（遗传学专业论文）中华绒鳌蟹（eriocheir+sinensis）眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究.pdf

y1 0 1 3 7 1 t , 王雪惠中华绒蝥蟹胀柄神经多肽激索的分离纯化及功能研究硕士学位论文 中文摘要 眼柄x 器官一窦腺f x o s g ) 复合体类似于哺乳动物的下丘脑垂体系统，是甲 壳动物重要的神经内分泌器官。它合成和分泌的多种神经肽类激素，调控甲壳动 物的蜕皮、性腺发育、代谢、色素反应、渗透压调节等重要的生理活动。对眼柄 神经内分泌系统的研究一直是甲壳动物内分泌学的重点研究内容。中华绒螯蟹 ( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) 俗称河蟹，是我国重要的经济甲壳动物之一，由于对河蟹内分 泌系统了解不够深入，还不能有效的解决河蟹养殖中普遍出现的性早熟和养殖规 格下降等难题。我们在河蟹眼柄神经内分泌系统的细胞学、组织学、生理学研究 的基础上，进行了眼柄s g 神经多肽激素的分离、纯化研究，获得了4 种主要的 神经多肽激素纯品，并进行了功能研究，为进一步开展神经多肽激素的分子构造 解析及合成与分泌调控机制研究奠定了基础。主要结果如下： 1 首次建立了河蟹眼柄窦腺神经多肽激素的t 1 2 h p l c 分离纯化体系，大量 分离到河蟹眼柄4 种主要的神经多肽激素。 2 分离到河蟹眼柄高血糖激素( c h h ) 和蜕皮抑制激素( m i h ) ，进行了生理功 能研究。 3 开展了c h h 和m i h 氨基酸序列分析，获得了c h h 成熟肽的部分序列 和m i h 成熟肽的n 术端序列。 关键词：中华绒螯蟹，窦腺，神经多肽，分离纯化，高血糖激素，蜕皮抑制激素 氨基酸序列 王雪惠中华绒螫蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 s d u d i e so np u r i f i c a t i o na n db i o a s s a yo fn e u r o p e p t i d e sf r o m e y e s t a l k so ft h ec r a b ，e r i o c h e i rs i n e n s i s w a n gx u e h u i ( n e u r o e n d o c r i n o i o g yo fc r u s t a c e a n ) d i r e c t e db yp r o f s u nj i n - s h e n g a b s t r a c t t h ex - o r g a n s i n u sg l a n d ( x o s g lc o m p l e xi sa l li m p o r t a n tn e u r o s e c r e t o r yo r g a n i nc r u s t a c e a n ，a n a l o g o u st ov e r t e b r a t eh y p o t h a l a m o n e u r o h y p o p h y s e a ls y s t e mt h e n e u r o p e p t i d e st h a t a r ep r o d u c e da n ds e c r e t e di nt h ec o m p l e xp l a yak e yr o l e i nt h e r e g u l a t i o n o fav a r i e t yo fi m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，s u c ha s m o l t i n g ， r e p r o d u c t i o n ，c a r b o h y d r a t em e t a b o l i s m ，p i g m e n tm i g r a t i o n ，a n do s m o r e g u l a t i o n t h e r e f o r e ，x o s gc o m p l e xh a sr e c e i v e dm o s ta t t e n t i o na l lt h et i m e e r i o c h e i r s i n e n s i si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te c o n o m i c a lv a l u a b l ec r u s t a c e a n si nc h i n a d u e t ot h el i t t l ek n o w l e d g eo nt h er e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fn e u r o s e c r e t i o ni nt h ec r a b ， s o m ee s s e n t i a lp r o b l e m ss u c ha sp r e c o c i t yh a v en o tb e e nc