福建光泽第一中学2014高中生物教师论文矮牵牛中chsA基因的2个启动子在F2分离群体中的分离情况分析.doc

福建省光泽第一中学2014高中生物教师论文 矮牵牛中chsA基因的2个启动子在F2分离群体中的分离情况分析摘要：本文以矮牵牛花幼苗为材料,提取基因组DNA;根据GenBank公布的chsA基因启动子序列，设计并合成PCR引物,克隆出chsA基因启动子DNA,并构建到pMT18-T载体, 转化DH5，获得阳性克隆，经检测后测定序列，萌发矮牵牛（F1）种子,获得实生苗（F2代），利用矮牵牛幼嫩的叶片提取基因组DNA，通过普通PCR扩增出chsA基因启动子DNA，电泳观察条带的多少和大小，统计学分析F2植株中只具有PchsA-L、只具有PchsA-S和同时具有PchsA-L和PchsA-S条带的单株的比例，进行遗传学分析。关键词：矮牵牛（Petunia）；基因组（Genome）；PCR扩增（amplificationPCR ）；引物（Primer）自1983年首次获得转基因植物以来，植物基因工程研究就进入了蓬勃发展的阶段。由于组成型启动子在使用过程中逐渐暴露出一些问题（Kumpatla等，1998），寻找更为有效的组织、器官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控基因表达成为近年来基因工程的热点。在众多组织特异的启动子中，植物花特异表达启动子的克隆不仅可以通过调控特定基因的表达来提高农作物产量、品质，而且还可以通过RNAi等技术抑制或破坏花特异基因的表达，来创造雄性不育系；在花色基因工程方面，还可以创造颜色各异、形态奇特的花色品种等，因此具有重要的意义和应用价值。目前已相继分离和鉴定了许多花特异表达基因的启动子，其中查尔酮合酶基因（chs）的启动子研究较多。我国的张树珍等（2002）、洪亚辉等（2003）、刘佳等（2004）、夏江东等（2006）先后报道从矮牵牛（Petunia hybrida）中克隆了chsA基因的启动子。特别有意思的是他们克隆的启动子除了个别碱基差别外，最大的差别是洪亚辉等（2003）克隆的启动子缺少了一段150bp左右的序列，而这段序列中不存在典型的调控元件，但经Splice site prediction分析，发现其符合内含子的序列特征。克隆并比较这两个启动子功能差异，不但可以作为花特异启动子来进行应用，而且将为进一步研究启动子的调控机理和启动子上的顺式作用元件与相应的反式作用因子的协同作用机理提供基础。本文以矮牵牛为材料，导入chsA基因的2个启动子，获得F1代种子，并萌发其F1代种子，获得130株F2代实生苗，利用矮牵牛幼嫩的叶片提取基因组DNA，通过普通PCR扩增出chsA基因启动子DNA，电泳观察条带的多少和大小，统计学分析F2植株中只具有PchsA-L、只具有PchsA-S和同时具有PchsA-L和PchsA-S条带的单株的比例，进行遗传学分析。旨在了解该基因在矮牵牛后代中是否符合遗传规律，是否能够在后代稳定的表达。1.材料和方法1.1实验材料矮牵牛（Petunia hybrida）栽培品种为QL01（杭州市苗圃花卉公司培育），自然条件下生长。菌种XL1-Blue MRF、野生型发根农杆菌K599、质粒pBIN19和pGFP均由本实验室保存；质粒pCHS由中国台湾中央研究院生物农业科学研究所陶建英博士惠赠。1.2矮牵牛后代的繁殖取矮牵牛后代种子撒播在含泥炭：草木灰=2：1的基质中萌发，白天温度25，夜间温度18，萌发后，待长到2cm左右的高度时，分盆种植在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室人工气候室中。1.3矮牵牛基因组DNA的提取供试种子在26的培养室萌发生长两周，取矮牵牛幼苗剪碎后放入研钵内，加液氮研磨成细粉，转移到50mL的离心管中，加入事先预热至60的抽提液20mL（100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5%SDS）。将50mL的离心管来回颠倒数次，60水浴1h，期间振荡几次，随后在37振荡（60r/min）20min。加入20mL氯仿乙醇异戊醇（80164，v/v），轻轻摇匀，4、11000r/min离心10min；取上层液相再加入20mL氯仿乙醇异戊醇（80164，v/v），轻轻摇匀，4、11000r/min离心10min。取上层液相，加入等体积的异丙醇沉淀，4、11000r/min离心5min。弃上清液，沉淀用70%的乙醇清洗2次，室温下干燥后溶于ddH2O中备用。1.4 引物的设计 参照van der Meer等（1990）报道的序列和GenBank中登录号为S52984的序列（见表1-1），设计1对特异性PCR引物PchsA-UP和PchsA-DOWN，在5端分别加上了Hind 和Xba I酶切位点和2个保护性碱基序列，引物由上海Sangon公司合成。引物序列为：PchsA-UP：5-GGAAGCTTTTCCTGTTCAAAGCTGATG-3，PchsA-DOWN：5-GCTCTAGACGATTTTTGCTTGAAAAAAG-3。