（细胞生物学专业论文）ley寡糖抗原对着床相关因子表达和分泌的影响.pdf

学位论文独立创作声明 、6 9 0 3 & 毯 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人 。或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启示和所 做的贡献均已在论文中做出了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：刮蓖签字隰。溯地若 j 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权辽宁师范大学可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书。 学位做储繇嘲净新繇冯。轧 签字日期：o 蝴孑，g 6签字日期：d ；d b ：鑫擅拯厦生羞座塑苤固盘姿垄金然鲍受堕 中文摘要 胚胎着床是一个复杂的发育过程。包括胚泡与子宫内膜上皮细胞的相互识别、定位及 粘附，进而穿透子宫内膜表面，植入内膜基质和胎盘的形成等。有多种因素参与该过程， 共同济调地对着床进行精细的调控。例如，细胞外基质( e x t r a c e | l u l a r m a t r i x ，e c m ) 及其受 体在其水解酶及其相应抑制剂的调节下参与胚胎滋养层细胞和子宫内膜间的相互识别和结 合。一些细胞因子也可通过自分泌或旁分泌方式参与胚胎着床过程。如转化生氏因子 ( t r a n s f e r g r o w t hf a c t o r t g f ) 可诱导着床点内膜细胞的程序化死亡，加强子宫内膜接受性： 血管内皮生民因子( v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ，v e g f ) 可诱导胚胎在着床点的侵入 行为，为其生存创造条件。 胚泡表面寡糖和着床的关系及其任着床过程中的作用已有报道。在着床起始阶段封闭 胚胎和子宫内膜阶段特异表达的l e w i sy ( l e 7 ) 寡糖，可导致着床失败，表明l e 。寡糖在母 胎识别过程中起中介作用。封闭l e 。寡糖对胚泡侵入内膜起关键作用的基质金属蛋臼酶 ( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e ，m m p s ) 及表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，e g f ) 的分泌 及基因表达也有明显抑制作用，说明其在激素调节下可能作为信息分子参与着床调节网络， 影响在着床始发后的一系列后继变化。 本文以小鼠胚胎为样品，应用免疫印迹、r t p c r 法，分析了胚胎表面l e 。寡糖对细胞 外基质主要成分纤维粘连蛋白( f i b r o n e c m a ，f n ) 、层粘连蛋白( l a m i n m ，l n ) 及其水解 酶m m p s 和f g fb1 、v e g f 的分泌、基因表达的影响，研究阶段表达的l e 。寡稽抗原与 这些着床相关因子间的作用，探讨着床机理。 结果表明：胚泡表面的l e 。寡糖被封闭后，1 、细胞外基质主要成分f n 、l n 蛋白分泌 明显增加，但其基因表达无明显变化。同时，经时平行观察m m p s 的变化发现l e 7 寡耱 阻断对m m p s 的分泌和基因表达均有明显的抑制作用，说明二者可能存在内在联系。这可 能是l e 寡糖通过影响m m p s 的活性而改变其底物f n 、l n 的含量。2 、胚泡的t g fbl 、 垃! 墓蕉擅墨盐羞盛担基旦盘姿盘金丝煎受堕 v e g f 蛋白分泌和基因表达明显被抑制，这种抑制作用可能是胚泡表面l e 7 寡糖调节胚泡 发育及着床过程的多种途径之一。本文结果进一步支持l e 。寡糖作为信息分子参与胚泡着 床调节网络的见解，有助于深入研究寡耱在着床中的生物学功能与着床机理。 关键词：胚泡、l e 7 寡糖、着床、免疫印迹、r t p c r 1 21 鍪造盏盈蕴羞盎塑羞鸯i 叁姿垄金鲨煎墅鱼 前言 哺乳动物胚胎着床是一个复杂的发育过程，是生殖的关键环节。它包含胚胎与子宫之 间所发生的同步协调的一系列变化。着床始于游离胚泡与子宫上皮细胞的识别，进行定位、 粘着，随后胚泡的滋养外胚层细胞穿透子富内膜表面，胚泡植入子宫基质。这一过程与母 体的子宫上皮细胞同j 匝胎的滋券外胚层细胞间的相互作用密切相关。尽管对细胞闻的相互 作用的机制并未完全了解，但大量研究袭明胚胎和母体分泌和表达的细胞因子起重要作用， 因而有入提出，激素细胞因子粘附分子细胞表面寡糖细胞外基质基 质金属蛋自酶等可能形成着床调节网络，共同协调地对胚胎生长发育及其在子宫内膜成功 谴入进行精细调控。 