l e a ry e t o nt h eb a s i so f c y t o l o g y ，h i s t o l o g ya n dp h y s i o l o g y ，s i n u sg l a n d so fe r i o c h e i rs i n e n s i s h a v eb e e n e x t r a c t e da n dp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yb yr e v e r s e p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a m ( r p h p l c ) f o u rm a j o rn e n r o p e p t i d e s w e r e p u r i f i e d ，a n d t h e i r b i o l o g i c a la c t i v i t i e sw e r ee x a m i n e d t h er e s u l t sw i l lb eh e l p f u lf o rt h ef u r t h e rr e s e a r c h i nt h es y n t h e s i sa n ds e c r e t i o no ft h en e u r o p e p t i d e s ，a sw e l la sl a yt h ef o u n d a t i o nt o d e t e r m i n et h ea m i n oa c i ds e q u e n c e t h ef o l l o w i n gi st h em a i n w o r kf o l f i l l e d ： 1 t h ep u r i f i c a t i o ns y s t e mo fn e u o p e p t i d e sf r o mt h ee y e s t a l k so fe r i o c h e i r s i n e n s i sw a ss e tu pf o rt h ef i r s tt i m e f o u rm a j o rn e u r o p e p t i d e sh a v eb e e ns e p a r a t e dt o h o m o g e n e i t y 2 c r u s t a c e a nh y p e r g l y c e m i ch o r m o n ea n dm o l t - i n h i b i t i n gh o r m o n eh a v eb e e n f i r s te x t r a c t e df r o ms i n u sg l a n d so fe r i o c h e i rs i n e n s i s 3 t h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so fc h ha n dm i hh a v eb e e na n a l y z e d p a r ta m i n o a c i ds e q u e n c eo fc h ha n dnt e r m i n a la c i ds e q n e n c eo fm i hh a v eb e e na c h i e v e d k e yw o r d s ：e r i o c h e i rs i n e n s i s ，s i n u sg l a n d ，n e u r o p e p t i d e s ，p u r i f i c a t i o n ，c r u s a c e a n h y p e r g l y c e m i ch o r m o n e ( c h h ) ，m o l t i n h i b i t i n gh o r m o n e ( m i h ) ，a m i n o a c i ds e q u e n c e 王雪惠中华绒螯蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 r p h p l c s g x o y o 简字表 1 1 i 性腺抑制激素 外髓 法呢酸甲酯 蜕皮激素 内髓 蜕皮抑制激素 大颚腺 大颚腺抑制激素 端髓 眼柄视神经节端髓x 器官 色素聚集激素 后联结器 色素分散激素 围心腺 红色素聚集激素 反相高效液相色谱 窦腺 x 器官 y 器官 m ! 莹 m m m 胁 呦 嗍 阳 眦 王雪惠中华绒螯蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 第一章文献综述 甲壳动物眼柄视神经节中的x 器官一窦腺( xo r g a n s i n u sg l a n d ，x o s g ) 复合 体，类似于哺乳动物的下丘脑一垂体系统，是甲壳动物重要的神经内分泌器官。 它合成和分泌的多种神经多肽激素，调控甲壳动物的蜕皮、性腺发育、代谢、色 素反应、渗透压调节等重要生理活动4 】。因此，对这一系统的研究一直是甲壳 动物内分泌学的重点内容。