原核生物基因表达调控PPT课件.ppt

一 原核生物基因表达调控概述 随着生物个体的发育 DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息 通过密码子 反密码子系统转变成蛋白质 执行各种生理生化功能 科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达 geneexpression 对这个过程的调节就称为基因表达调控 generegulation或genecontrol 1 1 基因表达调控的生物学意义 适应环境 维持生长和增殖维持个体发育与分化 2 2 原核基因表达调控的特点 1 原核生物基因表达调控包括在DNA水平 转录水平 转录后水平和翻译水平 但转录水平的调节是最有效 最经济的方式 也是最主要的调节方式 2 原核生物基因的表达调控多以操纵子为单位进行 即 将功能相关的基因组织在一起 同时开启或关闭基因表达 3 基因调控的模式可分成两大类 正调控和负调控 原核生物以负调控为主 3 3 原核基因表达调控的几个概念 1 顺式作用元件和反式作用因子 基因表达的产物 蛋白质或RNA 从合成的场所扩散到目标场所而发挥作用的过程称为反式作用 trans acting 此基因表达产物被称为反式作用因子 trans actingfactor 反式作用因子通常为的蛋白质或RNA 顺式作用 cis acting 任一不转变为任何其他形式的DNA序列在原位发挥作用 影响与其相连的其它DNA序列的活性 4 顺式作用元件 cis actingfactor 指对基因表达有调节活性的DNA序列 其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因 顺式作用元件通常不编码蛋白质 多位于基因旁侧或内含子中 如 位于转录单位开始和结束位置上的启动子和终止子 都是典型的顺式作用元件 基因活性的调控主要通过反式作用因子和顺式作用元件相互作用而实现 5 2 结构基因和调节基因 组成基因 管家基因 constitutivegene housekeepinggene 是指不大受环境变动而持续表达的一类基因 如 聚合酶 聚合酶等代谢过程中十分必需的酶或蛋白质的基因 调节基因 regulatedgene 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因 如 不同生长发育时期表达的一些基因 6 3 正调控和负调控 正调控 positivecontrol 在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的 加入某种调节蛋白后基因活性就被开启 这样的调控为正转录调控 7 负调控 negativecontrol 在没有调节蛋白质存在时基因是表达的 加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭 这样的调控负转录调控 8 4 激活蛋白和阻遏蛋白 激活蛋白 activator 在正调控系统中 调节蛋白称诱导蛋白或激活蛋白 和操纵基因结合后引起基因表达开放 阻遏蛋白 repressor 是负调控系统中由调节基因编码的调节蛋白 和操纵基因结合后引起基因表达关闭 9 倒位片段 阻遏蛋白 二 DNA水平调控 1 细菌DNA重排对基因表达的影响 鼠伤寒沙门菌鞭毛素基因的调节 10 鼠伤寒沙门氏菌 S typhimrium 的相转变 phasevariation 11 2 因子对原核生物转录起始的调控 因子 原核生物RNA聚合酶的一个亚基 是转录起始所必需的因子 主要影响RNA聚合酶对转录起始位点的正确识别 这种 因子称 70 此外还有分子量不同 功能不同的其他 因子 在转录起始阶段 因子识别特异启动序列 不同的 因子决定特异编码基因的转录激活 也决定不同RNA mRNA rRNA和tRNA 基因的转录 亚基在转录延长时脱落 12 在E coli 不同类型的启动子需要不同类型的 因子 32调控热休克基因 heatshockgenes 54 60调控氮代谢基因 F调控鞭毛基因 43调控噬菌体基因枯草杆菌 B subtilis 13 1 操纵子学说 theoryofoperon 1961年 法国巴斯德研究院的FrancoisJacob 雅各布 与JacquesMonod 莫洛 提出获1965年诺贝尔生理学和医学奖 三 操纵子对基因表达的调控 14 2 操纵子 是原核生物在分子水平上基因表达调控的单位 由启动子 操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成 操纵基因受调节基因产物的控制 操纵子可视为原核生物的转录单位 它可以逐个地从原核生物基因组中分离出来 