近年来。链链结构分析、蛋白质糖基化修饰及糖基转移酶克隆等方法的研究进展迅速。 寡糖在细胞信患、传递中的作用成为糖生物学研究领域的热点问题。生殖过程中，特别是着 康过程中，激素与l e w i s 喜糖表达的关系及各着床相关因子之间可能存在内在联系。研究 表明在哺乳动物胚胎着床的起始阶段，子宫内膜上皮及胚胎表面均有丰寓的岩藻糖基化的 寡糖抗原l e f u c 1 , 2 - g a lb1 , 4 ( f u c l ，3 ) g i c n a cb1 - 3 g a j 表达并参与细胞间的识别，牯 附，对胚胎着床起重要作用。实验证明：以特异性单克隆抗体a h 6 封闭胚泡和子宫内膜表 面的l e 寡糖。可以组断母胎之间的识别和粘附，导致着床失败。封闭l e 7 器糖还可抑制 胚胎和子宫内膜m m p s 及e g f 的分泌和基因表达，说明l e 。不仅在母胎识别过程起中介作 用，且在激素调节f 可能作为信息分子参与着床调节网络，对着床起调节作用。 研究表明e c m 备种分子的定位在胚胎发育形态中呈现规律性，提示e c m 备分子在坯 胎发育中具有重耍作用。f n 、l n 作为e c m 的主要成分，可以通过与整合素相互作用，诱 发一系列细胞内信号转导机制，调节细胞的粘附、迁移、增殖和分化。在小鼠、大鼠胚胎 表面及孕早期子富基膜中有f n 表达，在小鼠着床前子宫内膜有l n 表达。体内外实验证明， f n 和l n 的存在对胚泡l 勺粘附及内细胞团的生长起促进作辩j ，子宫角注射f n 、l n 抗体可 明显降低胚胎着床率。而且，f n 可能通过其受体整合素的信号转导通路，启动小鼠胚泡 3 丝! 豢蕉搐堙壁差塑b 羞垦主盘姿垂盆遂鲍显堕 m m p 2 和m m p 9 的表达，协谪胚泡的侵入能力和子宫内膜的接受能力。说明f n 与l n 均与胚泡着床过程密切相关。对e c m 起降解作用的v i m p $ 与其抑制剂t i m p 间的协调表 达准确而细致的调节m m p s ，使之在一定的空间( 胚泡着床点) 和一定的时间( 着床窗口 赠) 内发挥水解子宫内膜基质的生物学功能，从而为胚泡顺利侵入子宫内膜提供条件。说 明m m p s 作为胚泡滋养层细胞对子宫内膜侵入性的标志，也是胚泡着床重要调节因子之一。 此外，一些细胞因子也可通过自分泌或旁分泌方式参与胚胎着床过程，如t g f 可诱导着床 点内膜细胞的程序化死亡加强子宫内膜接受性，还可能通过调控整合素而参与细胞外基 质的重建。v e g f 可能参与着床前广泛的基质血管通透性增加引发的基质水肿，以及着床 过程中着床位点局部的血管通透性增加和血管发生，诱导胚胎在着床点的侵入行为，为其 生存创造环境。 为分析l e 寡糖与m m p s 、f n 、l n 、t g fbl 及v e g f 的关系，本文以小鼠胚胎为样 品，通过免疫印迹、r t - p c r 技术应用特异性单克隆抗体在体外与着床前胚胎共培养 观察胚胎的e c m 主要成分( f n 、l n ) 、m m p s 及细胞因子( t g fbi 、7 e 6 f ) 分泌水平与 相应基因表达水平的变化，以期验证胚泡表面l e 7 寡糖参与着床调节网络的假发，进一步 研究着床分子机理。 l q ：褰蕉蕴屡盘查鏖垫羞垦：至盘姿垄盆遂鲍整煎 第一章单克隆抗体阻断l e y 寡糖对小鼠胚泡f n 、l n 的 表达分泌的影响及与m m p s 间的关系 胚胎着床是受细胞外基质( e x t r a c c i l u l a rm a t r i x ，e c m ) 、细胞因子、生长因子、蛋白质 水解酶等因素严格调控的过程，多种因子通过白分泌或旁分泌方式参与对这一生殖关键环 节的调节【l i 。研究表明，e c m 各种分子的定位在胚胎发育形态中呈现规律性，提示e c m 各分子在胚胎发育中具有重要作用f ”。在小鼠、天鼠胚泡和子宫内膜基质在体外无血清培 养中均发现胚胎表面及孕早期子富基膜中有f n 表达3 “。在动情期与d l ，d 2 小鼠子宫内 膜的上皮基膜、子宫腺基膜及血管内皮基膜均有l n 表达例，体内外实验证明，f n 和l n 可促进小鼠胚泡的体外粘附和扩展，子宫角注射f n 、l n 抗体可明显抑制胚泡着床f “，而 且f n 义可能通过其整合索受体的信号转导通路，启动小鼠胚泡m m p 一2 ，m m p 一9 的表达， 从而协凋胚泡的侵入能力和子宫内膜的接受能力，从时间以及空间上保证植入相关事件发 生的准确性”。说明f n 与l n 均与胚泡着床过程密切相关。男外在哺乳动物胚泡着床艄 间，母体子宫和胚泡之间分别产生一定数量的多种m m p s 。