组织、细胞学和同位素示踪观察结果表明，x o 由视 神经节内一群相互无连接的单轴突分泌肽神经细胞组成，它们的轴突术梢在血窦 附近膨大形成窦腺| 2 】。在x o 中的神经内分泌细胞的胞体中不断合成的神经多肽 激素经轴突运输到s o 中储存：当受到释放信号的刺激后以胞吐作用方式释放到 血淋巴中，且新合成的激素优先释放，经血淋巴运输到靶器官发挥作用 5 l 。近年 来，研究的热点集中在调控甲壳动物代谢、蜕皮和性腺发育的c h h 族神经肽类 激素( c h h 、m i h 、g i h 、m o i h ) ，对这些激素的氨基酸序列结构和生理作用等 已有了较为深入的了解。随着分子生物学理论、技术以及仪器设备的快速发展， 越来越多的神经多肽激素被分离纯化、基因克隆和在体外表达。这些实验成果使 人们更加深入的了解神经多肽激素的合成、调控以及功能，并对其合成机制，调 控机制和作用机制进行了探索。我国对甲壳动物眼柄神经内分泌系统的研究已从 组织学、细胞学的观察水平逐渐深入到分子生物学、分子内分泌学研究水平【3 1 6 j 。 中华绒螫蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) 俗称河蟹，是我国重要的经济甲壳动物之一， 主要分布在我国：i e 起辽河南至闽江的六大水系。在分类地位上，中华绒螫蟹属于 节肢动物门r t h r o p o d a ) 、甲壳纲( c r u s t a c e a ) 、软甲纲( m a l a c o s t r a c a ) 、十足目 ( d e c a p o d a ) 、爬行亚目( r e p t a n t i a ) 、短尾部( m a c r u r a ) 、方蟹科( g r a p s i d a e ) 、绒螯 蟹属( e r i o c h e i r ) 。中华绒螫蟹不仅具有重要的经济价值，还具有重要的研究价值。 河蟹内分泌系统，特别是眼柄神经内分泌系统x o s g 是河蟹内分泌调控的中心， 它对河蟹的生长、发育、繁殖、代谢等重要的生理活动有着精密的调控作用，对 这一系统的研究具有重要的理论意义和实践意义，将使人们在生产e 调控河蟹的 生长发育和繁殖成为可能。本章简要综述了甲壳动物限柄神经内分泌系统的结构 和功能、神经肽类激素的种类、分泌和调控机制。 1 1甲壳动物内分泌系统研究概述 王雪惠 。# 华绒螫蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 甲壳动物内分泌学的研究始于2 0 世纪初，迄今已积累了大量的研究成果和 资料，涉及的范围很广泛。甲壳动物体内有三对主要的神经内分泌系统，一对是 位于眼柄的x 器官一窦腺复合体，是甲壳动物神经内分泌的主要调控中心，也是 甲壳动物内分泌学的研究重点。另外两对是位于头部的后联结器系统和围心腺系 统。 1 1 1x 器官窦腺复合体的结构和功能 甲壳动物x 器官窦腺复合体( x o ，s g ) 类似于哺乳动物的下丘脑一垂体系统， 是甲壳动物内分泌调控中心，一直以来是甲壳动物内分泌学的研究重点，在大多 数有限柄的种类中，该器官位于眼柄，而在无眼柄的等足类和其他少数有眼柄的 种类中，窦腺位于头部近脑侧。h a n s t r o m 首次发现并描述了甲壳动物眼柄上的 两种内分泌组织，将其中一种命名为x 一器官，另一种因其位于血窦旁，命名为 窦腺( s i n u sg l a n d ，s g ) t 7 1 。因这两种结构间有纤维素相连，又同位于眼柄，所以统 称为x 一器官窦腺复合体( x o s g ) 。b l i s s l 8 】和p a s s a n o 9 , 1 叫独立并同时确定了窦腺本 身并不产生激素，只是一个神经血管器，由神经分泌细胞轴突末梢膨大形成，起 储存和释放激素的功能。x o 由一群或几群单轴突神经内分泌细胞胞体组成，细 胞相互问无联接，多数种类甲壳动物的x o 胞体聚集于视神经节端髓，称为端髓 x 器官( m t x o ) ；这些细胞发出的轴突汇集成束，形成一条轴路，并在血窦附近 膨大，包裹整个血窦形成s g 。除了x 器官以外，可能还有其他的一些部位( 脑、 胸神经节) 的神经分泌细胞体的轴突末端进入窦腺。但至少9 0 以上窦腺的轴突， 其胞体在端髓的x 一器官。 x o s g 复合体是源于神经系统的内分泌器官，窦腺不具分泌功能，由x o 神经分泌细胞分泌的激素经轴突神经束，运送至窦腺暂时储存，后进入血液循环 2 ，8 1 。它合成和分泌的神经肽类激素参与甲壳动物体内许多重要的生理活动，如 蜕皮、生长、性成熟和代谢调控等。另外，s g 中的一些激素还能调节机体由于 环境条件的变化所引起的代谢功能的适应，这些功能主要包括血糖水平的调节、 渗透压和离子浓度的调节，对光线和背景颜色的适应，可能还有对自身生理节律 和潮汐运动规律的维持等。迄今为止，已从多种甲壳动物眼柄x o s g 中分离得 到多种神经肽类激素，有力地推动了甲壳动物内分泌学的发展。现在已纯化并进 王雪惠中华绒螯蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 行了氨基酸序列结构分析和功能鉴定的甲壳动物眼柄神经肽类激素有六种。