（食品科学专业论文）反胶束萃取大豆蛋白及分离技术研究.pdf

摘要 在反胶束技术萃取大豆蛋白质研究取得进展的基础上，针对表面活性剂a o t ( 丁二酸二异辛酯磺酸钠) 在所提取的蛋白质中残留的问题，本文通过冷冻高速 离心法和石英砂吸附分离法分离蛋白质和a o t ，对进一步纯化蛋白质并回收a o t 做了研究。 大豆蛋白经a o t 反胶束技术萃取以后，研究了a o t 在油脂相和蛋白相的分配。 单因素试验中，冷冻高速离心法研究了各因素( 离心速度、离心时间、离心 温度、溶液p h 值、n a c l 添加量) 对蛋白质得率和a o t 残留率的影响；石英砂吸 附分离法研究了各因素( c a c l 。与石英砂的摩尔比、溶液p h 值、吸附温度) 对蛋 白质得率和a o t 残留率的影响。冷冻高速离心法通过响应面试验，分别确定了各 因素对蛋白质得率和a o t 残留率的交互作用。以蛋白质得率最高为评价指标，分 离蛋白和a o t 的最佳工艺条件为：离心机转速为8 8 7 3 r m i n ，离心时间为1 2 7 m i n ， 离心温度为1 i 5 ，溶液p h 为4 2 7 ，n a c l 添加量为3 5 ；以a o t 残留率最低 为评价指标，分离蛋白和a o t 的最佳工艺条件为：离心机转速为9 0 3 6 r m i n ，离 心时间为1 6 i m i n ，离心温度为8 9 。c ，溶液p h 为4 6 2 ，n a c i 添加量为4 9 。 石英砂吸附法通过响应面试验，分别确定了各因素对蛋白质得率和a o t 残留率的 交互作用。以蛋白质得率最高为评价指标，分离蛋白和a o t 的最佳工艺条件为： c a c l t 与石英砂的摩尔比为0 1 0 8 ，溶液p h 为8 1 0 ，吸附温度为4 7 9 。c ；以a o t 残留率最低为评价指标，分离蛋白和a o t 的最佳工艺条件为：c a c l 。与石英砂的 摩尔比为0 0 7 i ，溶液p h 为9 9 1 ，吸附温度为4 0 2 。 通过对两种分离方法得到的蛋白产品进行组分分析，发现冷冻高速离心法所 得蛋白产品组分发生了改变，以高分子量亚基为主；石英砂吸附法所得蛋白产品 亚基组成变化很小。通过荧光分析研究，发现中性条件下，蛋白质和a o t 以某种 方式结合，结合作用力可能主要是疏水力；通过改变溶液离子强度，发现a o t 的存在方式发生改变，和蛋白质之间的作用方式也发生改变，这为分离蛋白质和 a o t 提供了依据。通过红外光谱分析研究，表明两种分离方法没有对蛋白质的二 级结构造成影响。 关键词：反胶束；蛋白质；a o t ；冷冻高速分离；石英砂吸附分离 a b s t r a c t t h ei n v e s t i g a t i o no nt h ee x t r a c t i o no f p r o t e i na n do 订f r o ms o y b e a np o w d e ru s i n g a o t i s o o c t a n er e v e r s em i c e l l e ss y s t e mh a sb e e nd e v e l o p e d b e c a u s eo fp r o t e i n c o n t a i n i n gt h es u r f a c t a n ta o t , t h et h e s i ss t u d i e dt h es e p a r a t i o no fp r o t e i na n da o t b yt h ef r o z e n - r a p i dc e n t r i f u g a t i o nm e t h o da n dq u a r t zs u r f a c ea d s o r p t i o nm e t h o d a f t e re x t r a c t i n gp r o t e i nw i t hr e v e r s em i c e l l e ss y s t e m ，t h ed i s t r i b u t i o no f a o ti n t w op h a s e s0 r o t e i np h a s ea n do i lp h a s e ) w a si n v e s t i g a t e d t h ei n f l u e n c eo fm a i nf a c t o r s ( c e n t r i f u g a t i o nr a p i d i t y 、c e n t r i f u g a t i o nt i m e 、 c e n t r i f u g a t i o nt e m p e r a t u r e 、p h 、a d d i t i o no f n a c l ) o np r o t e i no b t a i n i n gr a t i oa n da o t r e s i d u er a t i ow a si n v e s t i g a t e di nf r o z e n r a p i dc e n t r i f u g a