金黄色葡萄球菌对万古霉素MIC值变化的研究 - 中国病原生物学杂志.doc

万古霉素对金黄色葡萄球菌mic值6年变化研究刘洪书 茆海丰 （江苏省连云港市第一人民医院检验科，江苏 连云港 222002）摘 要：目的 评价万古霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（mic）值是否存在漂移，并为临床抗感染治疗提供参考依据。方法 收集我院20062011年从临床标本中分离的288株非重复金黄色葡萄球菌，琼脂稀释法测定万古霉素对菌株的mic，计算mic50、mic90、mic几何均值，分析6年中万古霉素对金黄色葡萄球菌的mic值的变化趋势和分布。以苯唑西林对金黄色葡萄球菌mic值确认耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa），比较mrsa与对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（mssa）万古霉素mic值的差异。结果 收集到的288株金黄色葡萄球菌中，均对万古霉素敏感。6年金黄色葡萄球菌对万古霉素mic几何均值分别为1.169、1.118、1.042、1.019、1.019、1.086，未发现万古霉素mic值上升趋势。20062011年mrsa的检出率分别为40.7%、43.5%、46%、60%、29.6%、55.4%，差异具有统计学意义（p0.05）；mrsa与mssa对万古霉素mic几何均值差异有统计学意义（p0.05）。结论 本院20062011年临床分离株万古霉素mic几何均值无逐年上升趋势，未发现万古霉素对金黄色葡萄球菌的mic值漂移。关键词：金黄色葡萄球菌；万古霉素；mic值漂移study of vancomycin mic variance in staphylococcus aureus isolated over 6 yearsliu hong-shu, mao hai-feng (lianyungang first peoples hospital ,lianyugang, jiangsu 22002,china)abstract 0bjective to evaluate the creeping presence of vancomycin minimum inhibitory concentration (mic) against staphylococcus and provide a reference for clinical anti-infective therapy. methods 288 non-duplicate staphylococcus aureus strains were isolated from clinical specimens in our hospital from 2006 to 2011，vancomycin mic was determined by agar dilution method, and the mic50 and mic90, mic geometric mean was calculated. methicillin-resistant staphylococcus aureus (mrsa) was confirmed by oxacillin against staphylococcus aureus mic values, we compared the vancomycin mic values differences between it and methicillin-sensitive staphylococcus aureus (mssa). results all isolates were susceptible to vancomycin. from 2006 to 2011，the vancomycin geometric mean mics were 1.169、1.118、1.042、1.019、1.019、1.086 respectively, mic increase trends were not found. the occurrence of mrsa were 40.7 , 43.5 , 46 , 60% , 29.6% , 55.4% (p0.05 )there was a significant difference of mic between mrsa strains and mssa strains(p0.05)conclusion from 2006 to 2011，vancomycin mic did not increased over time , and no mic creeping existed in the study periodkey words staphylococcus aureus ; vancomycin ; mic creep金黄色葡萄球菌(staphyloccoccus aureus,sau)可以引起严重的社区和医院感染，尤其是mrsa在医院感染中占重要位置1，其除对甲氧西林耐药外，对其他-内酰胺类药物，即青霉素类、-内酰胺-内酰胺酶抑制剂复合物、头孢类和碳青霉烯类，可在体外实验显示活性，但临床治疗无效，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、利福平，均产生不同程度的耐药。