毕业论文--灰霉菌转录因子Zn(2)-Cys(6)基因敲除载体的构建.docx

中文摘要灰霉菌是一种全球性植物致病真菌，在引起宿主植物的灰霉病。病原体可以侵染500多种植物，每年会造成巨大的经济损失。我们从具有超过50,000个T-DNA标记的转化子的灰霉菌突变体文库筛选致病性减弱的突变体，使用热不对称交错PCR（Tail-PCR）和序列分析方法，我们发现T-DNA标签插入到灰霉菌Zn（2）-Cys（6）转录因子的基因启动子区域，导致在病原体毒力的减弱。含有Zn(2)-Cys(6)锌指结构域的转录因子是灰霉菌中基因数量较多的转录因子家族。目前仅在真菌中发现了该转录因子，其对真菌生长发育的转录调控有积极作用。为了进一步阐明Zn（2）-Cys（6）转录因子基因在灰霉菌生长发育过程中的调节作用，我们构建了灰霉菌Zn（2）-Cys（6）转录因子的敲除载体，并希望获得Zn（2）-Cys（6）转录因子基因的缺失突变体进行进一步研究。关键词：灰霉菌；Tail-PCR；转录因子；Zn(2)-Cys(6)；敲除载体AbstractBotrytis cinerea is a global plant pathogenic fungus that causes gray mold on host plants. The pathogen can infect more than 500 plant species and causes huge economic losses each year. A pathogenicity-attenuated mutant was screened from Botrytis cinerea mutant library that contains over 50,000 T-DNA tagged transformants. Using the methods of thermal asymmetric interlaced PCR (Tail-PCR) and the sequence analyses, we found that the T-DNA tag inserted into the gene promoter region of B. cinerea Zn (2) -Cys (6) transcription factor, which resulted in the attenuation of the pathogen virulence. The transcription factor containing the Zn (2) -Cys (6) zinc finger domain is a family of transcription factors with many gene members in the Botrytis cinerea. The transcription factors, currently only found in fungi, have a positive effect on the transcriptional regulation of fungal growth and development. In order to further elucidate the regulation of Zn (2) -Cys (6) transcription factor gene in the growth and pathogenesis of B. cinerea, we generated the knockout vector of B. cinerea Zn (2) -Cys (6) transcription factor, and hoped to obtain a gene deletion mutant of the Zn (2) -Cys (6) transcription factor for our further study.Key words: Botrytis cinerea; thermal asymmetric interlaced PCR (Tail-PCR)； transcription factor；Zn (2) -Cys (6)；knockout vectorII目录前言1第一节 灰葡萄孢菌与灰霉病1第二节 Zn(2)-Cys(6)转录因子研究进展3第三节 本研究的目的和意义4第一章 实验相关材料与方法6第一节实验相关材料61.1供试菌株61.2 供试载体61.3 相关引物6第二节主要药品试剂与仪器62.1主要药品试剂62.2仪器7第三节 培养基的配制73.1 LB培养基73.2 PDB培养基73.3 MM培养基：73.4 IM培养基：8第四节 实验方法84.1配置反应体系84.2PCR反应程序94.3 