一p l g s u b a n do 0 1 6 g 一p l g c e l l 。h ，r e s p e c t i v e l y t h r e ed i f f e r e n tk i n d so ff e e d b a t c hc u l t u r e sw e r e d e s i g n e d i no r d e rt o i n v e s t i g a t et h ee f f e c tt a k e nb ye a c ho n e - p lf e r m e n t a t i o n t h e s ew a y si n c l u d e d s p a nf e e d b a t c ha n dv a r i b l es p e e df e e d b a t c h ，a sw e l la sc o n s t a n ts p e e df e e d b a t c h w h i c hw e r ec o n t r o l l e db ys u b s t r a t ef e e d b a c kb a s e do nf e e dm a t hm o d e l s t h e m a t hm o d e lu s e d b y t h es p a nf e e df e r m e n t a t i o nw a sv 1 c s l + f f s 1 = v 2 c s 2 t h eo t h e rw a sf = d q d t = k ( t - - t a ) ( t - t oa n dq = c k ( ci sc o n s t a n tn u m b e r ) h e r e t h ef e e d b a c k s i g n a l w a st h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ew h i c hw a sm a i n t a i n e d a r o u n d 1 0 9 l o n c e t h ec o n c e n t r a t i o no f 百u c o s ed u r i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s d e c r e a s e db e l o wt h ec r i t i c a ls i g n a l ，t h ef e e dp r o g r a mw o u l db et r i g g e r e d e n t e r i n g t h ef e e d p h a g e ，t h e f e e d b a c ks i g n a lw a sm o n i t o r e da to n c ee v e r y e i g h th o u r s t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t sn o t e dt h a tt h e v a r i b l es p e e df e e d - b a t c hw a s s u p e r i o rt o o t h e rt a c t i c s ，w h i c hs a t i s f i e du sa sr e s p e c tt ot h eh i g h e s tp r o d u c tr a t i oo f 一p l a n dt h es i m i l a rg r o w t hr a t i o no fc e l l i nt h ew o n d e r f u le x p e r i m e n tt h ey i e l do f 一p lr e a c h e d6 9 3 9 ka sw e l la st h eb i o m a s s b e i n g a sh i g ha s1 9 ，8 0 l t h ee p l p r o d u c t i v i t yo ft h ec o n s t a n tf e e db a t c hf e r m e n t a t i o nw a s5 2 9 9 lt h eb o t t o mo f r a n ko f 一p l y i e l dw a st h es p a nf e e db a t c hf e r m e n t a t i o nw h o s e v a l u ew a so n l y 3 7 7 l h o w e v e ri ft h er e s u l t o ff e e db a t c hf e r m e n t a t i o nw a si n v e s t i g a t e db y f e r m e n tk i n