毕业设计（论文）-鲤科鱼类DNA的提取与扩增.doc

武汉轻工大学毕业论文毕业论文题目 鲤科鱼类DNA的提取与扩增姓 名 学 号 090214408 院（系） 生物与制药工程学院专 业 生 物 科 学 指导教师 2013年6月8日目录摘要11.前言31.1 DNA的提取方法31.1.1浓盐法31.1.2阴离子去污剂法41.1.3苯酚抽提法41.1.4 Chelex-100提取法41.1.5磁珠提取法41.2 DNA的检测方法51.2.1 DNA的琼脂糖凝胶电泳51.3 PCR技术51.4鲤科鱼类简介81.4.1常见的鲤科鱼类82.材料与方法102.1材料102.2实验仪器102.3 主要试剂102.4 实验方法112.4.1苯酚/氯仿法提取基因组DNA112.4.2 试剂盒法112.5 DNA的PCR扩增及电泳133结果143.1样品DNA的提取143.2样品mtDNA D-loop序列的扩增144.讨论15谢辞17参考文献18摘要本文采用标准的酚/氯仿法和试剂盒法提取鲤科鱼类翘嘴鲌的基因组DNA，并对鱼样线粒体DNA控制区进行了扩增。结果表明，酚/氯仿法和试剂盒法提取鲤科鱼类翘嘴鲌的基因组DNA，经凝胶电泳检测所提取样品DNA条带清晰，两种方法所提鱼样基因组DNA质量较好。采用所提取样品DNA对鱼样线粒体DNA控制区进行了扩增，结果表明，基因组DNA可扩增出清晰可辨的条带，重复性好。关键词： DNA提取技术； PCR技术； 鲤科鱼类AbstractThe genomic DNA of Culter alburnus was extracted by using the standard phenol/chloroform extraction method and assay kits and the mitochondrial DNA controlled regions of fish samples were amplified.After Gel electrophoresis,the results showed that the bands of genomic DNA of Culter alburnus were clear, and the quality of genomic DNA of those sample showed better by using the two extraction methods.Using the mitochondrial DNA controlled regions of fish sample for amplification, and the results also showed that the mitochondrial DNA controlled regions of the samples were amplified and the bands amplified were legible and reproducible.Key words: DNA Extraction Technique; PCR Technique; Cyprinids1.前言1.1 DNA的提取方法DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度。DNA对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高；当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺等试剂都可以引起DNA分子变性，即使得DNA双键间的氢键断裂，双螺旋结构解开。尽管双链DNA在化学上是稳定的，但它在物理上仍是易碎的。高分子质量DNA长而弯曲，仅具有极微的侧向稳定性，因而容易受到最柔和的流体剪切力的伤害。双链DNA在溶液中随机卷曲，并由于碱基堆积力和DNA骨架上磷酸基团间的静电排斥力而变得粘滞，由吸液，震荡，搅拌所导致的水流对粘滞的盘绕物产生拖拉力，能切断DNA的双链。DNA分子越长，断裂所需的力越弱。因此，基因组DNA分子易于被常规分离基因组DNA过程中产生的力切断1。并且DNA修复（DNA repairing）存在修复机制，DNA修复是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。所以研究DNA修复也是探索生命的一个重要方面，而且与军事医学、肿瘤学等密切相关。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。双链DNA是非常惰性的化学物质。它潜在的反应基团隐藏在中央螺旋内，并经氢键紧密连接，它的碱基对外侧受磷酸和糖形成的强大环层的保护，这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强。