根据 肽链的长短和分子量的不同分为两类：一类为促色素细胞激素 ( c h r o m a t o p h o r o t r o p i n s ) ，分子量较小，约由8 2 0 个氨基酸残基组成，包括色素聚 集激素( p c h ) 和色素分散激素( p d h ) ；另一类为c h h 族神经肽类激素，肽链由 7 2 8 3 个氨基酸残基组成，氨基酸序列同源性高，且含有6 个保守的半胱氨酸位 点形成的三个链内二硫键，分子量在7 - 9 k d 范围内，包括甲壳动物高血糖激素 ( c h h ) ，蜕皮抑制激素( m i h ) ，性腺抑制激素( g i h ) ，大额器官抑制激素 ( m o i h ) 2 , h i 。 1 1 2 促色素细胞激素( c h r o m a t o p h o r o t r o p h i n s ) 甲壳动物体色的改变以及小眼中色素的运动都是由于载色体中色素颗粒的 分散或集中所致【l “。目前已经确定的促色素细胞激素根据作用可分为两类：引起 载色体色素集中及复眼中小眼光适应的红色素聚集激素；引起载色体色素分散及 复眼中小眼暗适应的色素分散激素。这两种激素不仅存在于眼柄神经内分泌细 胞中，也存在于神经内分泌系统的其它部分f ”】。 红色素聚集激素( r e d p i g m e n tc o n c e n t r a t i n gh o r m o n e ，r p c h ) ：是一个八 肽，目前已从长额虾( p a n d a l u sb o r e ) 、黄道蟹( c a n c e r m a g i s t e r ) 、三叶真蟹( c a r c i m u s m a e n a s ) 、泥污鲸螯虾( o r c o n e c 胞sl i m o s u s ) 中分离出r p c h 并进行了序列测定旧， 发现它们具有相同的氨基酸序列：p e l n f s p g w - n h 2 ，具有焦谷氨酰化的n 未端 和自由c 末端，分子量为1 0 0 0 d a 。 色素分散激素( p i g m e n t d i s p e r s i n gh o r m o n e ，p d h ) ：由18 个氨基酸残基组 成，其氨基酸序列保守性为5 0 左右。目前已从长额虾( p a n d a l u sb o r e ) 、大西洋 沼蟹( u c a p u g i l a t o r ) 、黄道蟹( c a n c e r m a g i s t e r ) 、褐对虾( p e n a e u s a z t e c u s ) 、克氏原 螯虾( p r o c a m b a r u sc 肠，枷) 、日本对虾( p e n a e u sj a p o n i c u s ) 等种类中分离出 p d h 1 6 , 1 7 。p d h 有两种形式：a p d h 即远端视网膜光适应色素激素，首先是从 长额虾中分离出来的；另一种为i b - p d h 。这两种p d h 均为1 8 肽，都具有自由n 术端和酰胺化的c 末端。b p d h 与旺p d h 的主要不同在于肽链中第三个位置上 的氨基酸不同，前者为g l y 后者为g l u ；i - p d h 与d p d h 在生化性质上有差异， 前者酸性更强。b p d h 是大多数虾蟹类眼柄中p d h 的主要存在形式1 8 1 。 王雪惠 中华绒螯蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究 硕士学位论文 1 1 3c h h 族神经肽类激素 c h h 旅神经肽类激素是一类热稳定的肽类物质，它们在结构及理化性质方 面有许多相似之处：如酸性等电点、疏水性、封闭的c 或n 末端，链内二硫键 等。它们在调控甲壳动物的糖代谢、蜕皮、变态发育、性成熟以及对环境的适应 等一系列重要的生理活动中起着关键的作用。 c h h 族神经肤类激素依据成熟肽和前体相关肽的主要结构有i 型和i i 型之 分：编码i 型激素的c d n a 含前体相关肽( c h hp r e c u r s o rr e l a t e dp e p t i d e ，c p r p ) 、 信号 j k ( s i g n a lp e p t i d e ) 和成熟肽( m a t u r e p e p t i d e ) ，成熟肽由7 2 7 3 氨基酸残基组成， 氨基酸序列的n 末端多为焦谷氨酸，c 末端多已酰胺化，c h h 属于该类；编码 i i 型激素的c d n a 只含有信号肽和成熟肽，成熟肽由7 4 - 8 3 氨基酸残基组成，其 n 末端和c 末端多是开放的，在1 2 位点上有额外的甘氨酸，m i h 、g i h 均属 于此类。 甲壳动物高血糖激素( c r u s t a c e a nh y p e r g l y c e m i ch o r m o n e ，c h h ) ：c h h 是 眼柄s g 中含量最丰富的一种神经肽类激素，约占窦腺总蛋白的8 - 1 0 【2 0 】。 a b r a m o w i t z 等通过将眼柄粗提物注射至蟹体内，引起血糖升高，首先发现甲壳 动物眼柄中存在致糖尿病因子。三十年后相继在三种甲壳动物中证实其为s g 分泌的一种神经肽类激素盼2 4 1 。