t i o nm e t h o d t h ei n f l u e n c e o f m a i nf a c t o r s ( m o l a rr a t i ob e t w e e nc a c l 2a n dq u a r t z 、p h 、a d s o r p t i o nt e m p e r a t u r e ) o n p r o t e i no b t a i n i n gr a t i oa n da o tr e s i d u er a t i o nw a si n v e s t i g a t e di nq u a r t z s u f a c e a d s o r p t i o nm e t h o d b yr s me x p e r i m e n to ft h ef r o z e n r a p i dc e n t r i f u g a t i o nm e t h o d ， t h er e s u l t ss h o w e d t h a t t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s w e r e8 8 7 3 r m i n 、1 2 7 r a i n 、1 1 5 。c 、 4 2 7 、3 5 w h e np r o t e i no b t a i n i n gr a t i ow a sh i g h e s ta n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e 9 0 3 6 r m i n 、1 6 1 m i n 、8 9 。c 、4 6 2 、4 9 w h e n a o tr e s i d u er a t i ow a sl o w e s t b yr s m e x p e r i m e n to ft h eq u a r t zs u r f a c ea d s o r p t i o nm e t h o d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e o p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e 0 1 0 8 、8 1 0 、4 7 9 c w h e np r o t e i no b t a i n i n gr a t i ow a sh i g h e s t a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r eo 0 7 1 、9 9 1 、4 0 2 。cw h e na o tr e s i d u er a t i ow a s l o w e s t t h et h e s i si n v e s t i g a t e dt h ed i f f e r e n ts u b u n i t sc o n s t i t u t eo ft w op r o t e i no b t a i n e d f r o mt w od i f f e r e n ts e p a r a t i o nm e t h o d s t h er e s u l t ss h o w e dt h ep r o t e i no b t a i n e df r o m f r o z e n r a p i dc e n t r i f u g a t i o nm e t h o dw a sm o s t l yc o n s i s t e do ft h el a r g e rm o l e c u l e s u b u n i t sa n ds u b u n i tc o n s t i t u t ec h a n g e d t h es u b u n i tc o n s t i t u t e so ft h ep r o t e i n o b t a i n e df r o mt h eq u a r t zs u r f a c ea d s o r p t i o nm e t h o dw e r eh a r d l yc h a n g e d b y f l u o r e s c e n c ea n a l y s i ss t u d y , t h er e s u l t ss h o w e dh y d r o p h o b i cb o n dm a y b ec o m b i n e p r o t e i na n da o t w h e ni o n i ci n t e n s i o no fs o l u t i o nw a sc h a n g e d ，t h ea g g r e g a t i o n c o n d i t i o no fa o ta n dt h ec o m b i n a t i o nm o d e lo fp r o t e i n - a o tw i l lc h a n g e t h e