DNA凝胶回收94.4质粒的酶切94.5质粒连接104.6大肠杆菌DH5感受态转化10第二章 实验结果与分析10第一节灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的鉴定与分析101.1 灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的鉴定与分析10第二节 灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体的构建112.1灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体构建策略112.2灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体引物设计122.3敲除载体同源片段的克隆132.4敲除载体同源片段的克隆至T载体142.5敲除载体上游同源片段的克隆至PXEH载体152.6敲除载体下游同源片段的克隆至Zn(2)-Cys(6)-U-pXEH载体172.7 敲除载体测序18第三章 结论20致谢21参考文献22前言第一节 灰葡萄孢菌与灰霉病灰霉病（Gray mold）是一种重要的世界性植物真菌性病害，是灰霉病的病原菌1，是一种死体营养型真菌，可侵染1400多种植物2，包括几乎所有的蔬菜及果树，每年造成巨大的经济损失3。特别是在一些保护地、大棚果蔬种植区发病较为普遍，如果恰逢低温高湿的环境，一旦发病，对于寄主植物几乎无一幸免，果蔬成熟期数日便可造成绝收4。灰霉病的爆发，不仅仅危害田间生长季节的寄主植物，对储藏与运输过程中的果蔬也能造成危害，因此灰霉病对采摘前后都能造成两方面经济损失5。根据生物性状及侵染致病的差异，灰葡萄孢菌已经被分离鉴定超过30个不同的种6。灰葡萄孢菌 (Botrytis cinerea) 通常又称作灰霉病菌，是引起灰霉病的病原菌)。寄主范围十分广泛，据最新报道，该病原菌可侵染多达1400种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树作物，还有具有大部分花卉植物，其中葡萄灰霉病，番茄灰霉病和草莓灰霉病最为主要。在寄主植物从苗期到结果期均可发病，与此同时，植物的叶、茎、花、果实各部分可可能遭受灰葡萄孢菌感染危害：叶部发病时，具有典型的“V”形病斑；茎部主要表现为萎蔫折断，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。灰霉病发生的严重程度，与环境的湿度、温度有直接联系，灰葡萄孢菌的生长喜欢低温高湿，在环境20 -23，相对湿度90%以上时病害严重。恰好在一些保护地、果蔬大棚等这样小气候环境中适于病原菌生长繁殖，发病比较严重。灰葡萄孢菌由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分子研究技术成熟，灰葡萄孢菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。另外，2012年由植物病理学领域的国际权威学术杂志Molecular Plant Pathology在世界范围内调查统计显示，灰霉病成为仅次于稻瘟病的第二大植物真菌病害。由此可知，灰霉病对是世界农业生产及经济发展都有很大的影响。灰葡萄孢菌是最早被描述的真菌之一。早在十八世纪三十年代，根据希腊词“束状的葡萄浆果”被Micheli命名灰葡萄孢菌。于1866年，De Bary发现B. cinerea的有性后代B. fuckliana。通常一种植物病害的发生与流行，与当地农2业种植和生产密切相关，灰霉病也不例外，众所周知，欧洲部分国家地区，与葡萄生产相关的葡萄酒文化产业链在世界上享誉盛名，这也是葡萄灰霉病在当地的盛行的原因。国外对灰霉病十分重视而且研究较为深入，在灰葡萄孢菌生物学特性、诱导抗病性、致病机理以及综合防治等方面都取得了一些进展。中国对灰霉病相关研究，主要以防治灰霉病的化学杀菌剂的药效研究为主，也有关于其病原菌生物学特性，抗药性等方面的报道。灰葡萄孢菌幼嫩的菌丝体近透明，成熟或老的菌丝为棕褐色，适宜生长温度为15 - 21，温度升高诱导产生菌核，27时菌核产生最多。灰色的分生孢子梗从寄主叶内伸出，病原菌的孢子梗为丛生，褐色，顶端具1 - 2次分枝，上面密生小柄，并着生大量的分生孢子。分生孢子为卵形至椭圆形、光滑、多核的单细胞体，近无色。在微弱的短波长光照（近紫外光）下，有利于产孢形成。孢子萌发适宜温度为18 - 23，最低4，相对湿度为90%以上。在阴雨连绵的气候环境下发病最为严重。当气温高于31时，饱子萌发速度逐渐趋缓，产孢量也逐渐降低，病情不再扩展)。