对其结构功能加以研究 15 3 乳糖操纵子 1 乳糖操纵子的结构 调节蛋白 阻遏蛋白 启动子 操纵基因 结构基因 16 Z编码 半乳糖苷酶 将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖 还能将乳糖转变为异构乳糖Y编码 半乳糖苷透过酶 使外界的 半乳糖苷 如乳糖 能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内 A编码 半乳糖苷乙酰基转移酶 乙酰辅酶A上的乙酰基转到 半乳糖苷上 形成乙酰半乳糖 3个编码的结构基因 17 乳糖操纵子的控制模型 其主要内容如下 Z Y A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码 这个mRNA分子的启动子紧接着操纵基因 O区 而位于I与O之间的启动子区 P 不能单独启动下游mRNA分子的转录 操纵基因 区 是DNA上的一小段序列 仅为26bp 是阻遏物的结合位点 18 当阻遏物与操纵基因结合时 lacmRNA的转录起始受到抑制 诱导物通过与阻遏物结合 改变它的三维构象 使之不能与操纵基因结合 从而激发lacmRNA的合成 当有诱导物存在时 操纵基因区没有被阻遏物占据 所以启动子能够顺利起始mRNA的合成 19 2 lac体系受调控的证据在不含乳糖的培养基中 每个大肠杆菌细胞内大约只有1 2个利用乳糖的酶分子 如果在培养基中加入乳糖 利用乳糖的酶浓度很快达到细胞总蛋白量的6 或7 每个细胞中可有超过105个酶分子 由底物诱导合成利用该底物的酶 这种现象称为酶的诱导 20 把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸 但没有半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S 无放射性的培养基中随着培养基中诱导物的加入 半乳糖苷酶便开始合成 分离 半乳糖苷酶 发现这种酶无35S标记说明酶的合成不是由前体转化而来的 而是加入诱导物后新合成的 同位素示踪实验 Jacob和Monod认为诱导酶 他们当时称为适应酶 现象是个基因调控问题 可以用实验方法进行研究 因此选为突破口 终于通过大量实验及分析 于1961年建立了该操纵子的控制模型 21 酶的诱导 22 酶的诱导现象是生物进化过程中出现的一种合理 经济地利用有限资源的本能 酶诱导已证明是低等生物的普遍现象 23 3 乳糖操纵子可诱导的负调节机制 无乳糖 lac操纵子处于阻遏状态 repression 有乳糖 lac操纵子即可被诱导诱导剂 inducer 别乳糖 半乳糖 IPTG 异丙基硫代半乳糖苷 24 当阻遏物与操纵基因结合时 lacmRNA的转录起始受到抑制 25 26 27 经诱导后 RNA聚合酶首先与启动区 P 结合 通过操纵区 O 向右转录 转录从O区的中间开始 按Z Y A方向进行 每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因 28 别乳糖是lac操纵子转录的活性诱导物异丙基硫代半乳糖苷 isopropylthiogalactoside IPTG 结构上类似于别乳糖 是乳糖操纵子非常有效的诱导物 可诱导lac操纵子表达 但不能被 半乳糖苷酶水解 这种能诱导酶合成 但不能被酶分解的分子称为安慰诱导物 gratuitousinducer 安慰诱导物由于能在细胞内保持原型不变 因此很有用处 IPTG常用于诱导含有使用了lac启动子的质粒载体的细菌中的重组蛋白的表达 29 30 4 乳糖操纵子的正调控当大肠杆菌以乳糖为唯一碳原时 lac操纵子可被乳糖诱导而表达 可是在培养基中同时加入葡萄糖时 细菌优先利用葡萄糖 只有葡萄糖耗尽时 乳糖才能诱导基因的表达 这种现象称为分解物阻遏 代谢物阻遏 cataboliterepression 葡萄糖效应 是指当葡萄糖和其它糖类一起作为细菌的碳源时葡萄糖总是优先被利用 葡萄糖的存在阻止了其它糖类的利用的现象 31 细菌在富含葡萄糖的培养基上生长的时 葡萄糖可降低细菌体内cAMP的水平 在细菌中 cAMP与CAP cataboliteactivatorprotein 结合形成二元复合物共同发挥作用 只有cAMP存在时 CAP才有活性 CAP是cAMP受体蛋白 cAMPreceptorprotein CRP 其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点 是一个正调控因子 生化和遗传学实验证明 CAP可以结合到启动子的某个部位而激活操纵子的转录 在依赖CAP的启动子上起始转录必须有CAP参与 cAMP下降 CAP无活性不能与控制区结合 RNA聚合酶就不能启动转录 原因 32 