AY360358 TTCCTGTTCAAAGCTGATGCTAGAAGTGACAGAAATCATATGCAAGAATGATCAAGGCCAPchsA-S TTCCTGTTCAAAGCTGATGCTAGAAGAGACAGAAATCATATGCAAGAATGATCAAGGCCAS52984 TTCCTGTTCAAAGCTGATGCTAGAGGTGACAGAAATCATATGCAAGAACG-TCAAGGCCAPchsA-L TTCCTGTTCAAAGCTGATGCTAGAAGTGACAGAAATTATATGTAAGAATGATCAAGGCCALiu seq TTCCTGTTCAAAGCTGATGCTAGAAGTGACAGAAATACTATGTAAGAACCATCAAGACCAXia seq TTCCTGTTCAAAGCTGATG-A-AA-T-CA-TATGTAAGAACGATCAAGACCAZhang seq TTCCTGTTCAAAGCTGATGCTAGAAGTGACAGAAATCATATGTAAGAAC-GTCAAGACCA * * * * * * * *AY360358 TTCATTTTGGTTCAAC-AGATTGATGAAAAAT-PchsA-S TTCATTTTGGTTCAAC-AGATTGATGAAAAAT-S52984 TTCATTTTGGTTCAAC-AGATTGATGAAAAAT-PchsA-L TTCATTT-GGTTCAAC-AGATTG-AAAAATC-TAAAG-GGTCG-TTCGGTACGAGLiu seq TTCATTT-GGTTCAACCAGG-G-GCGGATCGATGGAATTCAGTAGGTTTGGTGC-AGXia seq 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The character sequences of promoter in PchsA-L and PchsA-S are marked with shadow and bold. GTAT flanking at intron of PchsA-L is boxed.1.5 PCR扩增PCR扩增反应体积为35 L（见表1-2）中包括2 L 0.1 mmol/L的dNTP混合物(德国Roches公司产品)，2L 10 pmol/L的PCR引物，2 u Easy-A High-fidelity PCR cloning enzyme(美国Stratagene公司产品)和约50 ng基因组DNA。用美国ABI公司PE9700型DNA扩增仪进行扩增反应。PCR反应程序为：94 5 min变性后，按94 45 sec、55 45 sec、72 90 sec的设置进行30个循环，反应结束后在72下延伸10min，随后于4保存备用。扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5 V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用美国Bio/Rad凝胶成像系统观察并拍照记录。表1-2，反应体系PCR amplification systerm成份 Ingredient体积 Volume（L）ddH2O22.510Buffer（含15mmol/L Mg2+）3.5dNTP（2mmol/L）2Primer1（10pmol/L）2Primer2（10pmol/L）2DNA template（50100ng/L）2Taq polymerase（2u/L）1Total352 结果与分析2.1实验结果。图1.1牛后代群体PCR检测M：1Kb Plus DNA Ladder分子量标记；146：矮牵牛F1代单株。Fig.3.10 Results of PCR amplication rom genomic DNA of F1 individuals of Petunia hybridaM: 1Kb Plus DNA Ladder molecular marker; 146:F1 individuals of Petunia hybrida.图1.2牛后代群体PCR检测M：1Kb Plus DNA Ladder分子量标记；4792：矮牵牛F1代单株。Fig.3.11 Results of PCR amplication rom genomic DNA of F1 individuals of Petunia hybridaM: 1Kb Plus DNA Ladder molecular marker; 4792:F1 individuals of Petunia hybrida.图1.3牛后代群体PCR检测M：1Kb Plus DNA Ladder分子量标记；93130：矮牵牛F1代单株。Fig.3.12 Results of PCR amplication rom genomic DNA of F1 individuals of Petunia hybridaM: 1Kb Plus DNA Ladder molecular marker; 93130:F1 individuals of Petunia hybrida.2.2矮牵牛后代群体两个启动子分离比分析由于通过1次PCR同时扩增出2个启动子，而其他实验室（张树珍等，2002；洪亚辉等，2003；刘佳等，2004；夏江东等，2006）只能克隆出其中的一个启动子，我们推测所用的矮牵牛材料可能为杂合体，因此将矮牵牛通过自交授粉后结出的种子进行了萌发，以进行后代群体的分离情况分析。提取矮牵牛后代群体130个单株基因组DNA，利用PchsA-