而且m m p s 与其抑制剂t i m p 间的协凋表达准确而细致的调节m m p ，使之在一定的空间( 胚泡着床点 和一定的时间( 着 床窗口明) 内发挥水解子宫内膜基质的生物学功能，从而为胚泡顺利侵入子二宫内膜提供条 件，提示m m p s 是影响胚胎侵入能力的主要因素，也是胚泡着床重要调节因子z 一【8 9 1 ， 本文通过点杂交印迹法以及r t - p c r 法观察胚泡表面l e 。寡精被封闭后，e c m 主要成分f n 、 l n 的分泌和基因表达的变化，以进一步研究胚胎植入的调节机理。 第一部分单克隆抗体l e 。寡糖对小鼠胚泡细胞外基质 主要成分f n 、l n 的表达和分泌的影响 l 材料和方法 1 1 实验材料 1 1 1 实验动物：6 - 8 周( 2 2 2 4 9 ) 成年雌性昆明小白鼠由_ 人连医科大学实验动物中心提供。 1 1 2 主要试剂 k ! 盔蕉热壁壁羞虚塑羞固士盘堡垒金鲨煎显煎 rtpcr试剂盒takara公司 p m s g ，h c g天津实验动物中心 异硫氟酸胍 g i b c o b r l 公司 a m e m 培养基 a b c 。，b r l 公司 a h 6 抗体( 抗l e 7 ) 美国华盛顿大学h a k o m o n 教授赠送 兔抗鼠f n 摹克隆抗体 北京医科大学细胞学实验室制备 兔抗鼠l n 单克隆抗体北京医辩大学细胞学实验室制各 a p 标记的羊抗兔i g g s a n t ac r u zb i o t e c h 公司 其余为国产试剂 i i 3 主要仪器： c 0 2 培养箱f o r m as c i e n t i f i c 3 1 6 4 2 f n ， 美国 解剖显微镜，普通显微镜 o l y m p u s ，日本 台式离心机l d 4 2 a北京 高速离心机c r 2 1 eh i t a c h i 日本 紫外可见分光光度计u v 7 5 0 0北京天美生物有限公司 电泳仪d y y - 翟 北京六一仪器厂 d n at h e r m a lc y c l e rp e 公莆】美国 3 5n l r f i 培养皿 n u n c 公司 7 2 1 可见光分光光度计上海篇三分析仪器厂 1 2 实验方法 1 2 1 胚泡收集 成年雌性小鼠( 体重2 2 2 4 9 ) 在光周期t 2 h ，暗周期1 2 h 条件下饲养。注射5 1 0 u l p m s f 进行超数排卵，4 8 h 后注射5 1 0u l h c g ，随后与成年雄鼠i ：1 合笼交配，次日晨捡 f 5 月道有阴栓者确定为妊娠第一天，在妊娠第四天上午1 0 1 2 时断头处死雌鼓迅速取出子 富，置于4 c 预冷的无菌磨砂玻璃上，毒除脂肪后、婀3 0 g 号针头以t - a u k s 液从子宫中砷 取并收集胚泡进行体外培养。 6 ；：墨蕉蕉埋壁羞座塑基囤盘姿查金丝盟受煎 1 2 2 体外培养 选取发育良好、形态均匀一致的妊娠第4 天胚泡分成a 、b 两组，每组1 5 0 个胚泡， 移入到3 5 r a m 培养皿内经预温( 3 7 ) 的d - m e m ( m i n i m u me s s e n t i a lm e d i m - na l p h a m e d i u m ) 微滴培养液中，5 c 0 2 的培养箱中培养，准备6 滴3 7 c 预温的m e m 微滴培 养液，每组3 滴各5 叽l ，a ：单纯m e m 培养液；b ：含单克隆抗体a h 6 ( 1 ：1 0 0 ) 的口m e m 培养液。每个液滴放入5 0 个胚胎，3 7 c 培养3 h ，用新的c t - m e m 培养液洗三次以除去抗体， 换入新的o - m e m 培养液，继续培养1 5 ，3 和6 h 分别收集胚胎和培养液，于，7 0 。c 冷冻保存， ( a )( b 1 圈1分组培养的胚胎( a ) 为抗体阻断组( b ) 为e 常培养组 f i g le m b r y o sc u l t u r e di ng r o u p s ( a ) a h 6t r e a t e df b ) c o n t r o l 【2 3 r n a 提取和r t - p c r 分析 1 2 ，3 1p c r 引物由大连t a k a r a 生物工程公司合成，引物序硎见表1 生! 薹蕉益盈壁羞廛担基匿王蠢姿垄盆鲨盟翌煎一 表l车文所用引物 基因序列 产物片段大小 f n ( f ) 5 g t g t t a t o a c g a t g g g a a g a - 3 3 7 8 b p 【a 依) 5 - g t g a a a g g a c c a c t c a a a g a 一3 l n ( f ) 5 c g a g g g a g g c t g a g a a a c t 从_ 3 3 7 】 r r l5 - t t c c t c c t g c t g c t c c t i g a 一3 日。