在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列 能与CAP特异结合 称为CAP结合位点 CAPbindingsite CAP与这段序列结合时 可增强RNA聚合酶的转录活性 使转录提高50倍 相反 当有葡萄糖可供分解利用时 cAMP浓度降低 CRP不能被活化 lac操纵元的结构基因表达下降 33 34 TheLacOperon I 葡萄糖存在 乳糖不存在 RNAPol RepressormRNA 葡萄糖存在 乳糖不存在 阻遏蛋白与操纵基因结合 基因不转录 X 35 TheLacOperon II 乳糖存在 葡萄糖不存在 Lac RNAPol 葡萄糖不存在 乳糖存在 阻遏蛋白失活 cAMP CAP与CAP位点结合结合 促进基因转录 36 TheLacOperon III 葡萄糖和乳糖都存在 RepressormRNA Lac RNAPol X 葡萄糖存在 乳糖存在 阻遏蛋白失活 cAMP缺乏 不与CAP结合 基因不转录 37 TheLacOperon IV 乳糖不存在 葡萄糖也不存在 RNAPol 葡萄糖不存在 乳糖不存在 阻遏蛋白与操纵基因结合 cAMP CAP与CAP位点结合 基因不转录 38 Plac是弱启动子 仅由乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开放 还不能使细菌很好利用乳糖 必需同时有CAP来加强转录活性 细菌才能合成足够的酶来利用乳糖 细胞内cAMP与CRP CAP 环腺苷酸受体蛋白 代谢物激活蛋白 由 rp基因编码 形成的复合物是启动lac转录的必要条件 cAMP参与的正调节作用机制 39 葡萄糖的存在降低了细胞内cAMP的含量 所以葡萄糖存在时 不能形成复合物 从而抑制乳糖代谢操纵子的表达 lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用 通过这机制 细菌是优先利用环境中的葡萄糖 只有无葡萄糖而又有乳糖时 细菌才去充分利用乳糖 结论 lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖 40 协调调节 coordinateregulation 负调节与正调节协调合作阻遏蛋白封闭转录时 CAP不发挥作用如没有CAP加强转录 即使阻遏蛋白从操作基因上解聚仍无转录活性降解物敏感型操纵子都有类似调节机制 如 乳糖操纵子 阿拉伯糖及麦芽糖等的操纵子 41 araB araA和araD基因参与阿拉伯糖的降解 它们是一个基因簇 简写为araBAD araB编码核酮糖激酶 araA编码L 阿拉伯糖异构酶 araD编码L 核酮糖 5 磷酸 4 差向异构酶 4 阿拉伯糖操纵子 三个基因的表达受到ara操纵子中1个基因araC转录产物AraC的调控 1 阿拉伯糖操纵子结构 42 araBAD具有复合启动子区域 两个操纵区 O1 O2 和一个调节基因araC AraC蛋白同时显示正 负调节因子的功能 在lac和gal操纵子中 阻遏蛋白只能作为负调节因子 araBAD和araC基因的转录是分别在一条链上以相反的方向进行的 araBAD基因簇从启动子PBAD开始向右进行转录 而araC基因则是从Pc向左转录 43 Pr Pi 44 2 阿拉伯糖操纵子特点 ara操纵子的调控有三个特点 第一 araC表达受到AraC的自动调控 第二 AraC既可充当阻遏物 也可作为激活剂 第三 cAMP与CAP结合可作为正调节物诱导ara操纵子表达 3 阿拉伯糖操纵子调控 45 有葡萄糖 缺阿拉伯糖 有阿拉伯糖 没有葡萄糖存在 葡萄糖和阿拉伯糖都存在 46 AraC蛋白具有PBAD活性正 负调节因子的双重功能 Pr是起阻遏作用的形式 可与类操纵区位点 araI araO2 相结合 而Pi是起诱导作用的形式 它通过与araO1 araI结合启动araBAD转录 没有阿拉伯糖时 Pr形式占优势 一旦有阿拉伯糖存在 它就能够与AraC蛋白结合 使平衡趋向于Pi形式 47 a 当葡萄糖和阿拉伯糖都存在时 过量AraC蛋白结合于araO1处 使RNA聚合酶不能结合araPc 阻止由Pc启动子起始araC基因转录 b 葡萄糖水平较高时 阿拉伯糖水平低时 AraC蛋白为阻遏蛋白Pr 与操纵区O2以及araI上半区相结合 形成DNA回转结构 araBAD基因和araC基因均不表达 c 有阿拉伯糖但无葡萄糖存在时 AraC与阿拉伯糖相结合 成为激活蛋白Pi 与araO1和araI区相结合 在CRP cAMP的共同作用下起始结构基因表达 总结 48 49 50 2019 12 27 51 1 色氨酸操纵子的结构 色氨酸操纵子 tryptophaneoperon 负责色氨酸的生物合成 当培养基中有足够的色氨酸时 