叶绿体的分离与荧光观察四部分.doc

实验二 叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。二、实验原理1、叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。分离过程最好在05的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。2、有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。本实验利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。三、实验步骤1.选取新鲜的嫩白菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称3g放于玻璃研钵中，加入10ml0.35mol/LNaCl溶液，匀浆3 5min。 2.匀浆液用2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。 3.将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。弃去沉淀。 4.将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清，沉淀即为叶绿体。5.将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片： 取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察； 取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1-2滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片观察： 在普通光镜下观察； 在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察，找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光作光源，用暗视野观察。 6.撕取白菜叶片下表皮一小片置于滴有清水的载片上，盖上盖玻片，在普通光镜下观察气孔的形状，保卫细胞里面的叶绿体；随后转置荧光显微镜下观察。四、结果与分析观察方式普通显微镜荧光显微镜（自发荧光）染色后荧光叶绿体悬液观察结果保卫细胞叶绿体观察结果因时间问题，未拍照片，但和其他同学一起观察了。结果分析与讨论1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。2、普通光镜下，可看到成对出现的呈半月形的保卫细胞组成了气孔，保卫细胞里有许多绿色的小颗粒，即叶绿体。1、荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿体自发荧光为火红色，背景为黑色。叶绿体产生自发荧光的机理是叶绿体在汞灯的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，能在极短的时间内直接放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，即自发荧光。2、荧光显微镜下，可看到保卫细胞里的叶绿体可发出亮红色的荧光，背景为红色，气孔仍为绿色，叶绿体沿着气孔边沿连成了环状，其产生自发荧光的机理如上分析。（以其他组同学所拍的照片为参考）荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，加入吖啶橙染色后直接荧光消失，次生荧光为桔红色，背景为黑色。机理：吖啶橙是一种芳香杂环阳离子染料可透过细胞膜，不同浓度的吖啶橙溶液所呈现的荧光颜色不同，低浓度时主要以单体存在，较高的浓度则以二聚体或多聚体的形式存在。叶绿体的自发荧光消失的原因是荧光淬灭现象所致。吖啶橙阳离子是进入叶绿体膜内通过影响叶绿素分子结构或所处的化学环境使自发荧光淬灭的。而次发荧光由来，大部分来自叶绿体的对吖啶