e t i cc h a r a c t e r i s t i c s ，i tw o u l db ef o u n dt h a tt h ev a r i e t i e so fv a l u eo ft h e c o n s t a n tf e e db a t c hf e r m e n t a t i o nw a ss u p e r i o rt ot h ev a r i b l es p e e df e e db a t c h s o t h er e s u l to ff e e dc u l t u r es h o u l db ef u r t h e rs t u d i e di nt h ef u r t h e r i nt h i sp a p e r , t h es e c o n d a r ya n d s p a c e s t r u c t u r eo f - p lw h i c hw a sah e t e r o g e n e o u sp e p t i d e w i t h i n h i b i t i n g b a c t e r i u m a c t i v i t y w a s p r e d i c t e db y u s eo f b i o i n f o r m a t i c sa n di n t e m e t p r e d i c t i o n s e y v e t h ee f f e c to fc h a i n l e n g t h o nt h e v 天津科技大学硕二e 学位论文 s t r u c t u r eo f 一p lw e r ei n v e s t i g a t e d b a s e do nt h er e s u l t so fs i m i l a rp r o t e i nt o 。 一p l ，t h e i rp r o t e i ns t r i pw a ss i m u l a t e d m e a n w h i l ea c c o r d i n g t ot h es u p p o s i t i o no f p lw i t hd i f f e r e n tc h a i nl e n g t ht a k i n gd i f f e r e n tb i o a c t i v i t y ，i tw a si n f e r r e dt h a t h e l i xa n di t sc o n t e n ti n p e p t i d ep l a y e d a n i m p o r t a n t r o l ei nt h ei n h i b i t i n g b a c t e r i u m a c t i v i t yo f 一p l k e y w o r d s ：e - p l ，s t r e p t o m y c e s a l b u l u s ，b i o l o g i c a lp r e s e r v a t i v e ， f e r m e n t a t i o n ，b a t c hf e r m e n t a t i o n ，f e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n ， b i o i n f o r m a t i c s ，p r o t e i ns t r u c t u r ep r e d i c t i o n v - 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 随着人们生活水平的提高和健康意识的加强，对食品品质提出了更高的 要求，除了食品的营养、感官和外观包装外，食品的食用安全性更为人们所 关注。由于食品的特殊性，对其防腐保鲜一直是食品研究中的重要方面。长 期以来，由于受到经济环境和开发水平的制约，几乎所有的食品都采用化学 合成防腐剂来延长食品的保质期。化学防腐剂如果超剂量使用会产生累积毒 性和致癌作用，存在局限性。因此，安全、广谱、高效及经济实用的天然食 品防腐剂的开发和生产成为食品防腐领域发展的趋势和要求。 微生物食品防腐剂是天然防腐剂中的一大类，其是指通过微生物发酵的 方法，从发酵液中提取分离得到有抑菌作用的物质，主要为多肽类物质。目 前，国际上批准使用的微生物食品防腐剂仅有乳酸链球菌素( n i s i n ) 和纳他 霉素( n a t a m y c i n ) 。我国分别于1 9 9 0 年和1 9 9 6 年批准上述两种微生物防腐 剂用于食品防腐保鲜。另外，e 一聚赖氨酸也是一种抑菌效果明显的微生物食 品防腐剂，其在日本应用广泛，在我国的研究才刚刚起步。由于这三种微生 物防腐剂安全无毒、抑菌作用强，因此具有广阔的应用前景。 