a c t i n ( f ) 5 - a t c t g g c a c c a c a c c 邗m c a a t g a g c 邢c g _ y 8 3 8b 。叼 ( r )5 c g t c a t a c t c c t g c t t g c t g a l c a c a t c t g c 一3 ( f ) ，上游引物，( r ) ，下游引物 a ， b 】由p r i m e r p r e m i e r5 0 引物设计软件设计，l n 引物引自参考文献 1 i j 。 1 2 3 2r n a 提取：将收集的备组5 0 个胚泡分别置于15m l 离心管中按异硫氰酸 胍法提取r n a 1 ”。主要步骤如下： 在装有胚泡的离心管中加入5 0 0 “l 异硫氰酸胍变性液5 0 “l2 m 乙酸钠( p h 4 0 ) ， 5 0 0 “l 水饱和酚，2 0 0 f l 氯仿异戊醇，( 4 9 ：】) ，充分混匀，0 c 静置1 5 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。 将上层水相移到一新离心管中加5 0 0 i 异丙醇，2 0 。c 放置2 h 【2 ，0 0 0 r p m 离心 l o m i n 。 弃上清，沉淀用7 5 乙醇洗涤两次后，空气干燥1 0 m i n 加适量无r n a 酶水溶 解，取5 “i r n a 溶液稀释3 0 倍，检测其o d ，o d ：b 。，计算k n a 浓度及纯度，取其比值 在1 8 2 0 之间者于7 0 冰箱保存。 1 2 3 3r t p c r 分析逆转录反应所用试剂购自t a k a r a 公司。逆转录体系总体积 2 0 “l ，内含l 2ug 总r n a ，4 口l m g c l 2 ( 2 5 r e t o o l l ) ，2f l l 0 逆转录缓冲液，2 “l d n t p ( 1 0 m m o l l ) ，0 , 5f l r n a s e 抑制剂i “i a m v 逆转录酶( 5 “i ) ，i “i 随机引物( o l i g o d t ) ， 以无r n a 酶水补足。上述混合物在5 0 c5 0 r a i n ，9 9 5 m m 5 5 r a i n 。c d n a 任一 2 0v c 保存待用。每管取5 “i 逆转录产物，加入4 lm g c l l ( 2 5r n m o l l ) ，4 “ld n t p f 2 5 m m 。i ，l ) ，5 “11 0 p c r 缓冲液，上r 游引物各l “l ( 2 0p m o l l ) ，t a q 酶0 5 i ，加 8 ! ：墨蕉热屡壁鲎座塑羞匿王叁姿叠金婆煎显煎 水至总体积为5 0 l ，混匀离心后入p c r 反应。p c r 反应条件如1 f ：f n 为9 4 。c 预变性 7r a i n ，然后9 4 。c 变性1m m ，5 8 。c 退火4 5s ，7 2 。c 延伸1r a i n ，进行4 5 个循环，最后 7 2o c 延伸5 r a i n 。l n 为9 4 。c 预变性7 m i n ，然后9 4 。c 变性i r a i n ，6 0 。c 退火i m i n ， 7 2o c 延伸jr a i n ，进行4 5 个循环，最后7 2 。c 延伸1 0 m i n 。r t - p c r 产物在1 o 琼脂糖凝 胶中进行电泳后，照相记录。反应重复进行3 次。 1 2 4f n 及l n 的免疫斑点印迹法分析 取硝酸纤维素( n c ) 膜，经 i n s 盐酸缓冲液( t b s ) 浸泡3 0 m i n ，将膜平放在点杂交 仪内，将a h 6 抗体封闭组培养液( 1 5 、3 和6h ) 及对照组培养液各1 5 l ，并以单纯。一m e m 培养液作为阴性对照，点样于n c 膜上，负压抽干后取出膜：浸入5 b s a t 1 3 s 封阿液中， 室温f 反应6 h ，t b s 稍冲冼后，置于含l ：2 0 0 兔抗鼠f n 抗体液中4 过夜。次日取出膜 经t b s 清洗3 次，每次1 0 m i n ，置f 含h 1 0 0 0 a p 标记的羊抗兔i g g 液中3 7 温育反应 1h ，t b s 清洗3 次，每次1 0r a i n 放入新配制的5 m l a p 反应液( 含底物硝基四氨唑监( n b t ) 3 3 1 ，5 一澳4 一氯3 - 碍 哚磷酸( b c i p ) 1 7 掣1 ) ，于避光处显色5 1 0 m i n ，蒸馏水清洗终止 反应后，用滤纸吸干水分避光保存。同样取a h 6 抗体封闭组培养液以及对照组培养液吾 1 5 川，点膜，室温封闭6 h ，置f 含i ：2 0 0 兔抗鼠l n 抗体液中，4 过夜，其后处理同上。 