上个世纪七十年代以来，随着高效化学分析方法 的发展，研究人员已经从三叶真蟹( c a r c i n u sm a e n a s ) 2 2 , 2 5 1 、普通黄道蟹( c a n c e r p a g u r u s ) 2 6 1 、泥污鲸螫虾( o r c o n e c t e sl i m a s u s ) t 2 ”、美洲螯龙虾( h o m a r u s a m e r i c a h u s ) t 2 8 , 2 9 】、克氏原螯虾( p r o c a b a r 淞c l a r k i i ) 1 3 0 1 、同本对虾f n ”口口“s a p o m c u s ) 3 1 3 2 1 、墨西哥螫虾( p r o c a m b a r u sb o u v i e r i ) 33 1 、凡纳对虾( p e n a e u s v a n n a m e i ) 3 “、刀额新对虾( 胁印p 口8 淞e n s i s ) 35 1 、赖氏岩螫i 下( j a s u sl a l a n d i i ) 3 6 , 3 7 1 、 罗氏沼虾( 缸c 阳6 r 口c 厅f “r o s e n b e r g i i ) t 38 1 、斑节对虾( p p n 口p 淞m o n o d o n ) 39 1 、泥蟹 ( b y t h o g r a e at h e r m y d r o n ) 等多种甲壳动物中分离得到c h h 并进行了氨基酸组 成分析。对鉴定的这些甲壳动物眼柄中的c h h 序列比较发现，c h h 具有很高的 同源相似性( 6 1 一8 1 ) 。多种甲壳动物中的c h h 都具有多态性，一种个体中有 两种以上的具有高血糖活性的肽，这些具有高血糖活性的肽是一些同型体，具有 相同或相似的氨基酸组成和序列、分子量、等电点，但具有不同的疏水性，在 4 王雪惠中华绒螫蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 h p l c 上出现相近的两个或多个峰【6 】a 在美洲螯龙虾( h o m a r u sa m e r i c a n u s ) 2 8 , 4 1 】 中发现的两种c h h 是不同基因编码的产物，每种c h h 都有两种同型体存在 4 2 , 4 3 。氨基酸序列及构型分析发现，每种c h h 的两种同型体的n 末端八肽的氨 基酸序列完全一致( p g l u v a l p h e a s p g l u a l a c y s - l y s ) ，但每种c h h 的两种同型 体n 末端的八肽中p h e 的构型不同，一个是l p h e ，另一个是d p h e 。之后又陆 续在其他少数几种肽中发现有d 型氨基酸的存在，位于n 未端的第二个位置。 在一个肽中同种的氨基酸只有一个残基被修饰，这可能意味着此处有一种序列或 一种三维结构能够被差向异构酶所识别。目前关于这种异构化的生理学意义尚不 清楚，但在美洲螯龙虾( h o m a r u sa m e r i c a n u s ) 中研究人员发现，两种异构体在高 血糖活性的动力学中表现出不同的生物活性，含有d 型氨基酸残基的c h h 在升 高血糖方面比只有l 型氨基酸的c h h 作用缓慢但持久。注射1 0 9 m 的只有l 型 氨基酸的c h h 后5 分钟就可使血糖浓度开始升高，2 小时达到最高水平，然后 又很快恢复到原水平1 4 4 】。两者的作用时间不同，但达到的最终血糖水平是相同的。 c h h 是一个多功能的内分泌激素，其主要作用是对血淋巴中血糖浓度的调 控 4 5 , 4 6 】。当甲壳动物的生理状态发生变化或处于逆境( 高温、缺氧、拥挤等) 时， c h h 通过升高血淋巴中血糖的浓度来对此变化做出反应。放射免疫和酶联免疫 实验结果表明，三叶真蟹和泥污鲸螯虾血淋巴中c h h 的基础水平为1 3 1 0 。1 m ， 在饥饿、高温等应激条件下很快升至1 0 4 m ，并且伴随着血糖浓度的升高 4 5 1 。 此外，c h h 能抑制y _ 器官分泌蜕皮酮，抑制大额腺分泌法呢酸甲酯，促使 中肠释放淀粉酶，肝胰腺分泌消化酶，也能使暴露在低盐中的甲壳动物渗透压上 升【4 ”。c h a n g 等人发现，c h h 不仅仅存在于眼柄中，也存在于胸神经节、食道 下神经节及前肠和后肠中 4 8 】。 蜕皮抑制激素( m o l t - i n h i b i t i n gh o r m o n e m i h ) ：z e l e n y 早在1 9 0 5 年就已发 现剪去眼柄可以引起早蜕皮【4 9 】，但其原理一直到四十年代爿由b r o w n 和 c u n i r t 曲a m 弄清楚：他们发现甲壳动物窦腺分泌一种蜕皮抑制激素( m i h ) ，能防 止动物蜕皮。而一旦剪除眼柄，去除了m i h ，甲壳动物血液中的蜕皮激素( m h ) 浓度迅速升高，导致动物提前蜕皮【5 们。m i h 能抑制甲壳动物蜕皮是由于它能显 著抑制y - 器官分泌蜕皮激素，从而抑制甲壳动物蜕皮。m i h 在s g 中的含量要 远小于c h h 。 王雪惠中华绒螯蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 w e b s t e r 和k e l l e r 首次从三叶真蟹( c a r c i n u sm a e n a s ) s g 中分离鉴定了m i h ， | _ 司时纯化出的两种c t t t t 也有抑制y - 器官合成蜕皮激素的作用，但m i h 抑制蜕 皮激素合成的作用是c h h 的2 0 倍，而且无c h h 的放射免疫活性，无调控血糖 的作用【5 1 。