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重组dna技术 第二章 重组dna技术又称dna克隆或分子克隆 dnarecombinationtechniqueisalsocalleddnacloningormolecularclone 1944年o t avery的肺炎球菌转化实验 从s型细菌中分别抽提出dna 蛋白质和荚膜物质 并把每一种成分同活的r型细菌混合 悬浮在合成培养液中 结果发现只有dna组分能够把r型细菌转变成s型细菌 重组dna技术的发展史 1865年g j mendel的豌豆杂交试验 o t avery 1944年 证明 遗传信息的携带者是dna j d watson和f h c crick提出了dna分子的双螺旋结构模型 1953年 m meselson和f w stahl证实了dna的半保留复制 1958年 f h c crick提出遗传信息传递的 中心法则 1958年 f jacob和j monod提出了调节基因表达的操纵子模型 1961年 m w nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码 1966年 1972年 p berg等率先完成了dna体外重组 1980年诺贝尔化学奖 1973年 s cohen等进一步实现了重组dna的转化1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司 专门应用重组dna技术制造医学上重要的药物 1980年开始建造第一家应用重组dna技术生产胰岛素的工厂 1982年 美国食品与药物管理局批准首例基因工程产品 人胰岛素1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉 人体生长激素释放激素 ss 抑制和调节多种激素的作用 相关概念dna克隆工具酶目的基因基因载体基本原理重组dna技术与医学的关系 主要内容 第一节 重组dna技术相关概念conceptassociatedtorecombinantdnatechnology 克隆 clone 是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的dna分子 细胞或个体所组成的群体 获取同一拷贝的过程称为克隆化 cloning 即无性繁殖 一 dna克隆 技术水平 分子克隆 molecularclone 即dna克隆 细胞克隆个体克隆 动物或植物 是在体外将不同来源的特异基因或dna片段插入病毒 质粒或其它载体分子 构建重组dna分子 然后将重组dna导入到合适的受体细胞中 使其在细胞中扩增和繁殖 称之为 克隆 筛选出含有目的基因的转化子细胞 再进行扩增 提取获得大量同一dna分子 recombinantdna chimeradna 即dna克隆 因此dna重组技术又称为dna克隆 dnacloning dna克隆 生物技术工程 基因工程 蛋白质工程 酶工程 细胞工程等 基因工程 geneticengineering 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程 又称重组dna工艺学或重组dna技术 recombinationdnatechnique 基因操作 genemanipulation 遗传工程 genedcengineering 二 目的基因 进行dna重组的目的主要有两方面 分离获得某一感兴趣的基因或dna 获得感兴趣基因的表达产物 蛋白质 这些使我们感兴趣的基因或dna序列就是目的基因 targetdna 目的基因有两种类型 cdna complementarydna 在体外经反转录合成的 与mrna互补的dna 基因组dna genomicdna 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有dna序列 三 载体 一 表达载体 expressionvector 为使插入的外源dna序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体 二 克隆载体 cloningvector 为使插入的外源dna序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体 第二节重组dna技术操作的基本过程 基本原理 重组dna技术操作的主要步骤 重组dna技术操作过程可形象归纳为 目的基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 表 总体技术路线 以质粒为载体的dna克隆过程 第二节重要的工具酶 限制性核酸内切酶dna聚合酶 逆转录酶t4dna连接酶碱性磷酸酶末端转移酶taqdna聚合酶 重组dna技术中常用的工具酶 