现代微生物技术在油气勘探中的应用.docx

2013年第20期内蒙古石油化工 79现代微生物技术在油气勘探中的应用刘雅慈1,2,3何 泽2“，张胜2”，殷密英23，宁卓2”，张翠云23(1中国地质科学院研究生院，北京1000372中国地质科学院水文地质环境地质研究所，河北石家庄0500613中国地质科学院地下水污染机理与修复重点实验室)摘要：在现代油气勘探中，油气微生物勘探技术可以辅助地质与地球物理劫探方法进行油气勘 探，以降低勘探风险。本文系统总结了油气微生物勘探的理论基础，着重介绍了现代微生物技术在该领 城的应用，指出现代微生物技术从分子水平出发，有效避免了传统方法中的弊端，显示出分子生物技术 的优越性。将现代分子生物学技术应用于油气勘探，有望为微生物油气勘探开创新的战略局面。关键词：油气徽生物劫探分子生物学技术；轻烃氧化茵中图分类号：P632十4 文献标识码：A 文章编号：10067981(2013)20一007906能源是人类社会赖以生存和发展的物质基础， 靠实验室培养，能够解决传统方法中弊端。例如：通 在国民经济中具有重要的战略地位。2009年，中国 过16S rDNA的克隆和测序可以确定环境中存在的 已超越伊朗成为全球第四大原油生产国，但中国同微生物种类和发现以前不为人知的多样性n，利用 时也是世界第二大原油需求国，国内产量相比巨大 实时荧光定量PCR技术可以对某种特定的微生物 的需求仍不足一半以上，中国仍需大量原油进口以进行定量分析23以及对细菌、藻类、环境激素等的 弥补缺口。因此，如何在国内勘探更多的石油和天然检测“，等等。因此，将现代分子生物学技术应用于 气是我国发展面临的重要问题之一。长期以来普遍 油气勘探，有望为微生物油气勘探开创新的战略局 应用的勘探技术是地球化学和地球物理技术。但是 面。 随着油气勘探的深入发展，剩余油气资源的分布愈 1油气微生物勘探的理论基础 加分散，油气藏越来越小而且非构造油气藏居多，常在油气藏压力的驱动下，油气藏的轻烃气体持 规勘探难度增大，勘探成本增高。现代生物技术迅速续地向地表作垂直扩散和运移，土壤中的专性微生 发展，利用生物技术对石油天然气进行勘探开采已物以轻烃气作为其唯一碳源和能源，在油气藏正上 经成为一种新的技术手段。油气微生物勘探技术可方的地表土壤中易于发育形成异常高值5】，通过检 不需要地质或地震资料，在没有进行过地球物理调测这种异常可以预测下伏油气藏的存在。 查的区域或者传统地球物理技术不能探测的复杂区 轻烃的微渗上浮过程是动态变化的，在油气田 域，此技术可进行廉价有效的初期勘探，降低钻探风开发过程中，油层压力降低，会减少上浮的轻烃气， 险，同时在勘探成熟区，此技术能够划分地震勘探查直接导致其垂直上方土壤中对应烃氧化菌含量的变 明的地质构造的各种含烃级别，尤其是对预测非常化，如果在不同时间检测到油气藏上方的这种变化， 规油气藏(如隐蔽性油气)和深部油气藏具有重要意 可以指示下伏油气藏开采动态及剩余油气分布以便 义。 开发中后期调整井的布设和开发方案。随着勘探技术的迅速发展，传统微生物检测方 与微生物勘探相关的细菌有两类：甲烷氧化菌 法已经无法满足人们的需求，迫切需要更加快速、灵 和短链烃氧化菌。在土壤中，甲烷氧化茵(methane 敏、准确的技术与方法。而现代分子生物学技术不依 -oxidizing bacteria，MOB)氧化消耗甲烷，甲烷氧收稿日期：201308-18 基金项目；地质调查项目(壤号：1212011120268)、中国地质科学院水文地质环境地质研究所基奉科研业务费(缩号：201214)联合费助。作者筒介：羽雅慈(1989一)，女，河舵沧硝人，硕士研究生，主要从事地质微生物研究。 通讯作者；张翠云(1962一)，女，研究更，博士，主要从事地质微生物和同位素研究。万方数据80内蒙古石油化工 2013年第20期化菌属于变形茵门(Proteobaeteria)的(甲基包囊菌 传统微生物方法即实验室培养方法被应用至今 科Methylocystaceae，type II)和(甲基球菌科 长达几十年，并且取得了不错的成就。该方法是在处 Methylococcaceae；type I)亚类6。甲烷氧化菌可以 理过的土壤中分别注入甲烷、丙烷或丁烷气体后再 利用各种各样的Cl化合物，包括甲烷、甲醇、甲基 培养一段时间，只有那些能在短期内以提供的烃源 胺、卤代甲烷和含硫甲基化合物7-。这类细菌不能 为食料的专性甲烷氧化菌或烃氧化菌，才能生长并 消耗糖(葡萄糖)或短链烃。常温、常压下，甲烷氧化 消耗掉一定量的轻烃气，经过培养后，通过MPN 菌(Methanotrophs)中甲烷单加氧酶(Methane (mostprobablenumber)10或平板计数法检测monooxygenase，简称MMO)能够催化甲烷转化为 细胞数量并记录生物化学活性。 