s e p a r a t i o nb e t w e e np r o t e i na n da o t w i l lb eb a s e do nt h i ss t u d yr e s u l t b yi ra n a l y s i s s t u d y , t h er e s u l t ss h o w e dt h es e c o n ds t r u c t u r eo fp r o t e i nh a sn o tb e e nc h a n g e db yt w o s e p a r a t i o nm e t h o d s ， k e y w o r d s ：r e v e r s em i c e l l e s ；p r o t e i n ；a o t f r o z e n r a p i dc e n t r i f u g a t i o ns e p a r a t i o n ； q u a r t zs u r f a c ea d s o r p t i o ns e p a r a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作者签名： 速兰主丝 曰期： 印6 r 可 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：堕! ! 筮 日期： 协，6 s 虹 导师签名：瑙弘日期：鲤盖i 比 反胶束萃取大豆蛋白及分离技术研究 第一章前言 1 1 研究目的和意义 大豆是世界上栽培最为广泛的作物之一。根据历史学家和考古学家的考证，中国是 大豆种植的发源地。h e r b e r tw j o h n s o n 在美国大百科全书中写到“大豆是中国文 明基础的五谷之一”。在苏联大百科全书( 1 9 7 6 ) 中也有“栽培大豆起源于中国， 中国在五千年以前就已经开始栽培这个作物”的记载“3 。 我国利用大豆制作传统豆制品的历史悠久。汉代齐民要术中不但已有了关于大 豆的记载，还详细记载了大豆以及大豆发酵制品的加工技术“1 。如豆芽、豆腐、豆浆、 豆豉、腐乳、豆油、豆瓣酱等传统大豆食品。这些豆制品加工技术也逐渐地传到亚洲其 他国家及欧美各国。 现代科学技术对大豆组成进行了研究。大豆主要成分有蛋白质、脂肪、糖类、矿物 质、磷脂、维生素等，其中蛋白质含量一般在4 0 左右，优质脂肪约1 8 ，碳水化合物 约2 5 。大豆蛋白所含氨基酸组成十分接近世界卫生组织( w h o ) 的推荐值，特别是赖氨 酸、色氨酸等，人体自身不能合成，只能从食物中摄取。由于大豆蛋白质所含氨基酸种 类较齐全，而且含人体必需的氨基酸比例高，因而大豆蛋白质是一种类似于动物蛋白质 的植物性“完全”蛋白质，是一种为数不多的能取代动物蛋白的理想营养佳品。对于大 豆蛋白营养评价，新的氨基酸消化率校正评分( p d c a a s ) 表明其与动物蛋白同样能够得 到1 0 的最高分；美国食品与药物管理局( f d a ) 1 9 9 9 年1 0 月允许在含有大豆蛋白的食 品包装上标有健康功能的说明，2 0 0 0 年3 月美国政府批准在学校和托儿所午餐中允许以 大豆食品取代动物食品，取消在1 9 8 3 年曾规定学生午餐副食中大豆蛋白仅可占蛋白摄 入量3 0 的规定。联合国粮农组织( f a o ) 将大豆作为改善发展中国家饮食结构的优秀 低价食物资源。目前全球大豆食品种类约1 2 0 0 0 种，而中国仅有初级加工领域的几百个 品种。据资料显示：美国人每人每天消费大豆4 9 ，中国1 6 9 ，印度尼西亚2 0 9 ，韩国2 6 9 ， 日本3 0 9 ，中国台湾3 8 9 ”1 。 我国人均消费大豆量偏低，主要就是因为大豆加工技术落后于发达国家，仍停留在 初级加工领域。国内大豆加工普遍基于油脂为中心，在尽量满足油脂工业要求的条件下， 才考虑蛋白资源的利用，而蛋白资源的主要利用途径也是被用作饲料，同时磷脂、维生 素等微量营养素也被浪费。 目前国内外的大豆蛋白产品主要有大豆全脂蛋白粉( f u l l f a ts o y b e a nf l o u r ) 、大 豆脱脂蛋白粉( d e f a t t e ds o y b e a n f l o u r ) 、大豆浓缩蛋白( s o y b e a np r o t e i n 1 河南工业大学硕士学位论文 c o n c e n t r a t e s ) 、大豆分离蛋白( s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e s ) 和大豆组织蛋白( t e x t u r e d s o y b e a np r o t e i n ) ，应用最广泛的两类大豆蛋白产品是大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白。 目前工业化生产大豆浓缩蛋白的工艺主要有稀酸浸提法、含水酒精浸提法和湿热浸提 法。稀酸浸提法生产的浓缩蛋白色泽浅，异味小，蛋白的n s i 值高，功能性好，但需大 量酸和碱，并排出大量含糖等营养物质的废水，对环境造成污染。