现在已经确定m i h 氨基酸序列的甲壳动物有美洲螯龙虾( h o m a r u s a m e r i c a n u s ) 5 2 1 、三叶真蟹( c a r c i n u sm a e n a s ) 53 1 、凡纳对虾p e n a e u sv a n n a m e i ) 5 4 1 、 蓝蟹( c a l l i n e c t e ss a p i d u s ) 5 ”、墨西哥原螯虾( p r o c a m b a r u sb o u v i e r i ) 5 6 1 、普通黄道 蟹( c a n c e rp a g u r u s ) 、克n 劐t ( p r o c a m b a r u sc l a r k i i ) 5 8 、同j 耐f ( ( p e n a e u s j a p o n i c u s ) 59 1 、刀额新对虾( 姚印p n 口g 淞e n s i s ) t 6 们、首长黄道蟹( c 矗”c p rm i g i s t e r ) t 6 1 等。 体外活性检测实验证明，m i h 的靶器官是一个非神经性内分泌器官y _ 器官。 m i h 能够抑制体外培养的y 二器官分泌蜕皮甾酮，而且这种抑制作用具有浓度依 赖性【6 2 1 。y - 器官是甲壳动物重要的非神经性上皮内分泌腺，与昆虫的前胸腺为同 源器官。y _ 器官负责调控甲壳动物的蜕皮，其分泌物蜕皮激素为固醇类物质，称 为一蜕皮酮，进入血液后转化为活性物质、实际的蜕皮激素2 0 一羟蜕皮酮( p 一蜕皮 酮，2 0 h e ) 。y - 器官能从血液中吸收由食物中获得的胆固醇合成类固醇激素。 甲壳动物的蜕皮是一个复杂的周期性过程，直接受y - 器官分泌的蜕皮激素 调控。摘除y _ 器官的甲壳动物不能正常蜕皮，甚至不能蜕皮。甲壳动物蜕皮激 素在血液中的浓度变化有一个普遍规律，即蜕皮前期蜕皮激素在血液中的浓度逐 渐升高，在临近蜕皮时形成一个峰值，然后浓度逐渐下降，在实际蜕皮时，处于 低浓度状态1 6 “。l e e 发现m i hm r n a 水平也存在一个周期性的规律，即蜕皮前 期稳定f 降，达到一个最小值，在蜕皮后上升，与血淋巴中蜕皮激素的水平呈负 相关m 】。n a k a t s u j i 证明克氏原螯虾m i hm r n a 水平在蜕皮间期比早蜕皮前期高 五倍【6 5 1 ，与m i h 水平的降低能促使y 二器官分泌蜕皮酮 6 6 6 8 1 的理论一致。 关于m i h 抑制y - 器官分泌活动的机制，一种理论认为，y _ 器官中的分泌细 胞膜上存在m i h 的受体，m i h 通过与受体结合，激活了蟹类位于细胞膜上的腺 苷酸环化酶而提高细胞内c a m p 水平，或是激活了螯虾位于细胞膜上的鸟苷酸环 化酶而升高细胞内的c g m p 水平，从而激活蜕皮激素生成途径上的一种重要的起 负调控作用的激酶，抑制y - 器官蜕皮酮的生成。另一种理论认为，m i h 的作用 是通过5 一羟色胺( 5 一h t ) 发挥作用，通过抑制5 - h t 的合成或封闭其受体，m i h 的 6 王雪惠 中华绒螫蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 作用消失，血淋巴中蜕皮酮的水平会升高。除了作用于y _ 器官，抑制蜕皮激素 的分泌外，m i h 还作用于蜕皮激素本身，m i h 可能通过降低蜕皮激素在靶组织 中的水平或提高蜕皮激素在靶组织中的代谢和排泄间接的调控动物的蜕皮。 性腺抑制激素( g o n a d i n h i b i t i n gh o r m o n e g i h ) ：p a n o u s e 首先证明切除眼 柄能加快甲壳动物性腺发育1 6 9 , 7 0 。很明显，眼柄中除了c h h 、m i h 外，还存在 一种能抑制卵巢发育的激素，即g i h 。这一事实几乎在所有的十足类中得到证实。 g i h 没有性别特异性和种类特异性，靶器官为肝胰腺、卵巢、大颚器及雄性甲壳 动物的雄性腺。在雄体，g i h 通过抑制雄性腺的活动抑制甲壳动物的精巢发育和 交配活动。宽角长额虾是一种雄性先成熟的雌雄同体虾，雄性状念时摘除双侧眼 柄，能够持续雄性腺的发育高峰，从而延长雄性状态时期 1 。而在雌体，g i h 直接作用于卵巢，控制卵巢的发育和成熟。其作用机制可能是通过阻止卵细胞吸 收卵黄蛋白抑制性腺发育，因为切除眼柄后，虾蟹卵母细胞的卵黄合成很快的进 行，而体外培养的凡纳对虾( l i t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 卵巢，在加入眼柄粗提物后， 与卵黄发生有关的蛋白合成减少3 5 。g i h 对肝胰腺合成卵黄蛋白及大颚器合成 m f 也有抑制作用。 s o y e z 等人首先从美洲螯龙虾( h o m a n u sa m e r i c a n u s ) 的s g 中分离纯化得到 g i h 的两种同型体并测定了它们的氨基酸序列，发现这两种同型体都由7 7 个氨 基酸残基组成，分子量为9 1 3 5 d a 7 。