甲醇，进而氧化成甲醛，甲醛或者被同化或者进一步2008年，Rasheed等1对研究区土壤样品中的 被细胞内的脱氢酶脱氢氧化生成co：和H20(图1)。 甲烷氧化茵、乙烷氧化菌、丙烷氧化菌进行平板计数，同时对土壤样品中的甲烷、乙烷、丙烷、丁烷含量进行分析，再结合样品的碳同位素数据，相互印证并 编制了研究区域的微渗漏浓度图，同时也验证了微 生物勘探的结果。2012年，Rasheed等153又在另一 研究区将土壤样品中的丙烷氧化菌数量和甲烷、乙 烷、丙烷、丁烷等气态烃的含量以及碳同位素相结合 进行分析，圈定了油气勘探的前景区。由此可见，地 质微生物勘探方法和化探、物探、现有的地质地震信圈1甲娩的氧化嘲息相结合时能发挥其最大的效用。 另一类微生物群体以短链烃(C2-一C6)作为能 传统实验方法中为了评价微生物异常，有一套量来源，不能够代谢甲烷，称之为短链烃氧化茵。代 对烃氧化菌的评价指标MU值(Measurement 谢这种短链烃的细菌种类随着烷烃链长的增加而线 Unit)。即综合每克土壤样品中的微生物数量(n)、 性增加。短链烃乙烷、丙烷、丁烷可以被众多的细菌 活性(a)、显微镜鉴定结果(o)、地层压力(f)、颜色利用，如枯草芽孢杆菌(Brevibacterium)，棒状杆菌 (c)、pH值(p)和地表植被(v)等因素，经归一化处理 (Corynebaeterium)，分枝杆菌(Mycobacteria)，黄杆 得出161刀(苗成浩等，2010；袁志华等，2008)。这套 菌(Flavobacteria)，诺卡氏菌(Nocardia)，假单胞菌 评价指标体系类似于美国GMT公司MOST技术专 (Pseudmonas)，组球菌(Rhodococcus)等。 利的MV值评价指标体系，具有一定的应用价值。不是所有的烃氧化菌都可以作为指示菌群的， 传统实验室培养方法一般会进行微生物显微测 一类微生物在实验培养条件下需要一定的适应期才 定、生化反应测定和生长活性测定等等，这些测定过 可以利用轻烃，被称为。兼性的”；另一类微生物群 程都无法避免实验室培养方法的弊端，即环境中不 体已适应自己生长的自然环境，在实验室培养条件 可培养的微生物种类高达99，并且培养过程的影 下不需要适应期，并立即以乙烷、丙烷和丁烷为食料 响因素很多，重复性很低。自然生态环境复杂多样， 而迅速生长，这类群体被称为“专性的”。因此，对不 微生物的生长与温度、pH值、养分和种闻的相互作 经任何适应期即可将长度为26个碳原子的正构 用有很大关系，简单的人工模拟无法再现微生物生 烷烃氧化的细菌进行检测，可以表明在研究的土样 长所需的自然环境，从而导致该方法仅能培养出极 中存在短链烃，进而指示地下油气的聚集n引。少数(少于1)的微生物。因此传统培养方法不能提 发现微生物异常的地区，根据异常的信号强度 供一个清楚完整的烃氧化菌群落结构和自然环境下 可以推测是油藏还是气藏。需要注意的是土壤的理 的准确数量，并且实验步骤繁琐，实验数据冗长，费 化性质可能会对微生物的生长造成影响1卜12，导致 力费时。Torsvik等1们利用染色法在荧光显微镜下 背景值或异常值偏低，但是不会影响异常区和背景 观察到1 g(干重)土壤中含有42x 1010个细菌细 区的相对浓度差异1引。在油气藏上方不只是微生物胞，而在培养平板上仅有42106个细菌茵落形成的细胞数量比背景区大，微生物的活性也比背景区 (CFU)。活跃。 3 现代分子生物学技术在油气勘探中的应用2传统微生物方法在油气勘探中的应用 分子生物学技术从分子水平对微生物进行检万方数据2013年第20期刘雅慈等现代微生物技术在油气勘探中的应用81测，不依靠实验室培养，可以更加准确完整的描述自 域的微生物种群多样性和监视种群动态变化方面都 然环境下的微生物数量和群落结构。目前，应用于油 表现出了其独特的优越性。DGGE分析技术具有可 气勘探相关研究的分子生物学技术主要有PCR技 靠、可重复、快速等特点。 术、荧光定量PCR技术、基因克隆文库、DGGE技基因芯片技术是将大量的DNA探针固定于固 术、基因芯片技术等。 相基质上，与待测的经标记的DNA样品杂交，只需荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied 一次实验，便能够将成千上万的基因表现形式记录 Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是 下来。