酒精浸提法生产的大 豆浓缩蛋白色泽及风味较好，蛋白质损失也少，但其中的酒精会使蛋白质变性，蛋白质 失去一部分功能特性，其用途和功能特性受到一定的限制。湿热法处理中，由于加热， 大豆中的少量糖和蛋白反应，生成一些里色呈昧物质，产品色泽大、异味大，而且蛋白 质发生了不可逆变性，部分功能特性丧失，在应用上受到限制。生产大豆分离蛋白，目 前国内外主要采用的还是碱溶酸沉法，该方法虽工艺简单可行，产品变性少、色泽浅、 质量好、功能性好，但需大量酸和碱，并排出大量含糖等营养物质以及酸碱的废水，从 而造成后处理困难，并会严重污染环境。而且此法要求原料豆粕质量较均匀一致，以方 便工艺操作。我国的大豆原料品种多、混杂收购，造成生产中工艺控制难，产品质量不 稳定且酸碱消耗较多，成本高，分离出的乳清液随废水排放未回收，其中低分子蛋白质 等有所浪费，可溶性成分除去也不彻底。 由于传统方法生产大豆蛋白存在一些缺点，因此国内外研究工作者在不断地研究新 的大豆蛋白生产技术。如膜分离技术、离子交换技术、双水相萃取技术和反胶束萃取技 术等。 膜技术是基于利用纤维质隔膜的大小不同孔径，以压差为动力使被分离的物质小于 孔径者通过，大于孔径者滞留。该技术不需要经过酸沉析和中和工序，还可以除去植酸 等微量成分。产品含植酸量少、消化率高、色泽浅、无咸味、质量较高，污染问题小。 但该技术中存在膜表面蛋白浓差极化，分子截留量降低及膜材料难以清洗或灭菌等问题 1 o 离子交换法生产分离蛋白原理同碱溶酸沉法类似，区别是离子交换法中不使用碱来 溶解蛋白质，而是通过离子交换法来调节p h 值，使蛋白质从饼粕中溶出及沉淀而得到 分离蛋白。该工艺生产的产品纯度高、灰分少、色泽浅、但生产周期长，目前还未进入 大规模的工业化生产。 双水相萃取技术是利用双水相的成相现象及待分离组分在两相间分离系数的差异， 进行组分分离或多水相提纯的技术，其优点是保持生物活性物质的活性和相间的质量传 递，分相时间短，易于连续放大和工程放大，处理容量大，但因其处理量相对水相很少， 生产成本很高，多用于附加值较高的酶类提取纯化等“。 反胶束萃取大豆蛋白及分离技术研究 反胶束萃取技术工艺简单，过程中不需要加入酸和碱，所用溶剂可以循环使用，容 易解决环境污染问题；条件温和，产品纯度高，蛋白质变性程度很小；利用酶在反胶束 体系中具有超活性的特性，萃取过程中可同时进行蛋白的酶法改性。因此，反胶束萃取 技术具有良好的应用前景，值得进一步研究。 1 2 国内外研究概况 1 2 1 反胶束萃取技术的原理 反胶束技术萃取蛋白质是利用表面活性剂形成胶束的性质来分离蛋白质。表面活性 剂是由性质不同的两部分组成，其分子一端是疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团，另 一端是亲水疏油的极性基团，是不对称的分子结构。1 。表面活性剂溶解于水中，使其浓 度超过临界浓度( c m c ) 时，表面活性剂在水溶液中聚集到一起而形成聚集物，称为正 常胶束。此时表面活性剂形成的胶团是亲水基向外，与水接触，疏水基向内，形成一个 非极性核心。若将表面活性剂溶于非极性有机溶剂中，并使其浓度超过临界浓度，则在 有机溶剂中形成聚集体，这种聚集体称为反胶束。反胶束中表面滔性剂的疏水基向外与 非极性有机溶剂接触，而亲水基向内形成一个极性核，此极性核具有溶解水、氨基酸、 蛋白质等极性物质的能力，极性核溶解水后形成“水池”。反胶束的形状可能为球状、 椭圆形或圆柱形。1 。 图i - i 正常胶束与反胶束示意图 当反胶束溶液与蛋白质水溶液或固体接触后，蛋白质可溶于此水池，这个过程称为 前萃。将含有蛋白质的反胶束溶液与另一水相接触，通过改变条件使蛋白质从反胶束转 移到水相中从而分出蛋白质( 反萃取) ，这个过程称为后萃。由于周围水层和极性头的 3 河南工业大学硕士学位论文 保护，蛋白质失活或变性程度很小。3 。 反胶束溶解蛋白质的形式人们提出了4 种模型，即水壳模型，静电相互作用模型， 空间相互作用模型，疏水相互作用模型。许多有关亲水蛋白质的实验数据支持水壳模型 的正确性；有关蛋白质在微胶束中溶解率的解释支持静电相互作用模型；蛋白质在反胶 束内的分配系数研究支持空间相互作用模型和疏水相互作用模型。 一 = 涟一_ = 一3 蠢醛习l b 一 舢蕾叫扣鳃姻薛泓 鲞白 蓐 _ 图卜2 反胶束萃取过程示意图 1 2 2 反胶束萃取技术的应用 从2 0 世纪7 0 年代，国外已有大量利用表面活性剂反胶束萃取这一性质来提取多种 酶及蛋白质的研究。国内，八十年代也有用反胶束萃取氨基酸、酶、蛋白质的研究，多 集中在细胞色素一c 、牛血清蛋白、血清白蛋白、a 一淀粉酶、胰蛋白酶等“3 。酶及蛋白 质的反胶束萃取分离技术主要有以下几个方面： ( 1 ) 纯化和分离蛋白质n a k a s h i o 等“1 选用一种或几种表面活性剂注入有机溶剂 中，由此形成的反胶束溶液与蛋白质溶液接触，可以极其经济和便利地净化分离蛋白质， 且不会发生变性。如对于溶菌酶和肌红蛋白的混合溶液( 两种蛋白质相对分子量相近， 等电点分别为1 l ，1 和6 8 ) ，用二烷基磷酸盐异辛烷反胶束溶液萃取，并用缓冲液将混 合液的p h 值调至9 0 ，则溶菌酶完全进入有机相中，而肌红蛋白则留在水相。 ( 2 ) 提取纯化酶1 9 7 7 年，m a r t i n e k 等研究了胰凝乳蛋白酶在丁二酸二异辛酯磺 酸钠( a o t ) 反胶束中的性质，这是关于反胶束提取纯化酶的正式研究报道。1 。r a h a m a n 等”1 采用浓度2 5 0 m o l m 3 的a o t 异辛烷反胶束溶液，从全发酵液中提取和提纯碱性蛋白 酶，通过优化工艺过程，酶的提取率可达5 0 。1 9 8 4 年v a n tr i e t 8 手艮道了用三辛基 反胶束萃取大豆蛋白及分离技术研究 氯化铵( t o m a c ) 异辛烷体系萃取a 一淀粉酶，t 9 8 6 年，c o k l e n 叫等首先报道通过控制 p h 和离子强度，用反胶束萃取分离了溶菌酶，细胞色素一c 和核糖核酸酶一a 的试验。 陆强等“研究从发酵液中以反胶束萃取胰蛋白酶，在适宜的条件下，酶的前萃取和反萃 取率都很高，显示该技术有良好的应用前景。 ( 3 ) 反胶束萃取用于蛋白质的复性重组d n a 技术生产大部分蛋白，须溶于强变性 剂中，使它们从细胞中抽提出来。对蛋白质的复性过程通常要在非常稀的溶液中操作， 以避免部分复性中间体的凝聚。h a g e n 等将单个蛋白质分子置于反胶束中，也能阻止这 种有害作用。他们用a o t 异辛烷反胶束溶液萃取变性的核糖核酸酶，将负载有机相连续 与水接触除去变性剂盐酸胍，再用谷胱甘肽的混合物重新氧化二硫键，使酶的活性完全 恢复，最后由反萃取液回收复性的、完全具有活性的核糖核酸酶，总收率达5 0 “。 ( 4 ) 从植物油料中同时提取油和蛋白质从植物油料中萃取蛋白质，传统方法工艺 复杂，得率低，且蛋白质易变性。1 9 8 9 年，l e s e r 等“”利用a o t 异辛烷体系萃取分离大 豆和向日葵中的油脂和蛋白质，通过实验得出影响萃取结果的几种主要因素，包括p h 值、离子强度、反胶束体系表面活性剂浓度，并得出最佳工艺条件。陈复生等”3 研究用 a o t 异辛烷反胶束体系同时萃取花生蛋白和花生油，油被直接萃入有机相，而蛋白质则 进入反胶束的极性核中，再通过离心方法将两相分离。油与有机溶剂用蒸馏方法分离， 对含蛋白的反胶束层进行反萃取，可得到未变性的蛋白质。 其中用反胶束萃取技术同时提取蛋白和油脂的研究已取得了一定的进展，陈复生， 赵俊廷“3 等在国内首次报道了用反胶束萃取技术同时分离花生中的油和蛋白质，积累了 一些基本数据，并且得到了萃取蛋白质的最佳工艺参数。杨宏顺在反胶束中酶活性及其 对植物蛋白和油脂分离影响的研究中，把蛋白一次萃取率提高到5 0 ( 不加酶) ，6 0 ( 加酶) 左右“3 。磨礼现利用全脂大豆粉做原料进行了扩大试验，前萃取率也达到4 5 4 6 。另外使用低温脱溶豆粕为原料，用a o t 异辛烷反胶束体系萃取大豆蛋白质，在最 佳萃取工艺条件下，蛋白质前萃率达到6 7 3 ，后萃率为8 8 9 ，蛋白质实际得率为 5 9 8 “，加入蛋白酶对蛋白前萃率提高3 5 。将反胶束技术应用于植物蛋白领域， 扩大了反胶束萃取技术的研究范围，推动了食品工业生产的发展，有广阔的应用前景。 反胶束萃取技术生产大豆蛋白质和传统大豆蛋白生产工艺相比具有以下优点： a 利用反胶束可以同时分离大豆蛋白和大豆油脂，大大地缩短工艺过程。 b 在萃取蛋白的过程中，蛋白质被水环境包围，因而其生物性能不被破坏“。 c 萃取过程中不需要加入酸和碱，所用溶剂可以循环使用，容易解决环境污染问题， 河南工业大学硕士学位论文 生产成本低“1 。 d 条件温和，产品纯度高，蛋白质变性程度很小“5 1 ”。 e 利用酶在反胶束体系中具有超活性的特性，萃取过程中可同时进行蛋白的酶法改 性2 “。 反胶束萃取技术分离大豆蛋白和油脂的工艺流程图如图卜3 所示“3 。 i 丢置 l 圊匾匦固 上毒 圈圈 置臼产晶 圈卜3 反胶束萃取技术分离大豆蛋白和油脂工艺流程示意图 大量研究工作已表明反胶束萃取技术作为一项新型的分离技术，在分离提纯生物活 性物质方面有很大的优越性，随着研究的深入，反胶束萃取技术极有可能成为各种生物 活性物质分离、提纯的重要方法而应用于工业生产。同时，反胶束萃取技术分离、提纯 蛋白质研究所取得的成果和进展也预示着反胶束萃取技术生产大豆蛋白的工业应用前 景十分广阔。 1 2 3 反胶束苹取技术的研究方向及存在问题 6 反胶束萃取大豆蛋白及分离技术研究 反胶束萃取技术作为一种新型分离技术，人们围绕这项技术在其多个方面进行了 深入的研究。在基础理论方面，对反胶束萃取的原理、影响因素、萃取过程的平衡特性、 热力学模型和萃取动力学等方面都取得较大进展。在应用工艺的开发方面，v a n t r i e r 等运用两个混合室组成混合一澄清单元，试验连续萃取和反萃取蛋白质的操作。 d e k k e r 等为两个混合一澄清室建立了以每一相活性酶尝试为时间函数的微分方程，对萃 取过程进行优化，为此项技术的应用推广提供理论依据。近年来，反胶束萃取技术的研 究主要集中于新型反胶束体系的开发及萃取选择性的提高。常用于形成反胶束的表面活 性剂a o t ，存在反萃取率低，不适合用于萃取分子量大的蛋白质等缺点。h u 等( 1 9 9 6 ) 以 h d e h p 形成的反胶束用于对细胞色素c 和a 一胰凝乳蛋白酶的萃取，其萃取率远高于 a o t 。