万古霉素在治疗葡萄球菌感染中具有重要的作用，也是治疗mrsa感染的最经典药物。随着万古霉素使用时间的增加，其对金黄色葡萄球菌的敏感性也出现下降趋势，有报道称万古霉素金对黄色葡萄球菌的mic值有逐渐增高的趋势（万古霉素mic漂移）2。为了解万古霉素对本地区金黄色葡萄球菌mic值的变化情况，本文对2006-2011年从临床标本中分离的金黄色葡萄球菌万古霉素mic值进行了检测和分析，对本地区金黄色葡萄球菌是否存在万古霉素mic漂移现象作初步探讨。1 材料和方法1.1 试验菌株 收集本院微生物室分离的金黄色葡萄球菌非重复菌株共288株，其中2006年27株，2007年46株，2008年50株，2009年45株，2010年54株，2011年64株，菌株主要来源于住院病人送检的痰液、脓液及各种分泌物、血液、尿液、引流液、大便等标本，菌株鉴定采用microscan walkaway96(siemens healthcare diagnostics)或api(法国biomerieux公司)鉴定系统，所有菌株均在-80条件下保存，测定前复苏菌株。质控菌株为金黄色葡萄球菌atcc29213，购自卫生部临床检验中心。1.2 试剂与设备 抗菌药物万古霉素（va）(日本seishin laboratories公司产品)，水解酪蛋白琼脂（mh琼脂）购自杭州天和微生物试剂有限公司，比浊仪购自珠海迪尔生物有限公司。1.3实验方法1.3.1 mrsa检测方法 采用microscan walkaway96微生物鉴定药敏系统，测定苯唑西林对金黄色葡萄球菌mic值，根据2010年美国临床和实验室标准化协会（clsi）的标准，mic2gml为敏感，mic4gml为耐药，其中mic4gml的sau可确定为mrsa。1.3.2 mh琼脂药敏培养基的配置 按照clsi推荐的琼脂平板稀释法测定，先将万古霉素按要求配制成为1mgml的原液，取不同量的万古霉素原液加入经高压蒸汽灭菌(103.4kpa，121.3，1520min)、在水浴中冷却平衡至50左右的定量（38gl）mh琼脂水溶液中，充分混匀，倾倒制成含不同递减浓度抗菌药物的厚度为3-4mm的平板，每100 ml培养基分别加入原液800l、400l、200l、150l、100l、75l、50l、25l，其万古霉素的药物浓度分别为：8gml 、4gml、2gml、1.5gml、1.25gml、1.0gml、0.75gml、0.5gml、0.25gml。1.3.3 金黄色葡萄球菌的接种与培养 质控菌株atcc29213及试验菌株接种在mh平板上、35空气环境孵育18-24小时。取纯培养的单个金黄色葡萄球菌菌落于2ml无菌生理盐水中，调整其浓度达0.5麦氏浊度，再吸取200l菌悬液于另一管1.8ml无菌生理盐水，进行1：10的稀释以获得107cfuml的接种浓度，在15分钟内用1l接种环挑取一环该浓度菌液接种于含不同万古霉素药物浓度的mh琼脂药敏培养基上，待菌液充分吸收后反转平皿置于35培养箱内培养24小时后采用透视光观测细菌生长情况，记录无菌落生长的最低抑菌浓度。每批试验都加入质控菌株，以保证实验的准确性。按2010年clsi 标准，万古霉素mic2gml为敏感，4gml为耐药。1.4 统计学方法 mic数据采用whonet 5.4软件进行分析，应用spss 19.0进行统计学处理，检出率比较采用趋势卡方检验，mic值组间比较用秩和检验， p0.05为差异有统计学意义。2 结果所检测的20062011年的288株金黄色葡萄球菌对万古霉素均敏感（mic2gml），20062011年收集的288株临床分离菌株的mic几何均值分别为：1.169、1.118、1.042、1.109、1.019、1.086，未发现mic值上升趋势。万古霉素对菌株mic值分布如表2-1、图1所示。表2-1万古霉素对金黄色葡萄球菌mic值分布tab 2-1 percentage of isolates with vancomycin mic年份（菌株数）万古霉素mic(gml)值分布中位数mic值0.7511.251.522006（27）0（0.0%）14（51.9%）9(33.3%)2(7.4%)2（7.4%）1.1162007（46）1（2.2%）27（58.7%）15(32.6%)0（0.0%）3（6.5%）1.1182008（50）6（12.0%）30（60.0%）12(24.0%)1（2.0%）1（2.0%）1.0422009（44）0（0.0%）24（55.6%）19(42.2%)1（2.2%）0（0.0%）1.1092010（56）5（0.89%）42（75.0%）8(14.3%)0（0.0%）1（1.8%）1.1092011（65）3（4.6%）43（66.2%）10(15.4%)8（12.3%）1（1.5%）1.086合计（288）15（5.2%）180（62.5%）73(25.3%)12（4.2%）8（2.8%）1.110图1 6年mic变化趋势figure 1. vancomycin mic trend 200611.20062011年，mrsa检出率分别为40.7、43.5、46.0、60.0、29.6、55.4，其差异具有统计学意义（2= 13.74 ，p0.05 ）。6年mrsa和mssa的万古霉素mic几何均数分别为1.104、1.059，二者差异具有显著性（p0.05）。6年mrsa与mssa对万古霉素的mic、mic50、mic90、mic值几何均数等指标的测定结果见表2-2。