灰葡萄孢菌是一种典型的死体营养型病原真菌，可产生多种致病因子参与致病，主要包括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、smallRNA7及小分子物质等，这些因子相互协作使灰葡萄孢菌能够杀死寄主细胞并分解死亡的寄主组织作为营养。在自然环境中，灰葡萄孢菌主要进行无性繁殖，以分生孢子作为初侵染源开始侵染寄主，孢子飞散到合适的寄主表面，在适宜环境下，孢子开始萌发并形成侵染垫和附着胞两种侵染结构，侵入寄主，并分泌多种致病因子杀死寄主从而掠夺营养供应自身生长繁殖，形成大量菌丝体；将寄主营养消耗殆尽时，便形成菌核度过不利环境，菌核也是灰葡萄孢菌越冬与越夏的主要形式，在环境适宜时菌核萌发长出新的菌丝体及分生孢子梗，并长出大量成簇的分生孢子，分生孢子成熟后从梗上脱落，成熟的分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播8，开始新一轮的侵染。在营养充足、环境条件允许的情况下，灰葡萄孢菌可以：菌丝体-分生孢子-菌丝体，进行多次循环侵染。灰葡萄孢菌有性繁殖频率较少，但也是灰葡萄孢菌进化和遗传变异的基础，灰葡萄孢菌有性生殖需要异宗配合，由菌核萌发并长出子囊盘菌，子囊盘上着生子囊，每个子囊有八个子囊孢子，子囊孢子萌发也可以进行寄主侵染。当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形成的附着胞侵入9；伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将会直接面临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防御反应，另一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因子（如毒素）来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子机制仍所知甚少。第二节 Zn(2)-Cys(6)转录因子研究进展 目前Zn(2)-Cys(6)转录因子在许多真菌中已经展开了研究紫色红曲霉、烟曲霉、胶霉串珠镰孢菌、葫芦科毛盘孢、黄曲霉、酿酒酵母等真菌的次级代谢产物的合成和致病性研究方面取得了一定进展10，并且最近在稻瘟菌上的Zn(2)-Cys(6)转录因子家族基因的研究取得了一些重大的进展11，虽然在灰霉菌中有一些报道不但是Zn(2)-Cys(6)转录因子在灰霉病菌生长发育和致病过程的调控作用研究仍然不够清楚。锌结合蛋白是真核生物中最大的转录调节因子之一，表现出结构和功能多样性。 根据他们的锌指结合基序，锌结合蛋白分为三个主要组：Cys2His2，Cys4和Zn2-Cys612。 有趣的是，Zn2-Cys6蛋白仅在真菌和酵母中发现，目前他们似乎没有出现细菌，植物和动物13。锌指是指含有Zn2+的可与DNA相互作用的蛋白质基序(motif),含有锌指基序的转录因子是一个大家族。目前已发现10多种不同种类的锌指基序, Zn2-Cys6型锌指基序就是其中的一种,其组成是CysX2CysX6CysX5-12CysX2CysX6-8Cys,此基序中的半胱氨酸与2个锌离子结合。含有此基序的转录因子被称为Zn2-Cys6锌簇蛋白,仅存在于真菌中。1982年分离出的第一个Zn2-Cys6锌簇蛋白是Gal4p, Gal4p是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖代谢相关基因的转录调节因子,在半乳糖存在下可以激活半乳糖代谢相关基因的转录14。Zn2-Cys6锌簇蛋白可参与调节真菌的基础代谢、次级代谢、药物抗性及减数分裂等过程,其中对真菌次级代谢中相关的Zn2-Cys6锌簇蛋白的研究将有助于了解真菌的次级代谢的调控过程。对已知的多种真菌的Zn2-Cys6锌簇蛋白的结构分析表明,从蛋白质的氨基端到羧基端分别由DNA结合域、调控域和酸性域组成。其中DBD又可分为锌指结构域、连接区域以及二聚化区域,在二聚化区域常含有螺旋的螺旋结构。Zn2-Cys6锌簇蛋白可以单体、同源二聚体或异源二聚体的方式与DNA相互作用。个别锌簇蛋白的DBD结构域位于羧基端。有时Zn2+可被其它金属离子所替代,如Cd2+可取代Gal4p中的Zn2+。调控域与锌簇蛋白对靶基因的转录激活功能有关,如果缺失该区域,可能造成靶基因的表达被持续激活,即该区域可能是起到抑制转录激活的作用。羧基端的酸性域是转录激活域。Zn2-Cys6锌簇蛋白结合于目标基因的启动子区的DNA序列,所结合的DNA元件的保守序列是单个或重复的三核苷酸序列CGG,结合的特异性与CGG三联体的方向、三联体之间的距离及CGG周围的碱基序列有关,常见的结合序列是CGGN6CCG或CGGN11CCG。