史红勤等”4 1 在a o t 反胶束溶液中加入磷酯，能使反胶束的直径增大，并可提高 血红蛋白和枯草杆菌a 一淀粉酶的萃取率。另外，蛋白质反萃取方法的改进以及反胶束 萃取的工业化模拟也成为近年来的研究热点”1 。 同时，反胶束萃取技术在分离蛋白质和酶等物质方面的研究及其广泛，并显示出良 好的可行性和优越性，但是要将此项技术真正应用于工业化生产，还有许多亟需解决的 问题。例如，反胶束酶系统作为生物反应的催化物同样具有无可比拟的优点，但目前的 研究多集中于基础理论方面，其实际应用仍处于探索阶段；如何开发更有效的表面活性 剂；如何获得将此项技术扩大到工业规模所需要的基础数据“；如何克服表面活性剂在 产品中的残留；如何开发萃取效果好的食用级表面活性剂等等。 一种食品生产技术必须保证食品的食用安全，反胶柬萃取技术也不例外，因而克服 表面活性剂在产品中的残留对食品安全生产来说尤为重要。反胶束萃取技术在食品工业 应用中，萃取植物蛋白质的研究占很大的比重，尤其是大豆蛋白。陈复生，赵俊廷，杨 宏顺，磨礼现等研究用反胶束萃取植物蛋白技术中，在萃取率的提高、表面活性剂的筛 选、萃取动力学、加酶萃取等方面都取得了一定的进展，但是在研究中仍未解决的主要 问题之一就是a o t 不是食用级的表面活性剂，萃取蛋白整个过程完毕之后，a o t 在蛋白 质中必然存在残留，这一方面影响了蛋白产品的纯度和食用性，一方面也造成了资源浪 费，所以必须进一步纯化蛋白质和回收a o t 。因而若能找到一种工艺简单、成本低廉、 易于实现工业化，分离蛋白质和a o t 效果较明显的方法，那么将使a o t 萃取蛋白质的整 个生产工艺向前迈进一步。 1 2 4a o t 在蛋白产品中残留问题的研究概况 河南工业大学硕士学位论文 a o t ( 丁二酸二异辛酯磺酸钠) ，属阴离子表面活性剂，应用范围广泛。在纺织工 业上可用作渗透剂，在橡胶、造纸、石油、金属、涂料和农业工业用品生产中的润滑剂， 在日用化学工业中用的化妆品，洗涤剂等及医药、煤尘控制方面。应用多集中在化学研 究领域，在食品方面的应用起步较晚，到9 0 年代， c h e njp “”用卵磷脂奶油反胶束 系统来酶解水解奶油，因为该反胶束体系为食用级，所以产品风味好，并可直接食用。 a o t 等非食用级反胶束体系应用在食品加工上的研究不是很多，在已有的a o t 反胶束萃 取酶和小分子蛋白的研究中，研究工作者也是多集中在研究萃取率、影响萃取的因素、 萃取动力学、萃取机理模型等方面，而对萃取所得产品的进一步纯化和回收表面活性剂 的研究相对较少。 表面活性剂应用广泛，在其他应用领域有关于回收表面活性剂或是脱除表面活性剂 的研究。严希康、潘焕华基于表面活性剂用泡沫分离法提取庆大霉素的研究中，讨论了 用乙醚萃取回收a e o 一9 ，用正丁醇萃取回收s d s ，再通过真空蒸馏得到萃取溶剂和表面 活性剂，并通过加入一定量的n a c l 使表面活性剂回收率达到9 9 。“。用丁醇、氯仿等有 机溶剂萃取表面活性剂”；在环境保护方面，用絮凝法回收废水中的表面活性剂等。8 。3 ”； 用泡沫分离技术来浓缩或回收蛋白质和表面活性剂等表面活性物质。7 1 ；用超滤膜技术 浓缩纯化蛋白质和回收生物表面活性剂等等“4 4 “。 另外，陈来同、唐运等认为表面活性剂的存在对蛋白质等的进一步纯化带来了一定 的困难，需要先除去，离子型表面活性剂可用离子交换层析法除去，非离子型表面活性 剂可以用s e p h a d e xl h 一5 0 层析法除去，其他表面活性剂可以用分子筛层析法除去。“。 杨宏顺在用反胶束分离大豆蛋白和油脂的研究中，提到采用降温冷却法和柱层析法来除 去a o t 残留，但对这部分没有作深入研究o ”。 在这些研究中，专门针对分离蛋白质和表面活性剂的研究几乎没有，而且考虑到蛋 白质的生物活性以及分离方法将来的工业化，很多化学分离方法不能满足要求，这为选 择分离方法增加了一定的难度。但还是可以为这个特殊的体系选择较合适的分离方法， 比如吸附法和高速离心分离技术。 对于蛋白质和表面活性剂体系，可以选用一种吸附剂能使a o t 尽可能多地被吸附， 而蛋白质则尽可能多地保留在上层溶液中，这样选择洗脱a o t 的条件要比洗脱蛋白质更 容易，并且不会造成蛋白质变性。 有选择地进行吸附是生化物质分离提纯中常用的一种方法。常见的吸附是以固体物 质为吸附剂从提取溶液中进行吸附，即溶液中的溶质在固一液界面上浓度发生改变。当 溶质在界面上浓度变大时，它在溶液内部的浓度就变小，从而达到分离的目的。采用吸 附工艺主要有两方面的作用：一是吸附杂质，使杂质浓集于吸附剂界面；另一种是吸附 反胶束萃取大豆蛋白及分离技术研究 所需物质，使要提取的物质浓集。当吸附剂对杂质的吸附能力较强，而对所提取的物质 基本无影响时，可用吸附剂除去杂质。如果提取液中所需的物质能被吸附剂大量吸附， 再结合洗脱，即可达到分离纯化的目的“”。常用的吸附剂有活性炭、磷酸钙凝胶、白陶 土、硅胶、氧化铝、聚酰胺粉、硅藻土等。 用吸附剂吸附表面活性剂的研究很多，j a e h y u nb a e 和d o n g i ns o n g 用有机蒙脱 石吸附阴离子染料和表面活性剂。”。陈家梅等研究了天然沸石对l a s 、a b s 、c t a b 等表 面活性剂的吸附净化能力 6 4 o 高月英等研究了温度对硅胶吸附非离子表面活性剂的影响 。”