基因芯片技术是一种高新生物技术，运用了大 通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产 规模集成电路制造技术，结合计算机、半导体、激光 物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应 共聚焦扫描、寡核昔酸合成、荧光标记探针杂交等。 的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的 基因芯片技术具有高通量、灵敏、快速的优点，因此 初始浓度。荧光定量PCR技术具有很多优点；不 更有可能实现快速、准确的油气微生物勘探目标，因 仅操作简便、快速高效、高通量，而且具有很高的敏 为油气指示微生物功能基因实时荧光定量PCR检 感性、重复性和特异性；由于是在封闭的体系中 测技术一次只能检测一种菌群，并且油气微生物勘 完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能 探采集样品量较大，基因芯片技术可同时检测两种 性并且无须在扩增后进行操作；有很大的动力学 以上菌群，可同时检测大量样品，具有快速、准确的 范围，可以在很大浓度范围内(109倍)进行定量； 特点。该技术在医学、食品、土壤生态等领域具有广既可以做定量分析又可以做定性分析；它还 泛的应用，虽然在油气微生物勘探方面的应用少见 可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对 报导，但是基因芯片技术在油气微生物勘探领域的 多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增1。因此，将应用潜力值得开发。 荧光定量PCR技术应用于油气指示微生物的定量下面针对不同的油气指示微生物分别介绍现代 检测，可以快速检测指示微生物的异常高值。 分子生物学技术在油气勘探中的应用。基因克隆文库分析法(Clone Library)现在仍是 31 甲烷氧化茵的应用 微生物生态研究中最主要的方法。该技术是将PCR 常用来作为指示微生物的是最占优势的甲烷氧 扩增的环境微生物样品总基因组DNA的rRNA基 化菌，因为油气藏向上运移的轻烃气体中含量最多 因片断(或其它标记基因)插入合适的载体，构建克 的是甲烷，并且甲烷氧化菌具有专一性，通过测定甲 隆文库以分离不同的序列，然后对克隆的序列进行烷氧化菌至少可以确定地下气藏的存在。同时，对于 测序，并对序列进行多样性和同源性分析。对于测得甲烷氧化菌的研究已经基本成熟，利用分子生物学 的序列，可以通过与基因数据库中已有数据的对比 技术检测甲烷氧化菌的研究也已经很多，但是存在 鉴定其系统发育地位。通过分析rRNA基因片断的 的问题是即使甲烷是天然气的主要组成部分，它的 类型和出现频率，可以得到微生物群落结构和多样存在也不是总能指示油气藏的存在。因为甲烷的来 性的详细信息。克隆文库分析的一个突出优点是能 源很多，例如天然气水合物、生物成因的甲烷等，由 够直接获得和分析环境中存在的未知序列，增加我 于来源的不确定性使得甲烷氧化菌对于油气藏的指 们对于环境微生物群落组成的认识。示作用具有一定的局限性。DGGE技术在1993年MuzyerC203等首次提出 甲烷氧化菌的功能基因常被用来检测甲烷氧化 应用于微生物生态学多态性研究，目前在环境微生 茵的存在和数量。甲烷氧化的第一步也是关键一步 物领域中是一种被普遍接受的进行微生物学群落复 是通过甲烷单加氧酶(MMO)将甲烷转化为甲醇， 杂性和行为研究的分子生物学工具。其原理是：不同 MMO分为两种：一种是膜约束微粒甲烷单加氧酶 序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性， (pMMO)，存在于几乎所有已经分离的甲烷氧化茵 发生空问构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最 中；另一种是可溶性的甲烷单加氧酶(sMMO)，只在 后在其相应的变性剂梯度位置停滞，经过染色后可 部分甲烷氧化茵中发现2u。甲烷氧化菌常用的功能 以在凝胶上呈现为分散的条带。种类不同的微生物 基因包括：pmoA、mmoX和maxF，分别编码颗粒状 的DNA序列不同，经电泳后的DNA条带的分布位 甲烷单加氧酶基因、可溶性甲烷单加氧酶基因以及 置不同，因此，我们可以通过分析比对各通道DNA 甲醇脱氢酶基因，这些功能基因中pmoA基因存在 条带的位置来确定微生物多态性。该方法在各个领 于除methylocella以外的所有已知的甲烷氧化茵万方数据82内蒙古石油化工 2013年第zo期 中22】，因此pmoA基因被广泛运用于甲烷氧化茵的 关；可溶性二铁丙烷单加氧酶能够参与末端和近末检测和定量23_2。