一 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease re 是识别dna的特异序列 并在识别位点或其周围切割双链dna的一类内切酶 bamh 定义 第一个字母取自产生该酶的细菌属名 用大写 第二 第三个字母是该细菌的种名 用小写 第四个字母代表株 用罗马数字表示发现的先后次序 命名 hind haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶 基因工程技术中常用 型 分类 型限制性核酸内切酶的作用特点 回文结构 palindrome 大部分 型限制酶能够识别由4个 8个核苷酸组成的特定序列 型酶识别具有回文结构的核苷酸序列 图2 2 回文 意为顺读和倒读都一样的词语 切口 平端切口 粘端切口 bamh hind 平端切口 粘端切口 来源不同的限制酶 但能识别和切割同一位点 这些酶称同功异源酶 bamh bst 同功异源酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同 但切割dna后 产生相同的粘性末端 称为同尾酶 这两个相同的粘性末端称为配伍未端 compatibleend bamh bgl 同尾酶 限制性内切核酸酶 二 dna连接酶 基因工程的 缝纫针 1 t4噬菌体dna连接酶 两个不同片段双链dna存在互补粘性末端 km 0 6 mol l 或平末端 km 50 mol l dna连接反应都是由t4dna连接酶介导2 大肠杆菌dna连接酶 不能催化平末端dna分子的连接三 dna聚合酶1 大肠杆菌dna聚合酶i及其大片段 klenow片段 大肠杆菌dna聚合酶i具有三种酶活性 klenow片段具有二种酶活性 去除5 3 外切酶活性 2 taqdna聚合酶 耐热 75 80 分子量65kd 也具5 3 外切酶活性 反转录酶 rddp 多功能酶 无3 5 dna外切酶活性 具有3 5 rna外切酶活性 第四节常用载体 定义载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具 具备的条件 具有自主复制能力 有多个单一限制性内切酶的酶切位点 mcs 具有选择性遗传标记 分子量小 拷贝数高 10个 200个 细胞 具有较高的遗传稳定性 常用载体 质粒dna噬菌体dna病毒dna 质粒 plasmid 是细菌内携带的染色体外的小型双链环状dna 能独立进行复制 特点 1 分子量相对较小能在细菌内稳定存在 能在宿主细胞内独立自主复制 有较高的拷贝数 2 具有一个以上的遗传标志 便于在宿主细胞进行选择 3 具有多个限制性酶的单一切口 称为多克隆位点 便于外源基因的插入 常用质粒载体 一 pbr322质粒 由一系列大肠杆菌质粒dna通过重组技术构建成 长度为4 36kb 特点 1 含有复制起始点和复制调节信号 2 有单个ecori酶切位点 可切开插入目的基因 3 有抗四环素基因ter 和抗氨苄青霉素基因amp 便于重组体细胞的筛选 二 puc系列载体 由pbr质粒与m13噬菌体构建而成 长度为2 674kb 特点 具有更小的分子量和更高的拷贝数 蓝白斑 筛选 puc载体中的lacz 基因可编码 半乳糖苷酶 gal n端的 肽链 该 肽与宿主细胞 如e colijm109 中f 因子上的lacz m15基因 肽缺陷型 的产物互补 产生完整的 有活性的 半乳糖苷酶 分解生色底物 x gal 形成蓝色菌落 当外源基因插入mcs后 lacz 肽基因的读码框被破坏 不能合成完整的 半乳糖苷酶分解底物x gal 菌落呈白色 称为 蓝白斑 筛选 ecor sac kpn sma bamh xba sal pst sph hind ori puc19质粒载体图 三 其它质粒载体 1 能在体外转录克隆基因的质粒载体 t7 sp6的启动子 rna聚合酶附着位点 2 穿梭质粒载体 shuttleplasmidvector 具有两种不同复制起点和选择标记 在原核和真核细胞之间往返穿梭 四 t a克隆载体 多克隆位点两侧的3 末端携带有未配对的t碱基 由于许多耐热的dna聚合酶 如taq tth等 扩增时都有在pcr产物3 末端加上a碱基的特性 因此在连接酶的作用下可直接将pcr产物插入到t a载体中 获取 连接外源dna不受酶切位点的限制 二 噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒 一 噬菌体载体1 噬菌体的特点线状双链dna 全长48502bp 由左右两臂组成 两端为12碱基组成的彼此完全互补的5 单链突出黏性末端 称为cos位点 感染细菌后 可进入溶菌生命周期及溶源生命周期 优点 可插入较大外源dna片段 可达23kb 感染效率远高于质粒载体 2 噬菌体载体的构建 优点 可插入较大外源dna片段 可达23kb 