如此坚固的结构和保护，使得DNA在现代犯罪现场和古代墓葬等完全不同场所比大多数细胞内其他成分保存的时间更长2。1.1.1浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M Nacl抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。也可用0.15M Nacl液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1M Nacl提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白。两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNacl,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA3。1.1.2阴离子去污剂法用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。1.1.3苯酚抽提法苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态4。1.1.4 Chelex-100提取法Chelex-100是由苯乙烯与二乙烯基苯的共聚体组成的一种螯合树脂，它对多价金属离子有高亲和力，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子作用。现已证实Chelex可防止DNA在煮沸中的降解，并在高温低离子强度下起着催化DNA释放的作用。Chelex-100能有效除去非核酸有机物，主要用于提取全血或血痕、毛发、培养细胞等。但因生物样本来源不同其操作方法有所差异5。1.1.5磁珠提取法磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁（Magnetic Silica Particle）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理一般类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE,COOH）等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠微珠所应对的纯化原理是不一致的。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程6。1.2 DNA的检测方法1.2.1 DNA的琼脂糖凝胶电泳DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶泳动，除了电荷效应之外，还有分子筛效应。由于DNA分子或片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。0.6%1.4%琼脂糖凝胶适用于310611106相对分子质量的DNA分子或片段的分离，所需DNA样品为0.51ug7。琼脂糖凝胶电泳分离后得DNA样品可用溴化乙锭染色（EB）。溴化乙锭分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙锭可以检测出10-9g以上的DNA含量。不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围：琼脂糖浓度（%）分离范围（Kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-31.3 PCR技术聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)8，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95度时解旋，55度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至72度左右，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。由PCR技术制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在95，55，72之间很好地进行控制。