每个甲烷氧化菌细胞内可能含有端的丙烷氧化，但是底物范围不同；含铜单加氧酶与2个pmoA基因拷贝，由此可以在基因含量和细菌 pMMO相似。另外一种典型的氧化较长链的正构烷 含量之间进行转换。 烃的链烷烃羟化酶也可以氧化丙烷和丁烷但不能氧 Horz HP等25】分别做了pmoA、mmoX，、化乙烷3。虽然由于酶和底物的多样性使得很难找 mxaF功能基因的检索和16S rRNA基因测序，结果 到确认乙烷或者丙丁烷氧化菌的单一的功能基因，清楚的说明pmoA基因可以作为一个优秀的分析甲但是近年来的研究也取得一定成果。 烷细菌多样性的标志基因，同时提出以pmoA基因Redmond等3妇利用SIP(stable isotope 为基础的T-RFLP分析方法可以快速准确的检测 probing)结合TRFLP和16S rRNA、pmoA基因 甲烷氧化菌的多样性。张凡等2盯构建了油气田土壤测序的方法检测了轻烃渗漏上覆沉积物表面的甲 剖面的微生物16S rRNA和pmoA功能基因克隆文 烷、乙烷、丙烷氧化茵类型，然后推测乙烷氧化茵中 库，揭示了细菌的群落结构和不同深度甲烷氧化菌 存在一个与pmoA相似的功能基因编码乙烷单加氧 群落的分布及多样性，采用荧光定量PCR技术和传 酶。张莹等c32】对湖北和四川油气田区土壤可培养丁 统培养方法分别检测甲烷氧化菌的数量，结果显示烷氧化菌的16S rRNA基因进行了PCR扩增和测 前者的检出量较后者高出l2个数量级。Kolb 序，将传统培养方法与现代分子生物学技术结合起 等27】利用以pmoA为靶基因的荧光定量PCR技术 来，探讨了不同油气田区丁烷氧化菌的多样性。 定量分析环境中甲烷氧化菌的群落结构以及甲烷氧 Chanr2】利用编码丙烷单氧酶的大羟化酶亚基的保 化菌数量占总细菌数的比伢。Kallistova等28则利守核瞢酸序列prrnA和编码丁烷单氧酶的羟化酶亚 用CARDFISH(catalyzed reporter deposition 基的保守序列bmoX设计出三个可以用来特异性指 FISH)技术测定甲烷细菌的数量，并且证明了示丙烷氧化菌和丁烷氧化菌的PCR引物序列，并成 CARD-FISH技术与传统的MPN计数法相比的优功检测出丙丁烷氧化茵，为后续丙丁烷氧化菌的定 点。量和群落结构等分析奠定基础。此外，烷烃降解菌的32其他烃氧化茵的应用特异功能基因alkB也加入了微生物油气勘探分子 丙烷和丁烷也是上升轻烃气体的重要组成成生物技术的研究之列。Xu等33以alkB基因为基础， 分，与甲烷来源的不确定性相比，丙烷和丁烷唯一的研究了油气藏上覆土壤中烷烃降解菌的多样性和丰 地下来源就是油气藏。但是就像前面提到过的，并不富度，利用了末端标记限制性片段长度多态性技术 是所有的短链烃氧化茵都可以作为指示茵群的，丙 (T-RFLP)、实时定量PCR等多种分子生物学技 烷氧化菌或丁烷氧化菌不是以丙烷或丁烷为单一能术，研究结果表明油气田土壤和土壤背景区优势烷 源或碳源，它们还可以利用单糖和多糖类，因此仅仅烃降解菌种类不同，油气藏上覆土壤中的alkB基因 检测到丙烷氧化菌和丁烷氧化菌并不能指示油气藏含量观显高于背景区，最后指出即使微量渗漏的轻的存在。然面，由于气态烃的持续供给使得油气藏上烃气都可能导致表层土壤微生物群落结构的变化。 覆土壤中的丙烷氧化菌和丁烷氧化菌大量积累，与4结束语 土壤背景值相比，数量异常大，因此可以通过检测这油气微生物勘探技术具有直观性、经济有效、多 种异常来指示油气藏2。解性小等优点。如果将此技术与地质、地球化学和地对。专性的”乙烷、丙烷和丁烷氧化菌指示作用球物理方法结合起来进行石油勘探，能够对未知地 的研究也日益增多。大多数的丙烷氧化茵可以氧化 区进行廉价有效的初期勘探，降低钻探风险，同时在 丁烷和一系列的正构烷烃，但是很难氧化乙烷，几乎 勘探成熟区，这项技术能够划分地震勘探查明的地 不能氧化甲烷，目前还没有发现能够以甲烷作为唯 质构造的各种含烃级别，尤其是对预测非常规油气 一碳源的丙烷氧化菌。和甲烷代谢过程相似，乙烷和藏(如隐蔽性油气)和深部油气藏具有重要意义3。 丙烷的需氧代谢的第一步也是将链烷烃氧化为 油气微生物勘探技术的局限性是其只能确定有无油 醇划。有几种酶参与此过程的催化作用，例如：可溶气藏，并对油气藏定性判别，不能预测油气藏深度、 性的二铁丁烷单加氧酶、可溶性二铁丙烷单加氧酶、厚度和大小(但可以判别油水边界)。 含铜单加氧酶和氨单加氧酶。