噬菌体的感染效率高 噬菌体作为载体用于分子克隆的示意图 dna重组 体外包装 携带外源dna有感染性的病毒颗粒 感染大肠杆菌 二 粘粒载体 结构与特点 1 含有cos黏性末端及与噬菌体包装有关的短序列2 含有抗药性标记 如ampr基因 和自主复制成分3 具有限制性内切酶位点4 粘粒分子小如pjb8为5 4kb 所以可插入大片段的外源dna 可达45kb 5 某些粘粒若接上能在真核细胞生活的元件及选择标记 便可作为穿梭载体在真核细胞中生存及表达 三 m13噬菌体载体 m13是一种丝状单链噬菌体 6407bp 为闭环单链dna m13只能感染具有f伞毛的雄性大肠杆菌 在细菌内复制时形成双链dna 这种复制型 replicationform rf m13相当于质粒 可用作基因克隆载体 三 人工染色体载体 酵母人工染色体载体 yeastartificialchromosomevector yac 是第一个成功构建的人工染色体载体 主要包括以下调控元件 着丝粒 centromere cen 以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞 端粒 telomere tel 作为染色体复制所必需的成分 可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短 复制起始点和限制性酶切位点 选择标记 原核序列及调控元件 复制起始点 ampr基因等 以便于在大肠杆菌中操作 ecor 和bamh 双酶切 ecor 酶切 连接 yac结构图及基因克隆过程 四 病毒载体 质粒载体 噬菌体载体主要以原核细胞作为宿主细胞 为实现真核基因表达或基因治疗的需要 已发展了用动物病毒改造的病毒载体等 有两类 整合型和游离型 一 反转录病毒载体 单正链rna病毒特点 具有广泛的哺乳动物细胞宿主 可主动感染分裂细胞 反转录生成双链dna 可整合到宿主染色体中 持续表达外源基因局限性 只能感染并整合到增殖分裂期的细胞 装载容量比较小 仅达8kb 有诱变危险 二 腺病毒载体 腺病毒是无包膜的线性双链dna病毒优点 可插入大片段外源基因 可达35kb 宿主范围广 尤其人类是其自然宿主 可感染分裂期和非分裂期细胞 不整合 瞬时表达 因而安全性好 不足 病毒基因组较大 构建载体较复杂 几乎可感染所有细胞 缺乏特异性 载体不发生整合 只能短暂表达 第五节目的基因的获取和体外重组 化学合成法 较短的基因 60 80bp 要求 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 基因组dna文库 genomicdnalibrary cdna文库 cdnalibrary 聚合酶链反应 polymerasechainreaction pcr 一 目的基因的获取 1 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的dna序列 较短的基因 60 80bp 用途 pcr引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针 组织或细胞染色体dna 基因片断 克隆载体 重组dna分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组dna文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组dna的集合 2 从基因组dna文库获取目的基因 基因组dna genomicdna 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有dna序列 用随机切割的真核生物染色体dna片段构建基因文库 3 从cdna文库获取目的基因 cdna 指经反转录合成的 与rna mrna或病毒rna 互补的单链dna 以单链cdna为模板 经聚合反应可合成双链cdna pcr技术的基本过程 模板dnadntp引物buffer 预变性 模板dnadntp引物buffer taqdna聚合酶 循环仪 94oc5 94 55 72 4 pcr技术获取目的基因 二 外源基因与载体的连接 体外重组 方式 1 同一限制酶切位点连接 2 不同限制酶切位点连接 粘性末端连接 dna体外重组本质上是一个酶促反应过程 在dna连接酶的催化作用下 将外源dna分子与载体dna分子连接成一个重组分子的过程 连接方式 一 黏性末端连接 二 平末端连接 三 同聚物加尾连接 四 人工接头连接 五 t a克隆 bamh 切割反应 t4dna连接酶15 c 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点的连接 平端连接 限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端 