如转录因子Leu3p(参与亮氨酸代谢的调节)和Ppr1p(参与嘧啶代谢的调节)所辨认结合的2个CGG的间距分别为4 bp和6 bp,按照CGG三联体的排列方向,这些DNA序列可被分为反向重复、翻转重复和正向重复3种类型15。第三节 本研究的目的和意义灰葡萄孢菌属于典型的死体营养型植物病原真菌，以往对灰葡萄孢菌的致病机理研究，重点关注在病原菌分泌的多种致病因子，如细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、small RNA及小分子物质等，病原菌分泌的多种致病因子相互协作杀死寄主细胞并分解死亡的寄主组织作为营养，而关于转录因子的启动调控研究较少。目前Zn(2)-Cys(6)转录因子在许多真菌中已经展开了研究紫色红曲霉、烟曲霉、胶霉串珠镰孢菌、葫芦科毛盘孢、黄曲霉、酿酒酵母等真菌的次级代谢产物的合成和致病性研究方面取得了一定进展，并且最近在稻瘟菌上的Zn(2)-Cys(6)转录因子家族基因的研究取得了一些重大的进展，虽然在灰霉菌中有一些报道，但是Zn(2)-Cys(6)转录因子在灰霉病菌生长发育和致病过程的调控作用研究仍然不够清楚。对该领域进行深入研究不仅有助于揭示灰葡萄孢菌等死体营养型病原真菌致病的分子机制，而且对于研发防治包括灰葡萄孢菌在内的多数植植物病原真菌从分生孢子萌发到发育出功能完备的侵染结构的调控过程（该过程是一个精细的调控过程）并鉴定该过程中的重要组分。本研究利用PCR，酶切，连接，转化等基础的分子克隆技术，构建灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子敲除载体，并且进行转农杆菌，利用农杆菌介导转化16的策略获得灰霉菌Zn(2)-Cys(6)基因的缺失突变体，对通过TAIL-PCR分析得到的灰霉菌的致病相关基因17Zn(2)-Cys(6)进行验证。并进一步阐析该基因在灰霉菌与寄主互作的调控的机制18-19。重点评价该基因在灰霉病菌调控孢子萌发、孢子产量及致病过程的作用，验证相关基因的致病功能，有可能从中发现可以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理论和技术基础20-21。第一章 实验相关材料与方法第一节 实验相关材料1.1供试菌株（1）灰葡萄孢菌（B. cinerea）: B05.10 菌株，已完成基因组测序及基因注释菌株，由华中农业大学李国庆教授惠赠。（2）大肠杆菌（Escherichia coli）：DH5基因工程菌株，为实验室长期保存菌株。（3）根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：高Vir毒力菌株AGL-1，为实验室长期保存菌株。1.2 供试载体（1） pXEH载体：由实验室构建，该载体为具有HPH基因表达框的双元载体，具有潮霉素Hygromycin B抗性筛选。1.3 相关引物Zn(2)-Cys(6)上游同源臂引物：Zn(2)-Cys(6)-U-F：CTCGAGACATAAGAAACCGAAGGCGT（5 3 ）Zn(2)-Cys(6)-U-R: GAATTCACTTGTACTAGTTGTGTTCG（5 3 ）Zn(2)-Cys(6)上游同源臂引物：Zn(2)-Cys(6)-D-F：GTCGACCGGTCAACGGTAACGAGTAT（5 3 ）Zn(2)-Cys(6)-D-R: CTGCAGAATCAGGGCTCCAACAGAAG（5 3 ）第二节 主要药品试剂与仪器2.1主要药品试剂普通 PCR相关试剂(Buffer，MgCl2，dNTP，rTaq酶等），T4连接酶，RNA降解酶（RNase A），pMD18-T载体，DNA Ladder Marker（DL200，1 kb），限制性内切酶（BamH I，EcoR I，Hind III，Kpn I，Pst I，Sal I，Spe I，Xba I，Xho I）等购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。常用抗生素：链霉素Streptomycin，卡那霉素Kanamycin，氨苄青霉素Ampicillin，头孢霉素Cefotaxime sodium，利福平 Rifampici，潮霉素hygromycin B，购自Roche罗氏生物（上海）技术有限公司。2.2仪器生物安全柜（AIRTECH），超净工作台（AIRTECH），超低温冰箱（SANYO），实验室超纯净水器（ELGA），微量移液器（AXYPET，GILSON，THERMO），PCR扩增仪（BIOER），冰箱（HAIER），凝胶成像系统（JUNYI），高压蒸汽灭菌锅（SHANGHAI SHENAN，SANYO）常温离心机（THERMO），低温高速温离心机（SANYO），电热恒温培养箱（SHANGHAI YIHENG，NINGBO SAIFU），pH计（SHAGHAI YIDIAN），电泳仪（JUNYI），恒温振荡培养箱（CRYSTAL），微波炉（GALANZ，MEDIA），电磁炉（MEDIA），恒温水浴锅（NINGBO JIANGNAN），液氮罐（GRYSTAL），往复式脱色摇床（HAINAN QILINBEIER），旋涡混合器（BEIJING DINGGUO），磁力加热搅拌器（NINGBO JIANGNAN），研磨珠均质器（BEADBEATER），电子天平（EEA）。