l2 5 结果分析处理 r t - p c r 分析结果经t a n o n 图像记录分析系统拍照并以q u a n t i s c a n 软件分析处理，以 各自内参照1 3 一a c t m 表达量为基准计算各条带的相对含量；点杂交印迹结果经扫描后用d o t 分析软件处理，以背景( 空白对照) 为基准计算各样品的相对灰度值进行比较。结栗重复 3 次取平均值，并进行f 检验分析。 2 结果 2 1a h 6 抗体封闭对胚泡f n 及l n 分泌影响的免疫斑点印迹分析 图2 一l 结果显示，胚 泡表面l e 。寡糖抗原被a h 6 抗体封闭后，实验组在1 5h 即明显高于对照组f p o0 1 1 ，芹持 续至6h ( 图2 - l a ) ；对l n 的分泌也有明显促进c p 0 o i ) ( 图2 i b ) 。并且，在胚泡体外 培养期间，v n 与l n 的分泌均逐渐增加。本实验重复3 次，结果基本一致。 l ! 差擅盏厘壁羞鏖塑羞固至盘姿垄金鲎盟型鱼 捌6 0 挺 嚣4 0 妻2 0 靛 霎0 对照口a h 6 1 536 培养时间( hj 测3 0 嘏 墨2 0 采 营1 0 靛 器0 对照口a h 6 诅血耵。 536 培养时间( h ) 国2 - 1 免疫斑点日j 迹法检测a h 6 抗体封闭对胚泡表面f n 及l n 分泌的影响( ”= 3 ) a ) f n p o0 1 + p o0 5 ) ；( b ) l n( p o 0 i + p 00 5 ) fi 9 2 1e f f e c t so f l e lb l o c k i n go i ls e c r e t i o no f f n ，l no f e m b r y o s a n a l y z e db yd o tb l o ta f t e r3 ho f b l o c k i n gl e b ys p e c i f i ca n t i b o d y ，t h ee m b r y o sw e r ec u l t u r e db y l 5 h ，3 h ，6 h ，t h es e c r e t i o no f f n l ni ne a c hg r o u pw e ea n a t y z e db yd o tb l o tr e s p e c t i v e l yf n = 3 r e s u l t sw e r cr e p r o d u c t i v e ) ( a ) f n ( ”p 00 1 p 0 0 5 ) ；( b ) l n ( p o 0 5 ) f i 9 2 2 e f f e c to f a h 6 b l o c k i n gi ng e n ee x p r e s s i o no f f n l ho f e m b r y o sb yr t p c ra n a l y s i s n 。3 1 i 2 ，3 a h 6t r e a t e d ( i5 3 ，6h j ：4 ，5 、6 ，c o n t r o l ：i5 ，3 ，6h ) ： md l 2 0 0 0 d n am a r k e r ( a ) f n ( j p 00 5 j ：( b ) l n ( a p o0 5 ) 3 讨论 胚泡着床是妊娠的关键环节，包括胚泡的早期发育，于富内膜接受态的建立，胚泡与 子宫内膜上皮细胞的相互识别、定位及粘附，进而穿透子宫内膜表面，值入子宫内膜基质 中，在胚泡植入过程中存在着启动胚泡植入及调控滋养层有节制性侵入的调节网络。这一 阑节网络可能包括卵巢类固醇激素一细胞生蚝因子( l i f 等) 一细胞外基质( f n 等) 一整 合素一基质金属蛋白酶( m m p s ) 及蛋白酶组织抑制剂( t i m p ) 等。目前，细胞外基质与 胚旭植八相关因子之间的相互关系已经引起国内外研究人员的重视，这将有助于促进对胚 泡植入机理的阐明已有报道指出；早在1 9 8 0 年l e i v o 锋发现小鼠胚胎1 6 卵裂球时期细 胞内及细胞间都有l n 存在，在大鼠中在刚形成两细胞胚胎时即有l n 丧达。而且，住 小鼠胚泡体外培养研究中，也发现早期小鼠胚泡表面含有f n ，同时也见f n 受体整台素a ；8 t ，a ，b ，a ，b ，表达。并且，胚泡植入早期子宫内膜也见f n 高表达，并相对集甲f 母胎界面。f n 及l n 的存在对胚泡的粘附及内细胞团的生跃均起促进作剧弘此外，e 叫可 以通过与其受体整合素结合，通过r a s 一砒p k 信号转导通路“，启动胚泡埘p 一2 和埘p 一9 1 1 ：差蕉蕴厦壁羞型羞盟至盘姿垄金鲨盟丝堕 的基因表达( 1 6 l ，并促进啪驴一2 和删p 一9 的活性升高这是研究胚泡植入调节机制的芙键 环节。 胚泡表面寡糖和着床的关系及其在着床过程中的作用已有报道m ” ”2 0 l 。