适用于 在末端转移酶 terminaltransferase 的作用下 在dna片段末端加上同聚物序列 制造出粘性末端 再进行粘端连接 同聚物加尾连接 dna连接酶 同聚物尾巴 同聚物加尾法连接重组dna分子 由平端加上新的酶切位点 再用限制酶切除产生粘性末端 而进行粘端连接 人工接头 linker 连接 利用人工合成的接头连接重组dna分子 五 t a克隆 t a克隆策略是一种直接将pcr产物插入到载体中的方法 一 重组dna分子的导入选定的受体细胞应具备的条件 1 易于接纳重组dna分子导入 2 对载体的复制 扩增和表达无严格限制 3 不存在特异性降解外源dna的酶系统 不对外源dna进行修饰 能表达重组体分子所提供的某种表型特征 常用的导入方法 一 转化 transformation 二 转染 transfection 三 感染 infection 第六节重组dna分子的导入和筛选与鉴定 2 转化方法 1 氯化钙法 细菌处于低温 低渗cacl2溶液中 菌细胞壁通透性增加 菌体膨胀成球形 经短暂热休克后重组dna易进入2 电穿孔法 除特殊仪器外比氯化钙法更简单 使用时注意电场强度 电脉冲长度 dna浓度等参数 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 cacl2处理 受体细菌 50 100mmol l cacl2 感受态细菌 重组体转入细菌 转染 将表达载体导入真核细胞的过程 方法 磷酸钙转染deae葡聚糖介导转染电穿孔 操作简单且转染效率高 几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达 但是它需要专门仪器 确定最佳实验条件 脂质体转染 脂质体 liposomes 是一种人造类脂膜 用脂质体包裹dna 瞬时表达和稳定表达 操作简单 转染效率高 重复性好 且毒性低 包装容量大 昂贵 显微注射 转染效率高 但需要一定的仪器和操作技巧 主要用于稳定表达 一 根据重组载体的遗传表型进行筛选1 根据载体的抗药性标记筛选2 根据载体的抗药性标记插入失活选择3 根据 半乳糖苷酶显色反应筛选4 根据插入的外源基因性状进行筛选 二 限制性核酸内切酶酶切鉴定 三 核酸分子杂交法 四 pcr法 五 免疫化学检测法 六 dna序列检测 二 重组体的筛选与鉴定 1 抗药性标记选择 ampr tetr bamh 位点 bamh 酶切 bamh 酶切 dna连接酶 目的dna 重组质粒 大肠杆菌 含amp平板 含amp平板 含tet平板 2 抗药性标记插入失活选择 3 根据 半乳糖苷酶显色反应筛选 标志补救 lacz基因n端序列 插入片段 lacz基因失活 lacz基因n端序列 lacz酶 互补 利用 互补原理筛选重组体puc18 二 限制性核酸内切酶酶切鉴定 凝胶电泳检测 加样孔 dnamarker 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的pcr扩增片段 原位杂交 三 核酸分子杂交法 菌落杂交筛选法 四 pcr法 某些载体的mcs两侧存在保守的序列 如pgem系列载体的mcs两侧是t7及sp6启动子序列 可根据此序列设计引物 对提取的重组质粒进行pcr扩增 不但可快速扩增插入的目的片段 而且可以直接进行dna序列分析 如果已知目的基因的全序列或其两端的序列与全长 可设计合成一对引物 以转化菌的质粒dna为模板进行pcr扩增 若pcr产物与目的基因的预期长度相一致 那么即可初步筛选出含重组体的阳性菌落 鸡的 肌球蛋白的克隆和检出 五 免疫化学检测法 六 dna序列检测 表达体系的建立 表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化 第七节克隆基因的表达 标准 选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点e coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组dna 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 inclusionbody 很难表达大量可溶性蛋白 1 原核表达体系 e coli表达体系最为常用 大鼠胰岛素原cdna的表达和分泌 优点 可表达克隆的cdna及真核基因组dna可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点 操作技术难 费时 经济 2 真核表达体系 酵母 昆虫 乳类动物细胞 表达载体pfastbaci的物理图谱 表达载体yepipt的物理图谱 真核表达载体大多是穿梭载体 通常包括以下元件 1 启动子包括sv40 cmv rsv及ltr等 2 增强子3 剪接信号4 终止信号和polya