第三节 培养基的配制3.1 LB培养基 药品 剂量（g/L）胰化蛋白胨 10酵母提取物 5 NaCl 10添加ddH2O至1 L，将pH值调至7.0，113灭菌20 min。3.2 PDB培养基 药品 剂量（g/L）马铃薯块 200葡萄糖 20称取新鲜马铃薯200g，去皮后切成块，加入1 L ddH2O在电磁炉上加热，大约十分钟后马铃薯煮至熟而不烂，用四层纱布进行过滤，丢弃马铃薯块，保留滤液并加入10-20g 葡萄糖，继续添加ddH2O定容1 L，搅拌均匀并进行分装，113灭菌20 min。3.3 MM培养基 药品 剂量（g/L）K2HPO4 2.05KH2PO4 1.45NaCl 0.15MgSO47H2O 0.5CaCl26H2O 0.1 FeSO47H2O 0.0025(NH4)2SO4 0.5葡萄糖 2添加ddH2O至1 L，将pH值调至7.0，113度灭菌40 min。3.4 IM培养基 药品 剂量（g/L）100 mM AS 2 ml葡萄糖 2MES 8.54甘油 5K2HPO4 2.05KH2PO4 1.45NaCl 0.15MgSO47H2O 0.5CaCl26H2O 0.1 FeSO47H2O 0.0025(NH4)2SO4 0.5添加ddH2O至1 L，将pH值调至7.0，113灭菌40 min。第四节 实验方法4.1配置PCR反应体系组分 体系10x Taq Buffer 2l25 mM MgCl2 1.2l2.5 mM dNTP 1l10mM F-Primer 0.4l10mM R-Primer 0.4lDNA 模板 1lDMSO 0.4lTaq 酶 0.2lddH2O补水至20l4.2PCR反应程序反应 温度 时间Stage 1：预变性95-98 2min30sStage 2： 解链95-9830s（35 Cycles）退火56-6030s 延伸72 1-2minStage 3：延伸72 5min 保温164.3 DNA凝胶回收用SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物：1)从琼脂糖凝胶中切下目标DNA片段的胶块，转入1.5mL EP管，称重；2)加入500L Wash Solution,9000g离心30s,倒掉收集管中液体；3)重复步骤2）一次；4)空吸附柱于9000g离心1分钟；5)加入15-20L ddH2O，离心1分钟，进行电泳检测回收效率。4.4质粒的酶切酶切体系配制组分 少量酶切（10l） 大量酶切（100l）10x Buffer 1l 10l内切酶E1 0.2l 3l内切酶E2 0.2l 3l质粒 2l 20lddH2O 6.6l 64l将配制好的酶切体系，放置在37中酶切，如果只是进行质粒酶切检测30min即可进行检测，如果下一步需要进行片段回收则最好酶切4h以上，达到彻底酶切。4.5质粒连接应用高效T4 连接酶试剂盒连接。在冰上配制连接体系（10l）混匀，连接仪中16连接3h以上（或在PCR仪中进行，关闭热盖）组分 体系Solution I 5l（1/2体积）载体片段 1.5l左右（视浓度而定）克隆片段 1.5l左右（视浓度而定）ddH2O补至10l4.6大肠杆菌DH5感受态转化1)将制备好的DH5感受态（50l）从冰箱中取出，在冰上融化，加入连接反应液5l，轻轻弾匀；2)冰上放置30min；水浴锅42热击90s；3)转置冰上冷却2min；4)加入液体LB培养基700l，200rpm 37摇床培养45-50min；5)8000rpm离心30s，弃上清液（大约留200l，吸打混匀）；6)涂布于相应抗性的LB上，在37培养16h，进行克隆筛选。第二章 实验结果与分析第一节 灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的鉴定与分析1.1 灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的鉴定与分析本实验室成功构建了含32000个灰霉菌突变体库，筛选得到致病缺陷型突变体近2000个。本团队通过对T-DNA插入位点的寻找和分析，得到了30多个与致病有关的基因，许多基因目前尚未有文献报道这些基因的在灰霉菌里的致病机理。