这个操纵子自动关闭 缺乏色氨酸时操纵子被打开 其结构基因表达 为可阻遏的操纵子模型 由于trp体系参与生物合成而不是降解 它不受葡萄糖或cAMP CAP的调控 5 色氨酸操纵子 色氨酸的合成分5步完成 每个环节需要一种酶 这5种酶的基因紧密连锁在一起 被转录在一条多顺反子mRNA上 52 5个基因分别以trpE trpD trpC trpB trpA代表 编码了与色氨酸合成有关的五种酶 53 trpE基因是第一个被翻译的基因 和trpE相邻的是启动子区 P 和操纵区 O 前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa 不是trpA 54 trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR 该基因距trp基因簇很远 后者在大肠杆菌染色体图上25cM处 而前者则位于90cM处 55 2 trp操纵子的阻遏机制 trpR基因产物为无活性的阻遏蛋白 此蛋白平常不与操纵区相结合 56 当培养基中有色氨酸时 该阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物 与操纵区结合并关闭trpmRNA转录 57 58 阻遏 操纵机制对色氨酸来说是一个一级开关 主管转录是否启动 相当于粗调开关 trp操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有另一个系统进行细调控 即 通过转录达到第一个结构基因之前终止转录来实现细调控 这个细微调控是由色氨酸的浓度来调节 当Trp浓度较低时 转录得到7kb的mRNA 当有高浓度Trp存在时 转录仅生成140核苷酸的前导RNA 这种调控机制就是弱化作用 59 60 3 色氨酸操纵子的弱化系统1 前导肽及其序列结构 在trpmRNA5 端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区 61 前导区 L区 编码的多肽称为前导肽 分析前导肽序列 发现它包括起始密码子AUG 可编码一个14个氨基酸的多肽 该多肽有一个特征 其第10位和11位有相邻的两个色氨酸密码子 组氨酸 苯丙氨酸操纵子中都有这种现象 若前导区当中123 150位碱基序列缺失 trp基因表达可提高6 10倍 此区域被称为弱化子 弱化子 衰减子 attenuator 位于转录单位开始区 起终止转录信号作用的一段核苷酸序列 62 研究弱化子序列 发现该区mRNA通过自我配对可形成茎 环结构 有典型的终止子特点 63 研究发现 当mRNA合成起始以后 如果培养基中有色氨酸 转录总是在前导区终止 产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子 终止trp基因转录 2 mRNA前导区序列分析 64 trp前导区的碱基序列已经全部测定 其中4个分别以1 2 3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对 有时以1 2和3 4配对 有时只以2 3方式互补配对 Terminatorharipin 65 3 转录的弱化效应 1 当培养基中色氨酸的浓度很低时 负载有色氨酸的tRNA也就少 这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢 当4区被转录完成时 核糖体才进行到1区 这时的前导区结构是2 3配对 所以转录可继续进行 66 RNAPol Help IneedTryptophan 67 2 当培养基中色氨酸浓度较高时 核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子 在4区被转录之前就到达2区 使2 3区不能配对 3 4区自由配对形成发夹终止子结构 转录被终止 trp操纵子被关闭 68 RNAPol 69 4 弱化子的作用机制 弱化子对基因活性的影响是通过影响前导序列mRNA的结构而起作用的 起调节作用的是某种氨基酰 tRNA的浓度 属于这种调节方式的有大肠杆菌中的色氨酸操纵子 苯丙氨酸操纵子 苏氨酸操纵子 异亮氨酸操纵子等等 70 四 转录终止阶段的调控 1 抗终止作用 不同的终止子的作用也有强弱之分 有的终止子几乎能完全停止转录 有的则只是部分终止转录 一部分RNA聚合酶能越过这类终止序列继续沿DNA移动并转录 如果一串结构基因群中间有这种弱终止子的存在 则前后转录产物的量会有所不同 这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式 有的蛋白因子能作用于终止序列或与 因子结合 减弱或取消终止子的作用 称为抗终止作用 antitermination 