a g u i l a r 等人从墨西哥原螯蟹( p r o c a m b a r u s b o u v i e r i ) 的s g 中分离到一种分子量为8 3 8 8 d a 的肽，将凡纳对虾( p e n a e u s v a n n a m e i ) 的卵巢与这种肽进行体外孵育，发现这种肽具有抑制卵巢中卵黄蛋白 原合成的活性，其氨基酸组成和部分序列清晰地表明这个肽是c h h 家族中的一 员【7 3 。 另外，d ek l e i j n 和v a nh e r p 认为，g i h 除了具有抑制性腺发育的作用外， 可能还具有抑制蜕皮的功能【7 4 1 ，因为雌性甲壳动物只有在幼体孵化后才会蜕皮， 在幼体孵化阶段血淋巴中c h h 和m i h 的水平是很低的，所以高水平的g i h 抑 制了雌体繁殖期前期的蜕皮；而c h h 可能在繁殖期后期阻碍蜕皮，来保持繁殖 周期中蜕皮和繁殖的协调。 大颚腺抑制激素( m a n d i b u l a ro r g a n i n h i b i t i n gh o r m o n e ，m o i h ) ：甲壳动 物体内另一重要的内分泌腺体一大颚器官( m a n d i b u l a ro r g a n ，m o ) ，位于大颚与附 王雪惠中华绒整蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 着大颚外展肌的几丁质腱的连接部位基部。l a u f e r 发现，眼柄s g 分泌的c h h 族的某种神经肽类激素对克氏原螯虾( p r a c a m b a r u sc l a r k i i ) 大颚器官( m o ) 合成保 幼激素类似物的活性有负调控作用，并认为眼柄x o s g 复合体能合成并分泌一 种抑制m o 分泌法呢酸甲酯( m f ) 的神经肽类激素m o i h ，这种肽属于c h h 族神 经肽类激素。继尔在蜘蛛蟹( l i b i n i ae m a r g i n a t a ) h 艮柄s g 中分离到一种由7 2 个 氨基酸残基组成的神经肽，具有抑制m f 的合成和调控血糖代谢双重功能，其氨 基酸序列接近c h h 【7 6 1 。w a i n w r i g h t 等人从黄道蟹( c a n c e rp a g u r u s ) 的s g 中分离 鉴定了两种m o i h ，证实了l i u 和l a u f e r 提出的甲壳动物s g 中存在一种属于 c h h 族的抑制m o 合成m f 的神经肽。但氨基酸序列比较分析表明，w a i n w r i g h t 鉴定的m o i h 更接近m i h 7 川。迄今为止，采用气相色谱质谱分析方法，己在二 十多种甲壳动物的血淋巴和体外培养的m o 中检测到m f 。 m o i h 的靶器官是大颚器官，抑制大颚器官分泌法呢酸甲酯，体外培养实验 结果也证实了m f 的合成场所是大颚腺。体外培养实验结果进一步表明，甲壳动 物m o 受眼柄因子的控制。m f 对甲壳动物性腺发育的促进作用同样受到眼柄因 子的调控。正常情况下，甲壳动物血淋巴中的m f 含量很低，几乎检测不到。单 侧眼柄切除后，蜘蛛蟹( l i b i n i ae m a r g i n a t a ) m f 的水平便有所提高，当双侧眼柄切 除后的第一天，几乎所有被测试的个体都检测到m f 。如果用眼柄粗提物注射进 双侧眼柄切除的甲壳动物，血淋巴中的m f 在2 3 小时内就跌到检测不到的水平。 同样将眼柄粗提物加入m o 的体外培养液中，其m f 的分泌量也明显降低。在蜘 蛛蟹( 口e r 泐n ) 的幼体和成体【7 8 】、泥污鲸螯虾( o r c o n e c t e sv i p i l i s ) 79 1 、招潮蟹( u c a p u g i l a t s r ) 8 0 、三叶真蟹( c a r c i n u sm a e n a s ) 等多种甲壳类动物中都已证明眼柄因子 对m o 的抑制作用。另外，切除眼柄也可引起甲壳动物幼体和成体m o 的增生 和超微结构的变化，从组织学上进一步证明眼柄因子对m o 分泌活动的抑制作 用。 m f 的合成受控于眼柄x o s g 分泌的大颚器官抑制激素( m o i h ) ，m o i h 对 大颚器官具有快速短暂和缓慢长期两种作用方式。快速短暂的作用方式是快速抑 制法呢酸甲基转移酶( f o m t ) 的活性：缓慢长期的作用方式可能是抑制了f o m t 的合成和抑制m o 的增生。剪除克氏原螯虾的眼柄8 1 2 天内能使f o m t 的活性 升高2 0 1 0 0 倍，f o m t 的活性升高的同时m o 蛋白含量也增加3 倍左右：而将 王雪惠中华绒螫蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 s g 粗提物注射入克氏原螫虾中6 小时后，f o m t 的活性就会被抑制。 p e r u c m g 被认为是c h h 神经多肽家族的新成员。a p i n u n t 等人克隆了斑节 对虾妒e n a e u sm o n o d o n ) 的一条p e m c m g 的e d n a 并且对其进行了测序。