体外研究表 明，以单克隆抗体a h 6 中和胚泡和子宫内膜表面的l e 7 寡耱可以阻断母胎之问的识掰和粘 附，导致着床失败 t 7 , t 8 1 。而且，l e y 寡糖单克隆抗体对小鼠胚泡埘p s 及e g f 的基因转录表 达及其蛋白分泌有明显的抑制作用p ”。除此之外l e 7 寡糖与着床必需因子l i f 之间有明 确的相互影响，因而提出寡耱作为信息分子参与着廉调节网络的见解。本文结果显示： 用a h 6 单克隆抗体封闭胚泡表面的l e 寡糖1 5 h 后，胚泡f n 及l n 的分泌即明显增高， 并且这种作用可持续到6 h 或更长时间，且随着培养时间的增加州和l n 的分泌也有增加 趋势。而f n 及叫的基因表达未见明显的变化。推测：f n 及l n 的这种变化可能与胚泡表 面l e 寡糖单克隆抗体阻断后胚泡删p s 的基因转录表达及其蛋白分泌有明显的降低9 有 关。e c m 与m m p s 之间可能存在动态平衡，删p s 作为一类依赖于z n ”的蛋白酶家族，负责降 解e c m ，l e 寡糖封闭后造成的删p sf 调可能引起对其作用底物e c s 的降解减少，导致f n ， l n 含量上升，而这可能仅为酶与底物作用的影响，并来反媸到转录水乎，敞未见f n ，“ 的基因表达的明显变化。然而当l e 7 寡糖单克隆抗体作用消退以及f n 。l n 堆积时能否进 一步启动删p s 基因表达，从而引起m n p s 含量的回升，再使f n ，l n 的含量下降，还需进一 步证明。本文结果提示细胞表面l e 7 寡糖不仅在着床初期对母胎间识别、粘跗起中分作_ l = j ， 而且通过影响e c m 参与着床调节网络及着床后续过程， 第二部分 单克隆抗体阻断l e y 寡糖对胚泡表面 细胞外基质与基质金属蛋白酶的影响 以往研究表明封闭胚泡表面l e 7 寡糖对胚泡侵入内膜起关键作用的水解细胞间质的 m m p s 有明显的抑制作用2 “，新近还发现封闭胚泡袭面l e 7 寡糖对e c m 主要成分f n 、l n 的分泌也表现出明显的上调作用 2 4 】。为进一步验证k 。寡糖通过对m m p s 表达的影响政变 - 1 2 ：塞蕉垫盈蕴羞鏖担羞国至盘垫垂盆鲨鲼受煎 基质成分含量变化的设想，本文通过点杂交印迹法以及r t - p c r 法经时平行观察了胚泡表 面l e 。寡糖被封闭后，e c m 主要成分f n 、l n 和m m p s 分泌以及基因表达的时相变化， 分析胚泡表面l e v 对m m p 及e c m 影响以及之间的相关性，以进一步研究着床调节机理。 1 材料和方法 1 1 实验材料 1 1 1 实验动物同第一部分 1 1 2 主要试剂 r t - p c r 试剂盒t a k a n 公司 p m s o ，h c g 天津实验动物中心 异硫氰酸胍g i b c r l 公司 a h 6 抗体( 抗l e 7 )美国华盛顿大学h a k o m o r i 教授赠送 兔抗鼠f n 单克隆抗体北京医科火学细胞学实验室制备 兔抗鼠l n 单克隆抗体京医科大学细胞学实验室制备 兔抗鼠m m p 2 单克隆抗体武汉【尊士德生物技术公司制备 兔抗鼠m m p 9 单克隆抗体 武汉博士德生物技术公司制各 a p 标记的羊抗凭l g g s a n t ac r u zb i o t e c h 公司 其余为国产试剂 1 1 3 主要仪器周第一部分 1 2 实验方法 1 2 1 胚泡收集同第一部分 1 2 2 胚胎体外培养 选取发育良好、形态均匀一致的妊娠第4 天胚泡分成a ，b 两组，每组1 5 0 个胚泡， 移入到3 5 t a r a 培养皿内经预温( 3 7 ( 2 ) 的q m 队微滴培养液中，i 9 6 c 嘎的培养箱中培养， 准备6 滴3 7 c 预温的a 叫蹦微滴培养液，每绢3 滴各5 0 u t ，分别为a ：单纯a m e m 培养 液，b ：含摹克隆抗体a f 6 ( 1 ：l o o ) 的a m b l 培养液。每个液滴放人5 0 个胚胎，3 7 c 培 养3 h ，用新的d m e m 培养渡洗三次以除去抗体，换入新的a - m e m 培养渡，继续培养6 ，9 13 和t 2 h 分别收集胚胎和培养液，于- 7 0 冷冻保存。 