表2-2 20062011年mrsa和mssa菌株对万古霉素mic值tab 2-2 number of isolates of mssa and mrsa by year with the indicated mics of vancomycin from 2006 to 2011年份菌株株数/株mic几何均值（gml）mic50（gml）mic90（gml）mic范围（gml）2006mrsa111.2431.51.51-2mssa161.1211.51-22007mrsa201.01911.50.75-1.25mssa261.2011.521-22008mrsa231.08111.50.75-2mssa271.00911.50.75-1.252009mrsa271.1411.51.51-1.25mssa181.06211.51-1.52010mrsa161.03411.50.75-1.25mssa381.01311.50.75-22011mrsa351.14611.50.75-2mssa291.01911.50.75-1.253 讨论自从1961年世界上第1例mrsa被分离出来，金黄色葡萄球菌特别是mrsa引起的感染治疗变得越来越复杂。长期以来，在某些mrsa引起感染的病例中万古霉素几乎是唯一可选择药物。近年来，尽管一些新的抗菌药物如：利奈唑胺、达托霉素等被应用于临床，但这些药物往往价格昂贵，同时也缺乏足够的证椐证明其临床效果优于万古霉素，所以万古霉素仍然是当前临床抗金黄色葡萄球菌特别是mrsa感染的最常用的药物。但是随着万古霉素的广泛使用，其对抗菌效果也出现了下降趋势。近几年来万古霉素mic漂移现象在国际备受关注，但研究结论并不一致3-5。国内张光艳等对三年184株金黄色葡萄球菌的万古霉素mic检测结果表明：存在mic值漂移趋势6，而梁晶晶对下呼吸道分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）万古霉素mic的检测未发现漂移现象发生7。本次研究对6年288株金葡菌万古霉素检测，未发现mic发生漂移现象。这可能与地区不同和菌株选择以及地区间万古霉素使用情况存在差异有关。本次实验没有发现万古霉素耐药（mic16g/ml和中度敏感菌株（mic4-8g/ml），但在敏感范围内（mic2g/ml）的高mic值菌株占有很高的比例，mic1g/ml菌株占94.8%、mic1.5g/ml菌株占32.5%。尽管万古霉素不敏感金黄色葡萄球菌少见，但体外试验敏感（mic2g/ml）而治疗失败的病例多有报道8-9，万古霉素的高mic值是导致治疗的失败的重要因素。研究显示：mic由1-2的血药浓度（15gml）下，auc/mic由60%下降至010-11。helmecke, b等报道：当万古霉素的mics 1.5gml治疗失败的几率是mic1.5 mg/l的两倍 (36.4%and 15.4%, p =0.049)12. 在一项万古霉素治疗mrsa菌血症的研究中，当mrsa对万古霉素的mico5gml时，治疗成功率为556；而当mic为12gml时，成功率仅为9513。本次检测虽然没有检测到万古霉素不敏感（mic4gml）存在,但高比例的敏感范围内的高mic值菌株存在应引起感控部门足够的重视。最近的研究表明，万古霉素mic为1-2gml水平时hvisa在医院获得性mrsa中占了相当高的比例14。这些研究高度提示mic为1.0gml时万古霉素治疗效果不佳可能是存在异质性万古霉素耐药问题15。本次研究没有对mic为1-2gml菌株进行hvisa检测，推测其中可能存在潜在的hvisa菌株。6年分离的金黄色葡萄球菌检测中，各年的mrsa检出率之间存在差异（p0.05），2006年至2009年mrsa的检出率呈逐年升高，2010年出现了明显降低，2011年又出现升高趋势，这可能医院感控部门在2010年度采取的mrsa防治措施有关。由于mrsa对氯霉素、氟喹喏酮类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类及磺胺类抗生素的耐药率均很高，目前mrsa感染的治疗主要依赖万古霉素。尤其是对mrsa中的多重耐药株，糖肽类抗生素是有效治疗的主要选择。万古霉素在临床上的广泛使用，逐渐造成了mrsa 对万古霉素敏感性的降低。尽管金黄色葡萄球菌对万古耐药机制并不明确，国外有关耐万古霉素金黄色葡萄球菌vrsa或者visa 均来自于mrsa 菌，推测mrsa应该较mssa对万古霉素有较高的耐药性。对所检测的菌株的mic结果分析显示：mrsa的万古霉素mic值高于mssa的mic值，二者差别有统计学意义（p0.05）。随着越来越多的h-visa、visa和vrsa在全世界范围内被检出，给金黄色葡萄球菌感染的治疗带来了严峻挑战，金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药问题已经给全世界敲响了警钟。加强万古霉素对金黄色葡萄球菌的mic值监测对评估万古霉素抗菌疗效、预防和控制万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌的出现和传播，延长万古霉素在临床抗感染中的使用时间具有重要意义。4 参考文献1 王敬华.耐万古霉素金黄色葡萄球菌的耐药机制和检测方法j.国外医学临床生物化学与检验学分册,2004年5月第25卷第3期2 hiratmatsu k , hnaki h, ino t , et al . methicillin-resist-ant 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