DNA的半保留复制9是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应体系10：成分剂量或浓度10x扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物200ul引物10100ul模板DNA0.12ugTaq DNA聚合酶2.5ulMg2+1.5mmol/LddH2O100ul反应的控制：PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20200umol/LTaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）引物 浓度一般为0.1 0.5umol/L反应温度和循环次数变性温度和时间 95，30s退火温度和时间 低于引物Tm值5 左右，一般在4555延伸温度和时间 72，1min/kb(10kb内）Tm值=4(G+C) +2(A+T)循环次数 ：一般为25 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。1.4鲤科鱼类简介鲤科（Cyprinidae），属鲤形目。全世界共有鲤科鱼类220属 2400种以上，台湾现有29属33种。鲤科鱼类分布在底栖或水中层，卵生，杂食、草食或肉食。鲤科鱼类颌骨无齿。最后一对鳃弧腹面部分特别粗壮，成为下咽骨，上有13行咽齿。具角质咽磨、体常被覆瓦状圆鳞，无脂鳍；背鳍只有1 个，前部有24根不分支鳍条；腹鳍腹位；尾鳍多呈叉形，绝少平截或微凹11。鲤科鱼类是鲤形目中分布最广、种类也最多的一群。台湾共有八十余种初级淡水鱼，其中鲤科即占了将近一半。它们的形态与生态习性富于变化，多数种类只有一个背鳍，腹鳍在腹位，且和臀鳍明显分开，尾鳍分叉；身体被覆圆鳞；口器则分化为各种不同的类型，以便摄取各类的食物。本科为鱼类中最大的一科，约有220多属，2400多种，都是淡水鱼类，分布很广。我国有鲢鱼、鲤鱼、裂腹鱼、鳅鮀、鳊、雅罗鱼、鲴、鳑鲏、鲃、鮈共10个亚科12。我国鲤科鱼类中的主要经济鱼类有“四大家鱼”（青鱼Mylopharyngodon piceus、草鱼Ctenopharyngodon idellus、鲢Hypophthalmichthys molitrix、鳙Aristichthys nobilis）、鲤Cyprinus carpio、鲫Carassius auratus、鳊Megalobrama terminalis、团头鲂Parabramis pekinensis等，是池塘养鱼的主要对象。鲤科鱼类的观赏鱼也是种类繁多，大、中、小型鱼都有，约有1600多种（我国约产370种），属于热带观赏鱼的种类主要分布在东南亚和非洲。鲤科鱼类颌骨无齿。最后一对鳃弧腹面部分特别粗壮，成为下咽骨，上有13行咽齿。具角质咽磨、体常被覆瓦状圆鳞，无脂鳍；背鳍只有1个，前部有24根不分支鳍条；腹鳍腹位；尾鳍多呈叉形，绝少平截或微凹。吻部无须或仅有一对吻须，偶鳍前部仅有一根不分支鳍条，下咽齿14行，背鳍分支鳍条30以下。中国鲤科鱼类中的主要经济鱼类有“四大家鱼”（青鱼、草鱼、链、鳙）、鲤、鲫、鳊、团头鲂等，都是池塘养鱼的主要对象13。鲤科为鱼类中最大的一科，约有210多属，2000多种，都是淡水鱼类，分布很广。中国有鲢鱼、鲤鱼、裂腹鱼、鳅鮀、鳊、雅罗鱼、银鲴、鳑鲏、鲃、鮈共10个亚科14。1.4.1常见的鲤科鱼类鲫鱼（Carassius auratus）,简称鲫，俗名鲫瓜子、月鲫仔、土鲫、细头、鲋鱼、寒鲋）是中国常见淡水鱼，为辐鳍鱼纲鲤形目鲤科鲫属的其中一种鱼类。本鱼体侧扁，头略短，吻钝圆，无须。鳞片大；鱼体呈银灰黄色，背部颜色较深，腹部银白色，各鳍灰色，尾鳍浅叉形，背鳍硬棘3至4枚；背鳍软条14 -20枚；臀鳍硬棘2至3枚；臀鳍软条4至7枚；脊椎骨30个，体长59厘米15。青鱼（Mylopharyngodon piceus），又名青鲩、螺蛳青，体长筒形，吻较尖。下咽齿1行，4枚，臼齿状。栖息于大江河和湖泊的下层。主食软体动物。为人型经济鱼类，生长迅速，3年鱼可长至78市斤。最大可达140市斤。45龄成熟，繁殖期57月，在江河中产漂浮性卵，膜径56毫米。生殖季节雄鱼头部具白色颗粒状珠星，胸鳍上有呈带状的密集珠星。为我国重要的经济鱼类，并且是主要的养殖对象之一。以江、浙两省养殖青鱼最为有名。肉质优良，胆可人药。分布广泛，以长江中下游出产较冬。草鱼（Ctenopharyngodon idellus），又名草鲩，白鲩，体形与青鱼相仿，吻略钝，下咽齿2行，呈梳形。栖息于江河、湖泊的中、下层。为草食性鱼夹。34龄成熟，47月繁殖，产漂流性卵膜径5毫米左右。生殖季节成熟亲鱼胸鳍条上出现珠星。大型经济鱼类，最重达70市斤，生长迅速，3年鱼可达近10市斤。肉质佳，产量高，为我国优良的饲养鱼类。分布广，自华南至东北部产此鱼。鲤鱼（Cyprinus spp. etc.）鲤鱼俗称鲤拐子、毛子等，隶属于鲤科。