1 1 乳酸链球菌素( n i s i n ) 1 9 2 8 年，美国的l a r o g e r s 等首次发现乳酸链球菌的代谢产物能抑制 部分细菌；1 9 4 7 年英国的m a t t i c ka t r 发现一些乳酸链球菌( s t r e p t o c o c c u s l a c t i s ) 产生具有蛋白性质的抑制物，并将其命名为“n i s i n ”，取自“n i n h i b i t o r y s u b s t a n c e ”：1 9 5 1 年h i r s c h 研究表明，n i s i n 可被用作食品生物防腐保鲜剂以 控制革兰氏阳性菌；1 9 5 3 年n i s i n 的第一批商业产品- - n i s a p l i n 在英国面市， 含有2 5 n i s i n ”。 乳酸链球菌素发酵生产一般是选用n i s i n 效价高的乳酸链球菌，以蔗糖和 可溶性淀粉为碳源，酵母粉为氮源，添加适量的k h 2 p 0 4 和含s 无机盐或氨 基酸如蛋氨酸、半胱氨酸；发酵最适温度为3 09 c ，p h 为5 0 - - 5 5 【“。 1 1 1 物理和化学性质 1 1 1 1 结构 乳酸链球菌素( n i s i n ) 的分子式为c 1 4 3 h 2 2 8 n 4 2 0 3 7 s 7 ，n i s i n 有六种类型， 分别是a 、b 、c 、d 、e 和z ，其中对n i s i n a 和n i s i n z 的研究最活跃。n j s i n 是一种多肽类羊毛硫细菌素，含有3 4 个氨基酸残基，相对分子质量为3 5 1 0 道尔，活性分子为二聚体或四聚体。n i s i n z 和n i s i n a 仅在2 7 位氨基酸残基 有差别，a 为h i s ，而z 为a s p 。同浓度下一般n i s i n z 的溶解度和抗菌力强 1 前言 于n i s i n a 。而对于n i s i n 单体，其中含有5 种稀有氨基酸：a b u ( 氨基丁酸) 、 d h a ( 脱氢丙氨酸) 、d h b ( b 一甲基脱氢丙氨酸) 、a 1 a - s a l a ( 羊毛硫氨酸) 、 a l a s a b u ( b 一甲基羊毛硫氨酸) ，它们通过醚键形成5 个环【3 j 。 a l a l e u m e t i l e 0 h a - - l e u la h 2 m i l e d 耶一a l a s a l a h o o c l y s d h a v 缸一h i s i l e s e r 塞s 翔g l y cpro g l y l p 茚b e 品 n i s i n 结构式 1 1 1 2 溶解性和稳定性 n i s i n 的溶解度随着p h 值的下降而显著增加。p h 2 5 时溶解度为1 2 ， p h 5 0 时为4 o ，中性和碱性时不溶【9 】。 n i s i n 分子为天然酸性，在酸性条件下呈现最大稳定性。n i s i n 在p h 2 ；5 或p h 2 5 以下的稀盐酸溶液中煮沸时，其活性不会发生变化，当溶液的p h 大 于4 时加热，n i s i n 逐渐或迅速失去活性。 储藏温度对n i s i n 活性的影响。d e l e v s b r o u g h t o n 报道，将添加有 2 5 0 i u g n i s i n 和含水量为5 4 5 8 的巴氏灭菌精制干酪贮藏于不同温度下， 3 0 个星期后，2 0 中的n i s i n 活性为9 0 左右，2 5 。c 为5 5 ，3 0 下降到不 足4 0 。在冰箱中保存n i s i n 数月之后，其化学和生物学特性及活性几乎不会 发生变化，在干燥状态下保存数年之后，仍有活性【5 l 。此外实验证明在热处 理过程中，大分子物质如牛奶或肉汤等对n i s i n 分子有保护作用i “。 1 1 2 抑菌机理和抑菌谱 普遍接受的关于n i s i n 抑菌机理的观点认为，n i s i n 抑制细菌生长及芽孢 萌发的原因是其对细胞表面强烈吸附进而引起细胞质的释放。n i s i n 是带有正 电荷的疏水短肽，因而它可以和革兰氏阳性菌细胞壁中带负电的物质结合， 如磷壁酸、糖醛酸磷壁酸、酸性多糖和磷脂。从而破坏细胞壁结构并与细胞 膜形成管状通道，使得小分子量的细胞质成分从孔道中泄漏出来，如铵离子、 钟离子、氨基酸、核苷酸等，导致细胞内外能差消失，使蛋白质、多糖等的 生物合成受到抑制。n i s i n 对细胞芽孢的作用主要是抑制其萌芽，并不是杀死 芽孢。而g 一和g + 相比，其细胞壁成分复杂而且结构致密，n i s i n 无法通过， 因而对其不能发挥作用。但当经过处理改变g 一的细胞壁通透性后同样对n i s i n 敏感【6 】。 天津科技大学硕士学位论文 研究中发现微生物会对n i s i n 产生适应性，原因可能是微生物分泌的蛋白 酶能够降解n i s i n 。但最近的研究表明，适应性产生的原因可能是微生物通过 改变膜组成防止n i s i n 吸附。