1 2 3r n a 提取和r t - p c r 分析 1 2 3 1p c r 引物由大连t a k a r a 生物工程公司合成，引物序列见表1 衰1本文所用引物 基因序列产物片段大小 f n ( f )5 ，g t g 丌a t g a c g a t o g g a a g a 一3 3 7 8 b p l a f r )5 ，- g t g a a a g g a c c a c t c a a a g a 3 l n ( f )5 - c g a g g g a g g c t g a g a a a c t a a 3 3 7 0 b p i 【i f r )5 - t 1 c t c c t g c t g c t c c 下t g a 3 m m p - 2 ( f )5 - a g t g g g a c a a g a a t c a g a t c a c a t 3 5 7 1 b p l 2 s l f r )5 - t c g g t g g t a c a g c t g t t g t a a g a g 3 m m p 一9i n 5 - c c c c a a a g a c c t g a a a a c c t c 3 4 6 7 b p ( r )5 一g g c a g a g a c a t c a c a g a g 丁t g 3 $ 一a c t i n ( f l 5 - a t c t g g c a c c a c a c c t t c t a c a a t g a g c t t g c g 一3 8 3 8b 一1 f r ) 5 - c g t c a t a c t c c t g c t t g c t g a t c c a c a t c t g c 3 ， ( f ) 上游引物，( r ) ，下游引物 ( a 】， b 】由p r i m e rp r e m i e r5 0 引物设计软件笈计。 1 2 32 r n a 提取同第一部分 1 2 3 3 r t p c r 分析操作同第一部分。反应条件见表2 襄2p c r 反应条件 扩增对象 反应程序循环数 p n 9 4 。c7r n m ， 9 4 。clm i n5 8o c4 5s7 2o c1r a i n ，7 2o c 5 m i n4 5 l n 9 4 。c7 m i n 9 4 。cim i n 6 0 。cim m7 2o c1r m n ，7 2 。c1 0 m i n4 5 m p 一2 9 4 。c7 m m 9 4 。c4 5 s 6 2 。c4 5 s7 2 。cts 0 s ，7 2 。c5 m m 4 5 m m p 一9 9 4 。c7 m i n 9 4a c4 5 s 5 2 。c4 5 s7 2 。c9 0 s ，7 2 。c1 0 m m4 5 - 1 4 ! 差蕉蕉盈壁羞劁目苤旦盔姿查金遂盟型煎 1 2 4f i n 、l n 及m m p 2 、m m p 9 的免疫斑点印迹法分析 取硝酸纤维索( n c ) 膜，经t r i s 盐酸缓冲液( t b s ) 漫泡3 0m i n ，将膜平放在点杂交 仪内，将a h 6 抗体纽培养液( 6 、9 和1 2h ) 及对照组培养液备1 5 l ，并以单纯q 州跳培 养液作为阴性对照，点样于n c 膜上，负压抽干后取出膜，浸入5 b s a f f b s 封闭液中， 室温下反应6 h ，t b s 稍冲冼后，置于含1 ：2 0 0 兔抗鼠f n 抗体液中4 过夜。次日取出膜 经t b s 清洗3 次，每次1 0 m i n ，置于含1 ：1 0 0 0 a p 标记的羊抗兔i g g 液中3 7 温育反应1 h t b s 清洗3 次，每次1 0m i n ，再放入新配制的5 m l a p 反应液( 舍底物硝基四氮唑蓝( n b t ) 3 3 “i 。5 一溴4 一氯3 吲哚磷酸( b c i p ) 1 7 川) ，于避光处显色5 1 0 m i n ，蒸馏水清洗终止 反应后，用滤纸吸干水分避光保存。对于l n 、m m p 2 、m m p 一9 操作方法一致。l n 所取 培养液为1 5 1 2 1 m m p 2 与m m p 9 所取培养液为2 5 口l ，分别与1 ：2 0 0 稀释的各自特异性 兔抗鼠抗体反应。 j ，2 ，5 结果分析处理 r t - p c r 分析结果经y a n o n 图像记录分析系统拍照并以q u a n t i s c a n 软件分折处理，以 备自内参照0 一a c t i n 表达量为基准计算各条带的相对含量；点杂交印迹结果经扫描后用d o t 分析软件处理，以背景( 空自对照) 为基准计算各样品的相对灰度值进行比较。结果重复 3 次取平均值，并进行f 检验分析。 2 结果 2 i a h 6 抗体封闭对胚泡f n 、l n 及m m p 2 、m m p 9 分泌影响的免瘦斑点印迹分析 比较胚泡经a h 6 保温与对照组的分析结果显示，胚泡表面l e 7 寡糖抗原破a h 6 抗体封闭 后6 h ，实验组f n 蛋白分泌明显高于对照组( p ( 0 0 1 ) ( 图i a ) ：对l n 的分泌在6 h 也有明 显促进( p o 0 1 ) ( 图1 b ) ，但增加趋势明显弱于f n ，但随培养时间延k = ，f n 、l n 分泌量 逐渐降低，至第1 2 h 时，与对照组相比无明显差别。