其中可溶性二铁丁烷现代微生物技术以其快速、灵敏、先进的优势得 单加氧酶与sMMO(可溶性的甲烷单加氧酶)基因相到越来越广泛的关注和应用，现代分子生物学技术万方数据2013年第20期羽雅慈等现代微生物技术在油气勘探中的应用83的应用为微生物的研究注入新的活力，为解决传统83Hanson R S，Tsien H C，Brusseau G A，et a1 方法存在的问题提供了新的突破点。充分应用分子Biodegradationof low molecularweight 生物学技术检测微生物和分析微生物群落等是未来halogenated hydrocarbons by methanotrophic 发展趋势，应该将更多的分子生物学技术借鉴并应bacteriaJFEMS Microhiol。Rev，1990， 用于微生物油气勘探技术，发挥交叉学科的优势。寻87：273278 找更多油气指示微生物的功能基因，例如；乙烷氧化9 Schhgel H GAllgemeine mikrobiologie：乙菌、丙丁烷氧化菌和烷烃降解菌的功能基因，不应仅stuttgartGeorg thieme Verlag1992：458 限于甲烷氧化菌作为指示微生物，将多种指示微生 469 物的检测联合起来，相互印证，相互补充，使结果更10Wagner M，Wagner M，Piske J，et a1Case 加精确。这就更加需要快速、自动化、高通量的分子 histories of microbial prospection for oil生物学技术。总之，将现代微生物技术应用于油气勘and gas，onshore and offshore in northwest探必将给我国的油气资源勘探开创战略性的新局EuropeSurface exploration case histories：面。Applications of geochemistry，magnetics，andremotesensing AAPGStudies in参考文献Geology2002，(48)：453-4791Hugenholtz P，Goebel B M，Pace N R 11Liebner S，Rublack K，Stuehrmann T，et a1 Impact of culture-independent studies on Diversity of aerobic methanotrophic bacteria the emerging phylogenetic view of bacterial in a permafrost active layer soil of the Lena diversityJournal of bacteriology1 998， Delta，SiberiaMicrobial ecology2009，57180(18)：4765-4774(1)：25352Dionisi H M，Harms G，Laymn A C，et a112吴传芝油气勘查中的微生物测量法D国 Poweranalysis for realtimePcR 外地质勘探技术，1995：2126 quantification of genes in activated sludge 13张春林，庞雄奇，梅海，等微生物油气勘探技 and analysis of the variability introduced by 术在岩性气藏勘探中的应用一以柴达木盆地DNA extractionApplied and environmental三湖坳陷为例口石油勘探与开发，2010，37microbiology2003，69(11)：65976604 (3)：3103153Skovhus T L，Ramsing N B，Holmstr?m C，et 14 Rasheed M，Veena Prasanna M，Satish a1Realtime quantitative PCR for Kumar T，et a1 Geomicrobial assessmentof abundance of prospecting method for hydrocarbon Pseudoalteromonasspecies in marine exploration in Vengannapalli Village， samples Applied and environmental Cuddapah Basin，IndiaCurrent sciencemicrobiology2004，70(4)：23732382 2008，95(3)：3613664魏春花，彗文炉，周启星，等荧光定量PCR 15Rasheed M A，Kalpana M S，Veena P M，et技术在环境领域的应用中国环境监测a1Geomierobialand light