。张国苑，陆启元，冯其明等研究了油酸钠在水硬铝石矿物表面吸附的特性”。有许 多关于离子型表面活性剂在石英砂晶体表面吸附的研究。在p h 2 的水溶液中，石英砂 表面带负电荷“”，它对带正电荷的物质有静电作用力，有文献报道。“”应用e s p s 研究阳 离子表面活性剂在石英晶体表面的吸附。山东大学赵新生“等人利用c a ”的桥连作用， 以e s p s 研究阴离子表面活性剂在带负电荷石英砂表面的吸附特性，目的是对石英的矿 物浮选、表面处理等方面的应用具有一定意义。赵杰，赵传钧研究了石英砂对十二烷基 苯磺酸纳的吸附”“。a l o p e z m a c i p e ，j g o m e z m o r a l e s ，r r o d r i g u e z c l e m e n t e 研究 了用碳酸钙吸附含有阴离子表面活性剂h o t 水溶液中的表面活性剂，对水进行净化，讨 论了a o t 的吸附等温线及晶体吸附a o t 的机理1 。 此外，磷酸钙常被用来吸附蛋白质；硅胶易吸水而吸附力下降，不适合在溶液中进 行；活性炭对大分子吸附能力更强。从理论上讲这样的吸附剂不适合在以蛋白质为目 标产物，h o t 为被吸附产物的分离研究中使用。 a o t 和蛋白质体系中，两种被分离的物质分子量大小存在明显差异，分子量较大的 蛋白质容易沉降，而分子量小的a o t 则容易留在上层溶液中，利用高速离心技术对其进 行分离是非常值得研究的，并且离心分离还不会使蛋白质的生物活性受影响。 高速离心分离技术( c e n t r i f u g a lt e c h n i q u e ) 是利用高速旋转运动的离心力以及 物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法，是一种机械分离 技术。离心机的设计和运行基于沉降原理，即比液体重的固体颗粒在一个预定的时间内 沉淀出来，离心力使固体颗粒加速，从而加快了分离过程，而某些设计可使颗粒获得大 于重力6 0 0 0 倍的加速度”。常用的离心机有沉降式离心机、碟片式离心机和管式高速离 心机。 离心技术应用相当广泛，在生物化学领域常用离心来分离化学反应后的沉淀物，天 然的生物大分子、无机物、有机物等；医学领域中离心主要用于分离细胞和细菌，纯化 和收集病毒、r n a 、d n a 、质粒和蛋白质等生物大分子；在中药领域用离心技术制备口服 河南工业大学硕士学位论文 液和固体制剂上的应用研究，证明用离心法提取中药的有效成分含量和产品的澄清度都 要优于传统的水提醇沉法。；在食品领域，高速离心技术更是渗透到各个环节，现代食 品工业生产中离心技术必不可少，如牛奶的脱脂、液体饮料的去杂澄清、乳化现象的破 乳分层等等。离心技术在工业废水处理领域的应用也取得了突破性进展，如食品工业的 明胶、植物油提纯、化学工业的各种废液以及城市废水的处理等等“。 高速离心技术在得到有效成分的同时，还保持了有效成分的活性，避免成分流失。 对于某些特殊的热敏性极高的有效成分的分离，还可采用冷冻高速离心技术，可以消除 高速运动产生的摩擦热，防止热敏的生物活性物质受热失活。这项技术工艺流程短、分 离过程的物耗低，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，使用容量较大的角式转子， 处理量大。同时，离心设备占地面积小；离心机几乎都采用高度自动化的设计，从而大 大降低了操作和监控要求，具有较高的操作安全性和可靠性，工人的劳动强度很小用工 的数量可以大大减少，运转成本低；独特的防磨设计延长了使用寿命，降低了维修费用 “。在目前的工业生产条件中，不需要多次投资，是具有推广意义的新型高效分离纯化 技术。 此外柱色谱，薄层色谱，高效液相色谱，高效毛细管电泳等技术也可用于混合物的 分离和物质的定量提纯，但是这些方法操作条件要求高，设备价格较高，分离时间较长， 处理量小，比较适用于实验室分析检测中。作为大豆蛋白生产工艺中的下游分离环节， 成本高收效慢，在工业生产中不易实现。 分离方法的选择必须对蛋白质与表面活性剂具有很好的选择性，既纯化蛋白质又能 保持蛋白质的活性，提高蛋白质食用性，而且对a o t 回收效果好。分离技术成本低又易 于普及实现工业生产，这样反胶束技术萃取蛋白质的生产工艺将向前迈进一大步，在资 源利用和环境保护及降低生产成本方面将有着重大的意义。 1 3 研究存在的问题 ( 1 ) 反胶束萃取所得的蛋白质溶液中存在a o t 残留的问题。 ( 2 ) 分离蛋白质和a o t ，选择何种分离方法可以得到较为满意的分离效果；分离技 术工艺的研究，以及分离方法的优缺点比较。 ( 3 ) 反胶束摹取所得的蛋白溶液中，残留的a o t 和蛋白质的存在状态还不太清楚： 研究蛋白质和a o t 的相互作用，便于选择分离方法和实现分离纯化。 ( 4 ) 分离后所得的蛋白质产品组分和分子构象是否会发生变化。 1 0 反胶束萃取大豆蛋白及分离技术研究 另外反胶束萃取蛋白和酶的机理还不清楚；对其动力学和热力学过程研究处于起步 阶段；大豆蛋白一次萃取率能否提高，与传统大豆蛋白相接近。 