身体侧扁而腹部圆，口呈马蹄形，须2对。背鳍基部较长，背鳍和臀鳍均有一根粗壮带锯齿的硬棘。体侧金黄色，尾鳍下叶橙红色。鲤鱼平时多栖息于江河、湖泊、水库、池沼的水草丛生的水体底层，以食底栖动物为主。其适应性强，耐寒、耐碱、耐缺氧。在流水或静水中均能产卵，产卵场所多在水草丛中，卵粘附于水草上发育。鲤鱼是淡水鱼类中品种最多、分布最广、养殖历史最悠久、产量最高者之一。鲤鱼的寿命比较长，一生能活四五十年，素有鱼中“老寿星”之称。翘嘴鲌(Culter alburnus) 又名曲腰鱼，为辐鳍鱼纲鲤形目鲤科鲌属的鱼类，俗名翘嘴巴、大白鱼。分布于中国内陆、俄罗斯、越南红河、台湾日月潭等地，常栖息于江河、湖泊、水库等缓流或静水敞水处，并捕捉鱼类及虾类为食。该物种的模式产地在长江。翘嘴鲌身长可达50厘米，吻部上翘，腹部凹陷成银白色。2.材料与方法2.1材料翘嘴鲌(Culter alburnus) 2011年捕自漳河干流，湖北省荆门市段。2.2实验仪器DYY-6C型电泳仪 上海京工实业有限公司自动分析成像系统 上海旦鼎国际贸易有限公司PCR扩增仪器 Sigma公司752型紫外可见分光光度计 上海广谱仪器有限公司1-15PK高速冷冻离心机 Sigma公司2.3 主要试剂1) 酶解液：200mmol/L Tris-Hcl（pH值为8.0），50mmol/L EDTA（pH值为8.0），200ul/mL蛋白酶K，1%SDS。2) 十二烷基硫酸钠（SDS）。3) 蛋白酶K 10mg/mL。配好后用一次性过滤器过滤，20的温度下保存。4) 平衡酚（pH值为8.0）：氯仿：异戊醇=25:24:1（体积比）。5) 无DNA酶的RNA酶：将胰RNA酶溶于10mmol/L Tris-Hcl（pH值为7.5）,15mmol/L Nacl溶液，浓度10mg/mL，于100水溶液中处理15min以降解DNA酶，缓慢冷却至室温，20的温度下保存。6) 5mol/L Nacl溶液。7) 0.5mol/L Tris-Hcl，pH值为8.0。8) 0.5 mol/L EDTA溶液，pH值为8.0。9) 3mol/L NaAc溶液，pH值为5.2。10) TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl（pH值为8.0）,25mmol/L EDTA（pH值为8.0）。6）10）种试剂均需要高压灭菌。11) 组织匀浆液：100mmol/L Nacl ,10mmol/L Tris-Hcl（pH值为8.0）, 25mmol/L EDTA（pH值为8.0）。12) DNA/EcoR I+Hind III 相对分子质量标准物片段（bp）21227,5148,4973,4268,3530,2027,1904,1584,1315,947,831,564。13) 6x上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（m/V）蔗糖水溶液。14) 5xTBE：5.4g Tris，2.75g硼酸，2mL 0.5mol/L EDTA（pH值为8.0），加水到100mL。15) 氯仿：异戊醇=24:1（体积比）。2.4 实验方法2.4.1苯酚/氯仿法提取基因组DNA16组织液：鱼种尾静脉抽血（CAD作抗凝剂），迅速置于1-15PK高速冷冻离心机（Sigma公司）进行离心，弃去上清液后置于冰箱保存（20）。取500ul TE（10.0mM Tris盐酸+0.1M EDTA，PH=8.0）、25ul SDS（百分比为0.1）、2ul蛋白酶K（10mg/ml）、5ul新鲜鱼血液17使之混合均匀，水浴45h（5052）；加入等体积的苯酚离心10min（10000r/min），取上清液；加入RnaseA（溶液终浓度为25ug/ml），水浴（37）1h；加入500ul等体积的苯酚和氯仿离心10分钟（10000r/min）；取上清液，加入500ul苯酚、氯仿和异戊醇（体积比为24：:24:1）离心10min（10000r/min），加入37.5ulNH4Ac（4M），1000ul无水乙醇，沉淀DNA，离心10min（12000r/min）；取上清液，加入500ul 70%乙醇洗涤DNA，敞开离心管口，置于室温下干燥，使残留的乙醇挥发掉；加入50ul ddH2O，置于4冰箱12h，使DNA充分溶解。