因为细胞膜中膜磷脂组成的不同会导致n i s i n 和 细胞膜的亲和性不同，从而使微生物对n i s i n 的敏感性发生变化p j 。 n i s i n 能有效抑制引起食品腐败的革兰氏阳性细菌，如乳酸杆菌、结核分 枝杆菌、明串珠菌、棒杆菌、片球菌、小球菌、丹麦丝菌、葡萄球菌、单核 细胞增生李斯特菌等的繁殖和生长，特别是对蜡状芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢 杆菌等细胞的孢子萌芽有很强的抑制作用，但n i s i n 对酵母、霉菌和革兰氏阴 性菌没有作用。将n i s i n 固定于海藻酸钙凝胶或与磷酸钠结合使用，可以提高 n i s i n 的利用率，还可以扩大抑制范围。一些研究表明，在加热、冷冻或调节 p h 的情况下，一些革兰氏阴性菌如：假单孢菌，大肠杆菌等也对n i s i n 敏感。 n i s i n 与e d t a 联合使用对沙门氏菌和革兰氏阴性菌也有抑制作用 1 1 3 乳酸链球菌素的应用 n i s i n 作为一种新型的天然防腐剂，已广泛应用于乳制品f 鲜牛奶、奶粉、 酸奶、干酪1 、罐头食品、肉制品、果蔬汁、豆制品、饮料等领域。研究表明， 在乳制品中添加n i s i n 5 0 0 - - 1 0 0 0 1 u g 可以阻止梭菌的生长和毒素的形成，延 长乳制品的货架期【1 l 】；在果汁饮料中添加n i s i n ，可以防止乳酸杆菌和啤酒片 球菌，避免浑浊、酸变、发熟等现象的发生，并且不会影响果汁饮料的质量 和风味【1 2 】。此外，n i s i n 还可用于对n i s i n 不敏感的微生物发酵过程中，以防 止革兰氏阳性菌的污染，如单细胞蛋白、有机酸、多糖、氨基酸和维生素等 工业发酵过程。 1 2 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 1 9 5 5 年，s t r u y k 等人从南非纳他州的土壤中分离到纳塔尔链霉菌 s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s 括，并从中分离出了一种新的抗真菌物质，称为p i m a r i c i n ( 匹马菌素) 1 3 ；1 9 5 9 年，b u r n s 等人在美国田纳西州的土壤中分离到了一 株恰塔努加链霉菌s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s i s ，并从其培养物中分离到了 t e n n e c e t i n ( 田纳西菌素) 。此后的研究证明匹马菌素和r ；| 纳西菌素为同一物 质，并被世界卫生组织w h o 统一命名为n a t a m y c i n ( 纳他霉素) 1 1 4 l 目前，报道能够生产纳他霉素的菌株有三种，分别为恰塔努加链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o v g e n s i s ，a t c c1 3 3 5 8 ) 、纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i s ，i s p5 3 5 7 ) 和褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ，a t c c 1 3 3 2 6 ) 。发酵培养基以葡萄糖为碳源，大豆蛋白提取物为氮源，最适发酵温 度为2 9 ，初始d h 为7 o 。 1 前吉 1 2 1 物理和化学性质 1 2 1 1 结构 n a t a m y c i n 是一种四烯大环内酯，四烯系统是全顺式，内酯环上c , - c 。部 位为半缩醛结构，含有一个由糖昔键连接氨基二脱氧甘露糖( m y c o s a m i n e ) 。 n a t a m y c i n 分子中含有一个碱性基团和一个酸性基团，电离常数p k a 值分别为 8 3 5 和4 6 ，为两性物质，等电点为6 5 ，熔点为2 8 0 。存在两种构型：烯 醇式结构和酮式结构。 h 2 n n a t a m y c i n 结构式 1 2 1 2 溶解性和稳定性 纳他霉素在水中或低级醇中的溶解性是随着p h 的降低或升高而增加的， 在中性p h 下溶解度最低，而在p h 低于3 或高于9 时溶解度增大。一般微溶 于甲醇，溶于稀酸、稀碱、冰醋酸及二甲基酰胺，难溶于大部分有机溶剂。 纳他霉素干粉在避光避潮条件下比较稳定，室温下保存几年只有很小一 部分失去活性。其三水化合物同样稳定，但其无水形态不稳定，室温下密闭 保存4 8 小时失去1 5 的活性。纳他霉素中性水溶液几乎和干粉一样稳定。 纳他霉素的稳定性受p h 值、温度、光照、氧化剂和重金属等影响。纳 他霉素在p h 4 5 9 之间非常稳定，在极端p h 值下纳他霉素迅速失活，形成 各种分解产物。