肿瘤侵袭转移实验技术.ppt

肿瘤侵袭 转移实验技术 首都医科大学2015 11 目录 一 概述二 细胞划痕实验三 Transwell四 裸鼠尾静脉注射实验五 总结 一 概述 二 细胞划痕实验 细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法 实验成本低 可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的迁移能力 实验优点 1 在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程 2 适合研究细胞与胞外基质 ECM 细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移 3 与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容 可用于分析细胞间的相互作用 4 研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法 二 细胞划痕实验 实验材料 细胞样品仪器 耗材 6孔板marker笔直尺枪头试剂 试剂盒 无血清培养基 PBS 二 细胞划痕实验 1 所有能灭菌的器械都要灭菌2 超净工作台紫外线消毒30min注 需要灭菌的器材包括 离心管 吸管筒 移液枪 枪头等 二 细胞划痕实验 4 每孔加入5X105个细胞并培养约24h注 1 数量以过夜贴壁能铺满为宜 适当调整2 数量少时可培养一段时间至铺满板底 3 6孔板背面画线5 6条 二 细胞划痕实验 5 用1ml枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕 尽量保证各个划痕宽度一致注 人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性 影响实验结果 这也是该方法最大的缺陷 二 细胞划痕实验 6 吸掉旧培养基 用无菌PBS冲洗细胞3次 去除划下的细胞后 再加入无血清培养基 根据需要设加实验组 对照组 注 冲洗时温柔 贴壁加入 避免冲掉单层细胞 二 细胞划痕实验 7 放入37度5 CO2培养箱 培养 按0 6 12 24小时取样 拍照 8 计算 比较 分析 imageJ软件计算每个视野的划痕面积 二 细胞划痕实验 新 德国IBIDI 易必迪 技术 1 准备细胞 培养液 cultureInsert 2 将细胞接种于Dish中间的Insert 培养 3 细胞长满Insert区域后用镊子移除Insert即可产生500 m宽度的划痕 4 每隔4 6小时拍照记录 5 根据收集图片数据分析实验结果 二 细胞划痕实验 谈几点问题 1 细胞的选择 一般适用于上皮 纤维样细胞系a 本身有迁移能力 且较强 b 有极性 方便测量 观察 c 对无血清有较强的忍受力 2 观察的时间 一般为0 6 12 24ha 时间太久 无血清 易死亡 相对坚强b 时间太久 细胞繁殖 假阳性 二 细胞划痕实验 三 Transwell Transwell是一种应用Transwell小室来探究细胞共培养 细胞趋化 细胞迁移 细胞侵袭等的问题的实验技术 三 Transwell Transwell小室 常用8 0um膜 铺胶130rmb 不铺胶40rmb 可重复利用 上层培养液 无血清培养基 为维持渗透压 需加入0 05 0 2 BSA 细胞 有侵袭能力细胞先撤血清让细胞饥饿12 24h 再进行实验 材料准备及说明 三 Transwell 基质胶 常用的是人工重构基底膜材料Matrigel 下层培养液 含5 10 FBS的培养基 也可用趋化因子 细胞培养板 6孔板 12孔板 24孔板等 以24孔最常用 材料准备及说明 三 Transwell 1 Transwell小室制备 包被基底膜 用50mg LMatrigel1 8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面 4 风干 水化基底膜 吸出培养板中残余液体 每孔加入50ul含10g LBSA的无血清培养液 37 30min 三 Transwell 2 取细胞悬液加入Transwell小室 24孔板小室一般200 l 细胞密度为1 10 105个 3 24孔板下室一般加入500 l含FBS或趋化因子的培养基 三 细胞划痕实验 4 培养细胞 常规培养48h 具体调整 5 结果测定 直接测定 细胞染色 镜下计数 间接测定 MTT法 荧光试剂检测 结晶紫染色 问 某药可抑细胞侵袭 24h后可抑制细胞增殖 可以培养36h看结果吗 三 Transwell 直接观察 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色 推荐采用0 1 结晶紫固定染色 细胞计数 把小室反过来直接观察或把膜切下直接染色 取若干个视野计数细胞个数 问 先后问题 三 Transwell 间接观察 结晶紫法 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色 推荐采用0 1 结晶紫固定染色 染色后可以用33 醋酸脱色 将结晶紫完全洗脱下来 洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值 间接反映细胞数 四 裸鼠尾巴静脉注射 小鼠肿瘤转移模型分类 1 人工转移模型 将肿瘤细胞体外培养株或腹水等行注射 在肺 尾静脉注射 脑 颈动脉注射 肝脏 肝动脉注射 等部位观察2 自发转移模型 肿瘤细胞接种在小鼠腋部或足趾的皮下 腹腔肌肉或原组织中 观察转移灶 四 裸鼠尾巴静脉注射 1 裸鼠的选择 4 6周裸鼠 价格约100 rmb2 细胞的选择 查阅文献 选择合适细胞株 细胞浓度 具体不定 动物肿瘤一般接种2 600万 只就100 成瘤 而人癌则需要1000万以上才能较高的成瘤 四 裸鼠尾巴静脉注射 3 注射技巧 固定 50ml离心管自制或购买成品 注射位置 鼠尾部侧面的2条静脉 一般在尾部远端的1 3到1 2处进针 注射 选择1 2ml注射器 针头采用4号或4 5号 凸显静脉 温水 烤灯等 四 裸鼠尾巴静脉注射 问 如何判断已经注射进入 注射到静脉的推液几乎没有阻力 可快速将液体推完通常600ul可在10秒推完 如果注射到静脉以外 强行推液 阻力较大 注射处周围会出现露水样渗液 而且出针后 出血较少 并且由于