对致病力下降的转化子提DNA并且进行tail-PCR，测序结果在网站NCBI（/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）中进行预测分析，分析结果其编号为BC1G_04989，预测为Zn(2)-Cys(6)（简称C6）基因（图1）。灰葡萄孢菌Zn(2)-Cys(6)基因由1905个核苷酸组成，编码的蛋白质产物由351个氨基酸组成,属于GAL4超家族，含有与Zn2+结合以及与DNA结合的功能结构区（图2）。（/Blast.cgi#alnHdr_472244157）图1 灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的预测鉴定（/Blast.cgi#alnHdr_472244157）图2 灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子功能结构分析第二节 灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体的构建2.1灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体构建策略本实验双元载体pXEH为基本载体，该载体具有卡那霉素Kan抗性筛选标记，方便用于大肠杆菌的转化操作；并且具有一个潮霉素抗性筛选表达框，可用于灰霉菌遗传转化中表达筛选。并在表达框两端具有多克隆位点MCS，包含了常用的限酶切位点，方便在载体构建中插入外源片段。在构建过程中，我们在表达框两端具有多克隆位点MCS分别搭入一个与灰霉菌Zn(2)-Cys(6)基因上下游同源DNA片段，完成灰霉菌Zn(2)-Cys(6)基因敲除载体的构建（图3）。图3 灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子敲除策略2.2灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体引物设计首先将上游、下游同源臂放入Primer5软件中，设置参数，根据要求选取含有尽量少的发卡结构、错配以及退火温度较高、评分较高的引物。得到下游同源臂引物：Zn(2)-Cys(6)-U-F:ACATAAGAAACCGAAGGCGT，Zn(2)-Cys(6)-U-R: ACTTGTACTAGTTGTGTTCG Zn(2)-Cys(6)下游同源臂引物：Zn(2)-Cys(6)-D-F：CGGTCAACGGTAACGAGTAT Zn(2)-Cys(6)-D-R: AATCAGGGCTCCAACAGAAG 。然后将扩增片段所有序列全部放入Primer5软件中，选择酶切位点一项进行分析，分析得到上下游同源片段里所含的酶切位点，上游的同源片段所含酶切位点如图4，下游的同源片段所含酶切位点如图5。图4 上游同源片段酶切位点分析图图5 下游同源片段酶切位点分析图 最后根据同源片段酶切位点分析图以及结合本实验构建pXEH质粒的上下游单克隆位点，上游含有的单克隆位点为Xba I，Xho I，Bgl II，Spe I，EcoR I，Sac I, Kpn I，下游含有的单克隆位点为BamHI，Xba I，Sal I，Pst I，Hind III，上游同源引物选择常用Xho I、EcoR I，下游同源引物选择常用的Sal I、Pst I，加入到引物5端，最后送公司合成。Zn(2)-Cys(6)上游同源臂引物：Zn(2)-Cys(6)-U-F：CTCGAGACATAAGAAACCGAAGGCGT（5 3 ）Zn(2)-Cys(6)-U-R: GAATTCACTTGTACTAGTTGTGTTCG（5 3 ）Zn(2)-Cys(6)上游同源臂引物：Zn(2)-Cys(6)-D-F：GTCGACCGGTCAACGGTAACGAGTAT（5 3 ）Zn(2)-Cys(6)-D-R: CTGCAGAATCAGGGCTCCAACAGAAG（5 3 ）2.3敲除载体同源片段的克隆首先将公司合成的引物13500rpm/min离心5分钟，加入ddH2O溶解并稀释至10mM，然后以灰霉菌野生型菌株B05.10的基因组DNA为模板，以Zn(2)-Cys(6)-U-F和Zn(2)-Cys(6)-U-R作为引物，扩增灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体的上游同源臂552 bp片段；采用引物Zn(2)-Cys(6)-D-F与Zn(2)-Cys(6)-D-R扩增灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体的下游同源臂997 bp片段；取2l上述DNA扩增产物进行电泳检测，片段大小与预期相符(图6)，然后将扩增片段切胶回收。