这类引起抗终止作用蛋白因子就称为抗终止因子 antiterminator 抗终止作用最有代表性的例子见于 噬菌体的时序控制 71 噬菌体生活史 溶菌途径 溶源途径 72 73 PL PR 左右向转录的启动子PRM C 蛋白基因维持启动子 受C 浓度调控C 蛋白 是PL PR的主要阻遏物 并可自主调控PRMcro蛋白 PL PR的阻遏蛋白 并可抑制PRM 抑制c 表达 74 噬菌体裂解生长与溶源化的建立取决于两种阻遏蛋白C 和Cro的合成 当C 蛋白的合成占优势时 PRM被激活 C 蛋白继续起始合成 因而溶源化状态建立 相反Cro蛋白合成占优势 则PRM被抑制 没有C 蛋白的合成 于是 噬菌体在Cro蛋白的控制下进入裂解生长 C Cro溶源 C Cro溶菌 75 噬菌体进入细菌后 由于DNA上无调节蛋白 寄主RNA聚合酶分别结合于PL和PR PR转录Cro蛋白 PL转录翻译产生抗终止蛋白N 76 在抗终止蛋白N的帮助下 转录翻译出C C 蛋白 在C C 蛋白作用下 PRE PRE主管建立溶源 repressorforestablishmentoflysogeny 位于cro和c 之间 的操纵子向左转录c 基因 产生C 蛋白 C C 蛋白活化PRE 77 溶菌途径cro表达在先 c 在后 且c 的表达需C 和C 帮助 而C 可被寄主蛋白酶 hfl编码 水解 因此 当hfl产物存在时c 基因不表达 此时Cro含量远大于c 且占据OR3则使c 不能转录 进入溶菌途径 因此 Cro是进入溶菌途径的关键蛋白 溶源途径hfl表达受一系列基因的调控 寄主细胞碳源和能源缺乏时 使hfl产物活性降低 同时 C 抑制hfl产物活性 因此 C 增加 从而导致C 增加 C 可抑制cro的表达 使噬菌体进入溶源途径 78 2 弱化作用弱化作用 attennuation 是CharlesYanofsky等在研究色氨酸操纵子的过程中发现的一种新的基因表达调控方式 弱化作用是通过DNA中可导致转录过程过早终止的一段核苷酸序列而发挥调节作用的 其共同特点是某些外部因素控制着弱化子发夹结构的形成 79 五 翻译水平的调控 1 mRNA二级结构对翻译起始的调控 SD序列与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录 翻译成蛋白的重要因素之一 某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合 从而影响蛋白质的翻译 SD序列与16SrRNA3 端的相应序列配对影响翻译起始 强的配对可使翻译频率提高 反之翻译频率低 mRNA二级结构影响隐蔽SD序列 影响核糖体小亚基与mRNA的结合 影响翻译 80 E coli的RNA噬菌体MS2 R17 f2和Q 都非常小 直径约为250 是最简单的病毒 基因组长3600 4200nt 只含4个基因 A cp Rep和Lys CP coatprotein 编码外壳蛋白 含129aa MW为13 7KDa A attachment 编码附着蛋白 含393氨aa MW为44KDa Rep replicase 编码复制酶 含544aa MW为61KKDa lys lysis 编码裂解蛋白 和cp Rep基因重叠 该蛋白含75aa 81 82 翻译一个顺反子需要二级结构的改变 mRNA上有多个核糖体存在时 第一个顺反子的翻译会破坏mRNA原有的二级结构 使核糖体能够与下一个顺反子的翻译起始区域结合 83 mRNA的降解速度受细菌的生理状态 环境因素及mRNA结构的影响 mRNA分子自身回折产生的茎环结构有助于维持mRNA稳定性 2 mRNA稳定性对翻译的调控 84 85 3 反义RNA的调控 1984年Mizuno T 和Iwoue发现干扰mRNA的互补RNA mic RNA mRNA interferingcomplementaryRNA AntisenseRNA的作用可能有三种机制 1 反义RNA与mRNA上核糖体结合位点结合 形成双链区 使核糖体不能结合 使翻译不能起始 2 在复制水平 与引物RNA互补结合 抑制DNA复制 3 在靶分子的部分区域形成双链区 使靶分子成为内切酶的特异底物 86 87 4 蛋白质合成水平的自体调控 指一个基因的表达产物蛋白质或者RNA反过来控制自身基因的翻译表达 88 细菌编码核糖体蛋白质 蛋白质合成因子和RNA聚合酶亚基等蛋白质的基因混合组成几个操纵子 每个操纵子都含有数个基因 这些操纵子的表达都受操纵子自身的一些基因产物的调控 操纵子自身编码的蛋白质的富集会抑制其自身及一些相关基因产物的进一步合成 一种蛋白质或RNA调控其自身的表达 即为自体调控 89 1 阻遏蛋白对翻译起始的调控阻遏蛋白通过与mRNA的特定区域结合 抑制核糖体对翻译起始区的识别 这种调控最常见的形式是