而胚泡表面寡糖抗原被抗体封闭后6 h ， 实验组m m p - 2 、m m p - 9 蛋白分泌明显低于对照组，但随培养时间的延长抑制作用逐渐减 弱，至9 h 及1 2 h 差异不显著。本实验重复3 次，结果基本一致。 生! 塞鉴垫盈壁羞鏖担羞里量盘垫垄坌鲨盟墅堕 一 1 6 ， 蛩4 0 掣2 0 聋 萋。 蛩6 0 嚣4 0 奏2 0 釜。 趔2 0 擐 皿 篓1 0 蓉 接 罂0 篓2 0 皿 彗l o 聋 茎o 对照口a h 6 丑丑旬l lj u 691 2 培养时间( h ) 对照口a h 6 缸缸 691 2 培养时间( h ) 一对照口a h 6 691 2 培养时阐( h ) 对照口a h 6 慨自。如 691 2 培养时问( h ) 耵 图i 免疫斑点印迹法检测a h 6 抗体封闭对胚泡表面f n 、l n 及m m p 2 、m m p - 9 分泌的影响( n = 3 ) ( a ) f n ( 6 ，9 h “p o 0 1 ：1 2 h + p 00 5 ) ( c ) m m p - 2 ( 6 h p o 0 5 ) i( d ) m m p 一9 ( 6 h p 0 0 5 ) f i g l e f f e c t so f l c 7b l o c k i n go ns e c r e t i o no f f n ，l n ，m m p 2 ，m m p 9o f e m b r y o sa n a l y z e d b y d o tb l o t a f t e r3 ho f b l o c k i n gl c 7b ys p e c i f i ca n t i b o d y ，t h ee m b r y o sw e r ec u l t u r e db y6 h ，9 h ，1 2 h ，t h es c c r e t i o no f f n ，l n m m p 一2 ，m m p 一9i ne a c hg r o u p 、v a n a l y z e db yd o tb l o tr e s p e c t i v e l yf n = 3 ，r e s u l t sw e r er e p r o d u c t i v e ) ( a ) f n ( 6 ，9 h ”j d ( o0 1 ；1 2 h + p 0 0 5 ) ：( b ) l n ( 6 h r 00 5 ；9 ，1 2 h a 尸) o0 5 ) ( c ) m m p - 2 ( 6 h ”p 00 5 ) ；( b ) l n ( p 0 0 5 ) ( q 嘲p 2 ( d h ，9 ”+ 艮0 、0 t p q q 5 ) ：( d l m m g 一9 ( d h ，9 ”p 00 5 f i 9 2e f f e c to f a h 6 b l o c k i n g i ng o n ee x p r e s s i o no f f n l n m m p 一2 、m m p 9o f e m b r y o sb y r t - p c ra n a l y s i s ( n ；3 ) i ，2 , 3 ，a b 6 ”c a t e d ( 15 ，3 ，6h ) ：4 , 5 ，6 ，c o n t r o l ( 1 5 ，3 ，6h ) ：m ，d l 2 0 0 0 d n am a r k e r ( a ) f n ( p 0 0 5 ) ：( b ) l n ( p 0 0 5 ) ( c ) m m p - 2 ( 6 h - 9 h p 0 0 5 ) ：【d ) m m p 一9 ( 6 h t9 h p o 0 5 ) 3 讨论 胚胎着床对妊娠的建立是至关重要的，一般来说，着床分为连续的三个过程：定位 ( a p p o s i t i o n ) 、粘附( a d h e s i o n ) 和侵入( i n v a s i o n ) ，这三个过程的启动标记着母眙对话 的开始。众多细胞间信号传导分子在着床过程中呈现时间和空间的特异性地表达，由此精 细调节子宫腔的微环境，为受精卵的成功植入刨造条件。对这些因素之间的错综复杂的关 系，提出了“调节网络”( r e g u l a t e n e t w o r k ) 这一概念。研究这些相关因子间相互作用的关 - l 8 ! 差蕉热捶盘查廛捆羞旦盘姿查金鲨煎受煎 系，有助于深入了解着床机理。已往研究证明m m p s 家族在小鼠胚胎植入中发挥重要作用， 其中m m p 2 、m m p 9 是该家族中发现较早且作用明确的酶。m m p 2 主要参与早期蜕膜化 和胎盘形成所需要的新血管生成。而m m p 9 主要调节滋养层细胞的侵八2 2 ”。而且m m p s 对基质的水解和重建与生殖过程关系密切。许多研究表明：m m p