结果显 示该序列含有一个3 8 4 b p 的o r f ，其编码一个由1 2 8 个氨基酸残基组成的激素 6 u 体，成熟肽由7 4 个氨基酸组成。与其他甲壳动物c h h 家族神经多肽激素的序 列高度司源。序列分析显示，在成熟肽编码区内只有个内含子，这表明 p e m c m g 不是任何一个已知的c h h 家族激素【8 2 。目前没有关于其功能的报道。 1 1 4 后联结器( p c o ) f , u 围心腺( p o ) 甲壳动物头部有两对神经血管器，一对是后联结器( p o s t c o m m i s s u r a lo r g a n ， p c o ) 另一对是围心腺( p e r i c a r d i a lo r g a n ，p o ) 。p c o 的胞体位于食道后的连接处。 p c o 的功能是释放神经激素，调控甲壳动物体色的变化。一个后联结器所具有 的红色素聚集激素的量相当于一个窦腺所含的该激素量。p o 也是神经血管器， 是胸神经节发出的纤维进入围心腔形成的网状组织，其功能是促使心脏兴奋。迄 今为止，在甲壳动物p o 中分离的神经肽类激素主要包括p r o c t o l i n 、 f l l 3 ( h o m a t u s ) 、f l l 4 ( h o m a t u s ) 、d f 2 ( p r o c a m b a r u s ) 、n f l ( p r o c a m b a r u s ) 、 f a r p ( c a l l i n e c t e ss ) 、c c a p 。通过免疫组织化学方法，在神经系统其他部位也发 现以上这些激素的存在口1 。 1 - 2 甲壳动物眼柄神经肽类激素的分泌调控研究进展 1 2 1 甲壳动物眼柄神经肽类激素的合成运输及储存 甲壳动物神经肽类激素的合成途径与哺乳动物神经肽类激素的经典合成途 径相近 5 j 。甲壳动物眼柄神经肽类激素合成的中心部位是神经分泌细胞的核周， 核信息首先被送往内质网进行多肽链的合成，合成的多肽等生物大分子通过高尔 基复合体的加工：、浓缩、分拣和包装，然后以囊泡的形式运送到不同的目的地。 细胞学证据和轴突的结扎实验证明，神经分泌颗粒在胞体产生后，分泌囊泡沿着 轴突被运输到轴突末梢储存，当特殊的刺激( 如激素或电脉冲等) 作用于细胞后， 分泌颗粒释放到细胞外【8 3 1 。关于神经颗粒在轴突内的运输机制，目前广泛接受微 管是轴突内负责神经颗粒运输的结构单位的说法。虽然尚未发现神经分泌颗粒与 微管之问形态上的连接，但是用秋水仙碱处理之后，观察到神经分泌颗粒在微管 9 王雪惠中华绒螫蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及功能研究硕士学位论文 外周的排列，因为秋水仙碱和微管亚基的不可逆的结合破坏了微管的功能。激素 以不问的方式保留在分泌小泡内，贮存的时间长短不同，直到受激而释放。 1 2 2 甲壳动物眼柄神经肽类激素的释放及分泌调控 人量的组织学和细胞学研究结果表明，储存在轴突术梢的眼柄神经肽类激素 颗粒与神经递质样，主要以胞吐作用方式释放到胞外，并遵循量子释放假说。 迄今为止，己对多种甲壳动物s g 进行了超微结构研究，均发现神经分泌颗粒以 胞吐作用方式释放的现象，而且在电刺激或高浓度钾离子的去极化刺激下能使胞 吐分泌现象增加。最新研究结果表明，新合成的神经肽类激素优先释放【5 】。 通过在蜕皮周期的特定时期精密的分析靶组织中c h h m i h 的生物活性、受 体、受体结合蛋白及第二信使( c g m p ) 的水平发现：在整个蜕皮周期中c h h 和 m i h 都在稳定的合成与表达f 8 4 】。其原因在于眼柄内多肽激素基因的表达受脑分 泌的多巴胺的调控。以克氏原螯虾为例，在注射多巴胺以后3 0 m i n 以内c h h 和 血糖浓度都会明显上升，在1 h 左右时达到峰值，在4 h 左右时恢复到正常水平。 注射多巴胺对剪除眼柄的动物无效。以l 二事实充分说明多巴胺能凋节眼柄 x o s g 中c h h 表达博“。由此可以认定，在整个蜕皮周期中眼柄内的x o s g 中 并不存在与蜕皮直接相关的表达调控机制。 在其他一些组织中，例如食道管、心脏、鳃、胸神经节、腹神经索等组织的 神经内分泌细胞中存在着精确、明显、即时地表达调控机制。以普通滨蟹为例， c h u n g 等人通过放射免疫分析( r a d i o i m m u n o a s s a y ，r 1 a ) ，血液化学( b l o o d c h e m i s l r y ) 及免疫组织化学( i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ) n q 定在晚蜕皮前期( 1 a t ep r e m o l t ) 至整个蜕皮期，血液中的c h h 水平从1 5f m o l 1 0 0m l 快速上升到大约2 5f m o l 1 0 0 m 1 ，而在蜕皮期( e c d y s i s ) 血液中的c h h 水平会达到其峰值1 5 0 - 2 0 0f m o l l o o m l ， 这几乎是蜕皮问期( i n t e r m o l t ) 的1 0 0 倍。如此多的c h h 并不是由x o s g 分泌的，而 是由其他内分泌细胞分泌的。此时前肠( f o r e g