1 4 研究的主要内容 ( 1 ) 全脂大豆粉经反胶束萃取后，阴离子表面活性剂a o t 在油脂相和蛋白相中的分 配研究； ( 2 ) 冷冻高速离心法分离蛋白质和a o t 的最佳工艺研究； ( 3 ) 石英砂吸附法分离蛋白质和a o t 的最佳工艺研究； ( 4 ) 冷冻高速离心法和石英砂吸附法分离所得蛋白产品的组分分析及比较； ( 5 ) 通过荧光光谱分析，研究经a o t 萃取后所得蛋白液中蛋白质和a o t 的存在方式 及改变离子强度对荧光光谱的影响； ( 6 ) 冷冻高速离心法和石英砂吸附法分离所得蚤白产品的红外光谱分析研究。 河南工业大学硕士学位论文 2 1 主要试验材料及试剂 第二章材料与方法 名称 生产厂家 全脂大豆粉安阳升华植物蛋白有限公司 丁二酸二异辛酯磺酸钠( a o t ) 两次蒸馏水 异辛烷( a r ) 氯化钾( a r ) 磷酸二氢钠( a r ) 磷酸氢二钠( 从) 氯化钠( 从) 亚甲基蓝 浓硫酸 三氯甲烷( a r ) 双氧水 硫酸钾( a r ) 硫酸铜( a r ) 氢氧化钠( a r ) 硼酸( a r ) 盐酸( a r ) 石英砂( a r ) 氯化钙( a r ) 石油醚( a r ) 8 一巯基乙醇 上海联民化工厂 实验室自制 天津市博迪化工有限公司 洛阳化学试剂厂 北京市红星化工厂 北京市红星化工厂 上海华彭实业有限公司 天津市科密欧化学试剂开发中m 洛阳化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 上海化学试剂总厂 北京化工厂 北京化工厂 洛阳化学试剂厂 开封化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 宿州化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 m e r c k 公司 1 2 反胶束萃取大豆蛋白及分离技术研究 5 ，5 一二硫代双( 2 一硝基苯甲酸) ( d t n b ) s i g m a 公司 乙二胺四乙酸( e d t a ) 碳酸氢钠( a r ) 甘氨酸( b r ) 聚丙烯酰胺( a c r ) 三羟甲基氨基甲烷( t r is ) ( b r ) n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺( t e m e d ) 甲又双丙烯酰胺( b is ) 琼脂 过硫酸铵( b r ) 考马斯竞蓝r 一2 5 0 溴酚蓝 低分子量标准蛋白 透析袋( d 2 5 m m ) 上海化学试剂总厂 北京4 5 x - 厂 进口分装 s ig m a 公司 进口分装 p r o m e g a 公司 s i g m a 公司 上海伯奥生化科技有限公司 s i g m a 公司 进口分装 上海试剂三厂 中国科学院上海生化研究所 市售 2 2 主要试验仪器和设备 名称 t 产r 寨 d f - 2 型集热式磁力搅拌锅 l o l _ 2 型干燥箱 凯氏定氮仪 b s 2 1o s 电子分析天平 j y l0 0 0 1 型电子天平 t h z 一8 2 b 型气浴恒温振荡器 l d 5 - id 氐速离心机 金坛市医疗仪器厂 上海理光仪器厂 郑州玻璃仪器厂 德国s a t o r i u s 上海精密科学仪器有限公司 江苏省金坛市医疗仪器厂 北京市医用离心机厂 河南工业大学硕士学位论文 冷冻高速离心机 s h z d ( i h ) 循环水式真空泵 k 0 一c 型玻璃仪器气流烘干器 p h s - 2 9 a 型数字酸度计 s y z - i8 1o - b 石英双重纯水蒸馏器 索氏抽提器 u v 一2 0 0 0 型分光光度计 真空冷冻干燥机 d y y i0 型三恒电泳仪 垂直板电泳槽 凝胶成像仪 荧光光度计 红外分光光度计 上海安亭科学仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 上海精密科学仪器厂 江苏省金坛市医疗仪器厂 郑州玻璃仪器厂 尤尼柯( 上海) 有限仪器公司 l a b c o n c o 公司 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 美国 v a r i a n 公司 日本岛津 2 3 试验方法 2 3 1 原料( 全脂大豆粉) 中主要成分的测定 2 3 11 油脂含量测定 油脂含量的测定方法采用国家标准g b5 5 1 2 9 3 。 2 3 1 2 蛋白质含量测定 蛋白质含量测定方法采用国家标准g b t5 0 0 9 5 - 2 0 0 3 。 2 3 1 3 水分含量测定 水份含量的测定方法采用国家标准g b t 5 0 0 9 3 - 2 0 0 3 。 1 4 反胶束萃取大豆蛋白及分离技术研究 2 3 2a o i 标准曲线翩作 参考g b t 1 5 8 1 8 1 9 9 5 附录a 制作定量检测a o t 的标准曲线“”。 2 3 ，2 1 标准曲线的绘制 配置1 0 pg m e 的a o t 水溶液，从中分别移取o m l 、3 m l 、6 m l 、9 m l 、1 2 m l 溶液于2 5 0 m l 分液漏斗中加水至总量l o o m e ，相当于制备成浓度分别为0 ug m l 、0 3