图6 PCR扩增Zn(2)-Cys(6)上下游同源臂2.4敲除载体同源片段的克隆至T载体将上述回收片段分别与pMD18-T载体连接，并进行转化，挑选单克隆应用Zn(2)-Cys(6)-U-F与Zn(2)-Cys(6)-U-R，Zn(2)-Cys(6)-D-F与Zn(2)-Cys(6)-D-R引物进行菌落PCR验证，验证结果所有挑选的单克隆菌落为阳性，且电泳结果中条带大小与预期时相符的（图7 图8）。上下游各挑选了9个做菌落PCR，其中从左至右第10个为对照，模板加入的是上下游同源片段PCR扩增产物，挑选U-5、U-8,D-2、D-3摇菌，用LB液体培养基加入Amp,37度摇菌12h-14h。图7 Zn(2)-Cys(6)-U-T菌落PCR验证图8 Zn(2)-Cys(6)-D-T菌落PCR验证2.5敲除载体上游同源片段的克隆至PXEH载体待菌摇至略浑浊，按步骤提取质粒，并按菌液、40%甘油1:1汇合，-80度保存备用。将提取的pXEH质粒与Zn(2)-Cys(6)-U-T用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切100l体系，37度酶切4h，pXEH质粒在MCS位置双酶切，载体被线性化，大约8000bp左右；Zn(2)-Cys(6)-U-T酶切成2800bp左右的一条片段和另一条550bp左右的片段（目的片段），取2l产物电泳，正确（图9）。剩余的使用乙醇沉淀的方法回收线性化的pXEH载体和目的片段。电泳检测后将两个片段进行连接转化，为了进一步验证酶切是否完全，加一组对照，即线性化的pXEH载体一同转化，通过Zn(2)-Cys(6)-U-F与Zn(2)-Cys(6)-U-R引物菌落PCR验证，预期有一条接近550bp的条带（图10）。从左至右，1号为对照，模板为提取的Zn(2)-Cys(6)-U-T的质粒，选取阳性克隆Zn(2)-Cys(6)-U -pXEH -3, 8，摇菌，用EcoR I和Xho I进一步酶切验证，酶切结果，挑选的克隆 Zn(2)-Cys(6)-U -pXEH - 8与预期相符（图11），乙醇沉淀回收备用。图9 pXEH 和Zn(2)-Cys(6)-U-T质粒酶切电泳图图10 Zn(2)-Cys(6-U -pXEH 菌落PCR验证 图11 Zn(2)-Cys(6)-U -pXEH质粒酶切验证2.6敲除载体下游同源片段的克隆至Zn(2)-Cys(6)-U-pXEH载体完成Zn(2)-Cys(6)-U -pXEH载体构建后，将提取的Zn(2)-Cys(6)-U -pXEH质粒与Zn(2)-Cys(6)-D-T用限制性内切酶Sal I和Pst I酶切100l体系，37度酶切4h，Zn(2)-Cys(6)-U -pXEH质粒在MCS位置双酶切，载体被线性化，大约8550bp左右；Zn(2)-Cys(6)-D-T酶切成一条2800bp左右的片段和另一条970bp左右的片段（目的片段），取2l产物电泳，正确（图12）。剩余的使用乙醇沉淀的方法回收线性化的Zn(2)-Cys(6)-U -pXEH载体和目的片段。再将下游Zn(2)-Cys(6)-D连入载体，以Zn(2)-Cys(6)-D-F与Zn(2)-Cys(6)-D-R引物进行菌落PCR，结果显示预期有一条接近970bp的条带（图13）（虽然有一点倾斜，是由于琼脂糖凝胶电泳时琼脂糖凝胶倾斜所致，不影响结果）。从左至右，2号为对照，模板为提取的Zn(2)-Cys(6)-D-T的质粒，选取阳性克隆Zn(2)-Cys(6)-D-U -pXEH-3, 4，5摇菌，用Sal I和Pst I进一步酶切验证，电泳，预期出现两个片段，小片段条带为977bp，大片段为8550bp左右，结果显示Zn(2)-Cys(6)-D-U-pXEH-4正确（图14）,将该编号测序。图12 Zn(2)-Cys(6)-U -pXEH 和Zn(2)-Cys(6)-D-T质粒酶切电泳图图13 Zn(2)-Cys(6)-D-U -pXEH 菌落PCR验证图14 Zn(2)-Cys(6)-D-U -pXEH质粒酶切验证2.7 敲除载体测序将上述验证正确的Zn(2)-Cys(6)-D-U-pXEH-4菌液2ml，以及引物：HpTb、HpTa，送公司测序。载体PXEH上自带的一对引物HpTb：ACAGACGTCGCGGTGAGTTCA，距上游同源臂酶切位点400bp左右，HpTa：ATGATGCAGCTTGGGCGCA，距下游同源臂酶切位点200bp左右。将测序结果与上下同源臂放入DNAMAN软件里分析比对，结果显示上下同源臂均连进载体PXEH，灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子敲除载体构建成功（图15 图16）。图15 Zn(2)-Cys(6)-U测序比对图图16 Zn(2)-Cys(6)-D测序比对图第三章 结论通过对T-DNA插入位点的寻找和分析，得到了30多个与致病有关的基因，许多基因目前尚未有文献报道这些基因的在灰霉菌里的致病机理。