肌肉、肝、肾组织：取0.1g背部肌肉、肝、肾切碎，加入500ul抽提缓冲液STE（Tris-盐酸 0.05M，EDTA 0.05，NaCl 0.1M，PH=7.6），在研钵中充分研磨至匀浆；转至1.5ml的离心管中，4时以4000r/min离心5min；去掉上清液，加入500ul TE（Tris-盐酸 0.02M，EDTA 0.02M，ddH2O，PH=7.6）溶液，在振荡器上充分震荡使沉淀悬浮于溶液中；加入蛋白酶K（10mg/ml）至终浓度50ul/ml，10%SDS至终浓度0.5%，轻轻震荡，使酶和SDS混入粘滞的溶液中；加入等体积的苯酚离心10min（10000r/min），取上清液；加入RnaseA（终浓度为25ug/ml），水浴（37）1h；加入500ul等体积的苯酚和氯仿离心10分钟（10000r/min）；取上清液，加入500ul苯酚、氯仿和异戊醇（体积比为24：:24:1）离心10min（10000r/min），加入37.5ul NH4Ac（4M），1000ul无水乙醇，沉淀DNA，离心10min（12000r/min）；取上清液，加入500ul 70%乙醇洗涤DNA，敞开离心管口，置于室温下干燥，使残留的乙醇挥发掉；加入50ul ddH2O，置于4冰箱12h，使DNA充分溶解。2.4.2 试剂盒法 本实验所用的GK1042试剂盒DNA 提取试剂盒（离心柱型），购自上海捷瑞生物工程有限公司，并按照其客户服务中心提供的方法进行实验。其基本原理：临床常常需要从血液中抽提基因组 DNA，用于病症的辅助性分析和诊断。样品经本试剂盒提供的专用裂解液处理后，在特定的 TBM Solution中用 Proteinase K和去污剂裂解。GenClean 柱膜能选择性吸附样品中基因组 DNA，而不吸附蛋白质和其它非核酸类物质。经简单的洗涤步骤，即可得到样品基因组 DNA。具体步骤如下：1）在上述处理好的150l 样品中加入300l TBM Solution，混匀；再加入2ul Boiled RNase A，混匀，55保温10min；再加入 4l Proteinase K，混匀，55保温30min。 注意：Boiled RNase A步骤可省略，为确保无 RNA污染建议添加 Boiled RNase A。保温时间取决于血样的新鲜程度。对于新鲜的血样，55保温 10min足以使细胞裂解，释放出基因组DNA。而对于存放久的血样，保温则视降解效果而定。降解完全的血样应是透明不粘稠的液体。过夜处理通常不影响产率。2）加入300ul PB Solution，充分混匀，12,000rpm，室温离心 5min。根据原始样品量，可能会有少量沉淀。 3）用1ml Tip头将上清（约700ul）全部转移到套放于2ml Collection Tube的GenClean Column柱中。8,000rpm，室温离心1min。 4）取出GenClean柱，并倒掉 Collection Tube 中的废液，将 GenClean 柱重新放回Collection Tube中，加入600l Wash Solution，8,000rpm，室温离心1min。5）取出GenClean柱，并倒掉Collection Tube中的废液，将GenClean柱重新放回Collection Tube中，加入500l Wash Solution，8,000rpm，室温离心1min。6）取出GenClean柱，并倒掉Collection Tube中的废液，将GenClean柱重新放回Collection Tube中，12,000rpm，室温离心1min，以除去残留的Wash Solution。7）将GenClean柱放入新的已灭菌的1.5-ml离心管中，在柱膜中央加入4070l Elution Buffer，室温放置35min。12,000rpm，室温离心1min。离心管内液体即为基因组DNA。根据用途，样品可于4或-20保存。注意：将 Elution Buffer加热至 65，有利于提高洗脱效率。 8）用分光光度计测量基因组 DNA 含量，OD260值为1相当于大约 50g/ml双链 DNA，并通过 0.7%琼脂糖电泳凝胶判定 DNA 的完整性，也可以判定样品中是否有 RNA。2.5 DNA的PCR扩增及电泳（1）在0.5ml EP 管内配制25ul反应体系，按下表加入各溶液18。反应物ddH2O10PCR缓冲液dNTP25mmol/L MgCl2引物1引物2模板DNATaq酶体积/uL112.52.01.51.01.051混匀，加入25uL矿物油（有热盖PCR可不加矿物油）。（2）按下述程序进行扩增：30次循环94预变性5min94变性1min52退火1min72延伸1min72延伸10min4。3结果3.1样品DNA的提取采用酚/氯仿法和组织基因组DNA提取试剂盒提取了翘嘴鲌的基因组DNA并进行凝胶电泳检测（图1）。由图中看出所提取样品DNA条带清晰，说明所提DNA质量较好。图1 翘嘴鲌个体基因组DNA琼脂糖凝胶检测结果注：由左到右分别为DNA/ Hind相对分子质量标准、酚/氯仿法提取基因组DNA的3个个体、组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA的3个个体3.2样品mtDNA D-loop序列的扩增对翘嘴鲌个体的线粒体DNA控制区进行扩增。