gaseous2012，28(4)：4853 hydrocarbon anomalies in the near surface 5王冰冰，李治平油气微生物勘探技术的应用soilsof DeccanSyneclise Basin，India： 历史及前景分析内蒙古石油化工2008：24 ImplicationstOHydrocarbonResource28PotentialJournal of petroleum science and6Hanson R S，Hanson T EMethanotrophic engineering2012：33-41 bacteriaMicrobiological reviews1 9 96，6016 苗成浩，袁志华大庆宋芳屯油田石油微生物 (2)：439471 勘探J断块油气田，2010，17；7227257 Anthony CBacterial oxidation of methane17袁志华，张玉清，赵青，等中国油气微生物andmethan01 Adv MicrobPhysi01 勘探技术新进展以大庆卫星油田为例1986，27：113210 口中国科学(D辑：地球科学)2008，38万方数据内蒙古石油化工 2013年第20期 (增刊I)：139145microbiology2001，67(9)：41774185181Torsvik VMicrobial diversity and function 26Zhang F，She Y，Zheng Y，et a1Molecular in soil：from genes tO ecosystemsCurrent biologic techniques applied tO the microbial opinion in microbiology2002，5(3)：2402 prospecting of oil and gas in the Ban 8762451 gas and oil field in China Applied19 睬旭，齐凤坤，康立功，等实时荧光定量 microbiology and biotechnology2010，86PCR技术研究进展及其应用J东北农业(4)：11831194大学学报2010，41(8)：14815527 Kolb S，Knief C，Stubner S，et a1 203Muyzer G，De Waal E C，Uitterlinden A GQuantitative detection of methanotrophs Profiling of complex microbial populationsin soll by novel pmoAtargeted realby denaturing gradient gel electrophclresis time PCR assays Applied and analysis of polymerase chain reaction Environmenml Microbiology2003，69 amplified genes coding for 1 6S rRNA (5)：24232429Applied and environmental microbiology 28Kallistova A Y，Kevbrina M，Nekrasova V，1993，59(3)：695-700eta1Enumerationof methanotrophic 21Murrell J C，McDonald I R，Bourne D Gbacteria in the cover soil of an aged Molecular methodsforthe studyofmunicipal landfillMicrobialecologymethanotroph ecology FEMS 2007，54(4)：637645microbiology ecology1998=103114 29Chan B JPCR Primers for the Detection of22Dedysh S N，Liesack W，Khmelenina V N，et Propane and Butaneoxidizing a1Methylocella palustris gennov，spMicroorganisms California Polytechnic nov，a new methane-oxidizing acidophilicState University，San Luis Obispo2011 bacterium from pea