对致病缺陷型突变体进行Tail-PCR，将PCR的结果测序，测序结果在网站NCBI分析得到其编号为BC1G_04989，预测为Zn(2)-Cys(6)（简称C6）基因，并且了灰霉菌Zn(2)-Cys(6)基因的开放阅读框由1905个核苷酸组成，蛋白质产物由351个氨基酸组成,属于GAL4超家族，含有与Zn2+结合以及与DNA结合的功能结构区。通过设计并合成引物，扩增同源片段，并切胶回收，然后连T载体，转化。对于长起来的单菌落，利用设计引物并进行进一步的PCR验证。对正确的菌落进行摇菌，然后提质粒，再用设计预期的酶进行酶切，跑琼脂糖凝胶电泳回收片段。并用同样的限制酶去酶切载体pXEH并且回收，将酶切好的片段克隆到载体上。重复这样的工作，直到基因的上游和下游同源臂都连接进载体，提质粒再用酶切进行验证，与预期大小一致表示正确，正确后送公司测序，测序结果正确，标志着灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子敲除载体构建成功，为得到Zn(2)-Cys(6)转录因子的缺失突变体，进一步阐释Zn(2)-Cys(6)转录因子基因在灰霉菌生长、细胞发育和致病力的调控作用打下基础。致谢本设计的完成是在我们的导师秦庆明老师的的细心指导下与组长刘建康无私帮助下进行的。在每次设计遇到问题时，是秦老师不辞辛苦的讲解，组长尽心尽力的示范才使得我的设计顺利的进行。从设计的选题到资料的搜集直至最后设计的修改的整个过程中，花费了秦老师很多的宝贵时间和精力，在此向导师及组长表示衷心地感谢导师严谨的治学态度，开拓进取的精神和高度的责任心都将使学生受益终生!相信组长也会将导师的这种精神继续延续下去。还要感谢和我同一设计小组的几位同学，是你们在我平时设计中和我一起探讨问题，并指出我设计上的误区，使我能及时的发现问题把设计顺利的进行下去，没有你们的帮助我不可能这样顺利地结稿，在此表示深深的谢意。同时也要感谢一直支持、帮助我的导员王庆老师，不仅在学习上给予我很大的帮助，也在生活中帮助我许多；当然，我的室友们也是我最想感谢的人，她们花费自己的时间来帮助我却没有任何抱怨，这是让我非常感动的事情。转眼四年过去了，在这条路上我遇到了许多人，有许多人成为了我生命中不可或缺的伙伴，宝剑尚未配好，转眼已是江湖！愿我的朋友们可以在今后的学业、事业道路上，一帆坦途！参考文献1 Dean, R. Van Kan, J.A. Pretorius, Z.A. Hammond-Kosack, K.E. Di Pietro, A. Spanu, P.D. Rudd, J.J. Dickman, M. Kahmann, R. Ellis, J. et al. (2012). The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular plant pathology 13, 414-430.2Elad, Y. Pertot, I.Cotes Prado, A.M. Stewart, A. 2016. Plant hosts of botrytis spp. In: Fillinger, S., Elad, Y. (Eds.), Botrytis the Fungus, the Pathogen and Its Management in Agricultural Systems. Springer International Publishing, Cham, pp. 413486.3刘福平，黄台明，宋淑芳，邓立宝. 番茄灰霉病的生物学特性与防治研究进展 安徽农业科学，Journal of Auhui Agri. Sci.2014,42(31) :10924一109264Siegmund, U. Marschall, R. and Tudzynski, P. (2015). BcNoxD, a putative ER protein, is a new component of the NADPH oxidase complex in Botrytis cinerea. Mol Microbiol 95, 988-1005.5Schumacher, J. (2016). DHN melanin biosynthesis in the plant pathogenic fungus Botrytis cinerea is based on two developmentally regulated key enzyme (PKS)-encoding genes. Mol Microbiol 99, 729-748.6Marschall, R., and Tudzynski, P. 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