在低p h 值时其主要的裂解产物是海藻糖胺；在高p h 值时， 如p i l l 2 ，由于内酯皂化可形成纳他霉酸，用强碱处理导致分子进一步破裂， 产生一系列后醛醇反应。温度对纳他霉素的活性几乎没有影响( 在中性水溶 液中) 。纳他霉素在室温条件下是稳定的，5 0 放置几天或1 0 0 短时处理， 其活性几乎无损失。1 2 0 条件下加热不超过l h 仍能保持纳他霉素的部分活 性。纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。y 辐射也能使纳他霉素分解。 纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑菌活性会明显下 降。防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如叶绿素、抗坏血酸、丁基羟基茴香 醚、丁基甲苯等。一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、 镍、铅、汞等重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器 4 天津科技大学顾士学位论文 中，也可以添加e d t a 或聚磷酸盐来防止失活【“i 。 1 2 2 抑菌机理和抑菌谱 纳他霉素有明显的抑制真菌的作用，这是由于真菌的细胞膜含有麦角固 醇，而细菌细胞膜中不含这种物质，多烯大环内酯类抗生素可以选择性地和 固醇结合形成膜一多烯化合物，结合的程度与固醇含量成正比，由于细胞膜结 构的改变导致其渗透性增大，结果造成细胞内物质的泄漏【l “。 纳他霉素是一种广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类的多烯 大环内酯类抗生素，但没有抗细菌活性。纳他霉素对繁殖细胞的抑制效果很好， 而对于休眠细胞则需较高浓度，对真菌孢子也有一定抑制效果。1 9 5 6 年， t r e s n e r 研究了纳他霉素对5 0 0 种霉菌的抗性，所有霉菌被抑制的浓度范围为 1 l o p p m 。 虽然纳他霉素有较强的抑制真菌作用，但对哺乳动物无毒，没有“三致” 现象。纳他霉索很难被消化道吸收，由于其难溶于水和油脂，大部分摄入的 纳他霉素会随粪便排出。1 9 6 6 年，l e v i n s k a s 等研究纳他霉素的急性毒性和慢 性毒性，证明纳他霉素对人体器官没有明显影响，也不产生伤害。1 9 7 3 年 h a m i l t o nm i l l e r 报道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。 1 2 3 纳他霉素的应用 1 2 3 1 纳他霉素在食品中的应用 纳他霉素由于溶解度很低，一般用作食品表面防腐，主要用于奶酪、肉 制品、葡萄酒、茶饮料及果汁，不会影响食品成分变化，没有异味。它在食 品中的抗真菌作用是双效的：既可防止真菌引起的食品腐败，减少经济损失； 又可防止真菌毒素的分泌。使用方法一般有浸泡、喷洒或乳剂覆膜【l ”。与传 统的抗真菌剂比较，纳他霉素有其独特的性质，它在很低的浓度下仍具有活 性，例如在奶酪中纳他霉素比山梨酸钾活性高4 0 0 倍。在葡萄酒中，纳他霉 素能取代山梨醇和其它抗真菌剂，它允许减少所使用的s 0 2 量1 1 。目前，全 世界已有三十多个国家采用纳他霉素作为食品防腐剂。 1 2 3 2 纳他霉素在医疗中的应用 纳他霉素除了用作食品防腐剂，还可药用。主要由于其具有一些特殊性 质：( 1 ) 非常低的口服毒性；( 2 ) 不经肠道吸收；( 3 ) 没有致敏性；( 4 ) 没 有交叉抗性。因此纳他霉素可用于治疗皮肤和粘膜的真菌感染，既可单独使 用又可与新霉素、氢化可的松及其它类固醇药物共同使用，还可用于阴道和 肿部真菌感染的治疗。目前有悬浮剂、乳剂、软膏和鞘状药片等药剂型。 最近，纳他霉素已成功用于真菌性角膜炎的治疗中，纳他霉素口服不吸 收，限下局部用药。因其难溶于水，临床上使用5 混悬液，眼部能耐受且无 1 前； 毒性【2 0 】。 1 3 - 聚赖氨酸( e - p o l y 1 y s i n e ) 1 9 7 7 年f 1 本学者s s h i m a 和h s a k a i 2 8 j 从放线菌培养过滤液中提取出一种 含有2 5 3 0 个赖氨酸残基的同型单体聚合物。这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残 基通过a 羧基和e 一氨基形成的酰胺键连接而成，故称为e 多聚赖氨酸( e p l ) 。实际上多聚赖氨酸的合成是早在1 9 4 7 年由k l e p r a i n 首先完成的 2 7 1 ， 但是化学法合成的聚赖氨酸为a 型，其赖氨酸残基之间的酰胺键是由a 氨基 和羧基缩合而成，研究也证明了a p l 比e 一聚赖氨酸抑菌活性差且有毒 性，因此目前在国