图2为鱼样个体线粒体DNA控制区的琼脂糖电泳图，图中看出鱼样个体线粒体扩增条带清晰，扩增产物分子量在1200bp左右。图2 翘嘴鲌个体线粒体DNA控制区琼脂糖凝胶电泳图4.讨论1) 使用苯酚氯仿提取DNA法酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。但是其缺点为：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA；2.不能完全抑制RNase的活性。而当加入氯仿时，可以克服酚产生的缺点并加速有机相与液相的分层。通常适应酚-氯仿法提取DNA时，通常要在酚-氯仿中加入少许异戊醇，这是为了减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡的产生。另外异戊醇使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。2) 使用试剂盒提取DNA法使用试剂盒提取DNA的优点有：针对性强，操作快速简单；GenClean柱回收血液基因组DNA效率高、纯度高。在多数情况下， 采用有机提取法， 即经典的饱和苯酚- 氯仿抽提法。它利用十二烷基磺酸钠 （SDS）将细胞膜裂解， 在蛋白酶K、 乙二胺四乙酸 （EDTA）和去污剂的存在下消化蛋白质成多肽或小肽分子，再用等体积的蛋白质变性剂饱和酚抽提除去蛋白质， 饱和苯酚- 氯仿抽提除去未消化的蛋白质， 最后用氯仿抽提除去DNA 溶液中的苯酚。饱和苯酚-氯仿抽提法利用饱和苯酚、 氯仿交替抽提， 使蛋白质变性， 有效地去除蛋白质等杂质， 能获得较多的大片段DNA， 比Chelex -100提取方法更能彻底地纯化DNA19。 为了检验冷冻保存对基因组DNA的影响，在基因组DNA提取1个月后以相同的引物对3种方法提取的DNA进行了PCR扩增。结果表明，与酚一氯仿法一样，优化煮沸法提取的DNA也可以在冷冻状态下长期保存，但煮沸法提取的DNA在保存1个月后再次PCR扩增时，目的条带变淡，这可能是DNA综合纯度影响了PCR产物20。通过比较我们发现，常规的基因组DNA酚一氯仿法提取的模板质量最好，保存时间也长，但操作步骤繁杂，成本也高，而且酚和氯仿均有挥发毒性，对环境造成诸多危害，长期使用严重危害人体健康。煮沸法虽节省了实验时间和成本，但提取的DNA中蛋白质含量较高，能干扰DNA聚合酶的活性，不利于后期基因体外扩增。而优化煮沸法不仅节省了试验时间和成本，且提取的DNA质量高，保存时间也长，是一种快速简便的提取基因组DNA的方法21。酚-氯仿法是提取动物基因组DNA最常用的方法。该方法操作步骤复杂，所用试剂较多，相比于试剂盒法来说，成本低廉，适用于大部分实验条件有限的实验室。本文通过改进传统的酚-氯仿法，所提取的DNA量大大的高于传统的酚-氯仿法所提取的DNA的量。与传统的酚-氯仿法相比，改进后的方法提取效率较高并且蛋白质、RNA等杂质污染少，DNA条带整齐清晰，且DNA的A260/A280比值在1.791.87之间，最接近1.80，质量最高。因此，酚-氯仿法是一种有效的、大量提取鱼类基因组DNA的好方法。谢辞我的这篇毕业论文是在尊敬的谢佳燕老师的支持和指导下完成的，在这里十分感谢我的指导老师.我还要真诚的感谢一直帮助我的同学及师兄黄玉松和梁文涛，在这期间，我和师兄们一起做实验一起讨论问题，一起解决问题，这个过程中让我受益匪浅。在这个学期中，我和其他几位同学在谢佳燕老师的指导下按计划完成了我们的课题研究。谢佳燕老师给了我们很多的发挥空间，不仅在旁边指点让我们自己摸索实验方法和实验条件，分析实验问题，而且有时还会亲自给我们演示实验操作技术。我和其他同学一起完成了各自的课题，得到了谢佳燕老师的充分肯定。在这期间，我学会熟练使用分子生物学常用的仪器，了解很多实验室的基本知识，学到了很多书本上学不来的东西，这些都使我的阅历得到极大地提高了。今即将涉身社会，走上工作岗位，不可忘十余年来数十位老师的谆谆教导，在此，我要感谢每一位老师，感谢你们对我的教诲、关怀、鼓励和批评，没有你们的教育之恩，就没有我今日的成果在此向他们表示我由衷的谢意，并祝所有的老师培养出越来越多的优秀人才，桃李满天下。毕业在即，对校园的留恋之情与日俱增。人生中最美好最宝贵的青春时光，我在大学度过。在这里，我聆听着智者的声音，在这里，我追寻着先哲的思想轨迹，在这里，我品味着生活的酸甜苦辣。“路漫漫其修远兮，吾将上下而求索”，人生很漫长。在未来的事业道路上，不求平步青云，但求兢兢业业，不求高官厚禄，但求无愧于心，无愧于内心的追求，无愧于老师们的教导，无愧于求学于斯的历程。再见了，我的老师们！再见了，我的武汉轻工大学！最后再次感谢你们