（食品科学专业论文）莲藕多酚氧化酶的纯化及环境因素对其溶液构象的影响.pdf

华中农业大学2 0 0 8 屈硕j ：学位论文 莲藕多酚氧化酶的提取纯化、特性及环境因素对其溶液 构象的影响 食品科学 2 0 0 8 届硕士研究生胡婉峰指导教师李春美 摘要 采用磷酸缓冲液为提取溶剂从莲藕中提取莲藕多酚氧化酶( p p o ) ，通过考察提 取方式、提取缓冲液保护剂、提取时间及料液比等因素对酶活性及酶量的影响确定 了莲藕p p o 的最佳提取方法；采用硫酸铵分级沉淀结合s e p h a d e xd e a ea 5 0 及 s e p h a d e xg 一7 5 柱层析等纯化步骤实现了莲藕p p o 的分离纯化，并通过s d s p a g e 电泳进行了纯度鉴定和分子量测定。研究了莲藕p p o 的酶学性质，用氨基酸自动分 析仪测定了其氨基酸组成，并采用圆二色谱( c d ) 、荧光光谱( f p ) 及傅立叶红外 光谱( n 瓜) 研究了莲藕p p o 的溶液构象。重点研究了溶液微环境效应( 包括温 度和p h 值) 对莲藕p p o 溶液构象的影响，莲藕p p o 与外源性底物、自身底物相互 作用以及莲藕p p o 与抑制剂相互作用的光谱学分析。主要研究结果如下： 1 莲藕p p o 的提取条件及纯化方法 新鲜藕肉去皮打浆后，采用p h 值为5 4 的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液( 含 5 p v p p 和1 0 n a c l ) 提取，料液比为l ：2 2 ，置4 冰箱中浸提4 h ，提取的莲藕 p p o 活性最大。提取液经3 0 饱和度的硫酸铵除杂，经8 0 饱和度的硫酸铵粉沉淀 后，经溶解、透析、除盐后，经d e a es e p h a d e xa 5 0 及s e p h a d e xg 7 5 凝胶柱， 收集p p o 活性峰，透析除盐后经s d s p a g e 电泳，呈单一染色带。 2 莲藕多酚氧化酶的酶学性质、分子量及结构表征 莲藕p p o 以邻苯三酚为最适底物，其最适p h y 寸7 0 ，最适温度为5 0 。c ，k m 值为 11 m m o l l 。 经s d s p a g e 电泳，比较标准蛋白分子量，得出莲藕p p o 的分子量约为2 1 k d 。 将莲藕p p o 进行氨基酸组成分析，根据各氨基酸相对含量和酶的分子量可推算 出莲藕p p o 中的氨基酸总和约1 6 4 个。其中非极性氨基酸残基( a l a ，v a l ，l e u ，i l e ， p r o ，m e t ，p h e ，t r p ) 为3 9 6 2 ，极性氨基酸( g l y ，s e r ，t h r ，c y s ，t y r ，a s p ， 华中农业人学2 0 0 8 届硕士学位论文 g l u ，l y s ，a r g ，h i s ) 为5 7 9 2 ，酸性氨基酸( a s p ，g l u ) 为1 8 3 2 ，碱性氨基酸 ( l y s ，a r g ，h i s ) 为1 0 3 9 。 采用圆二色谱、荧光光谱及红外光谱研究了莲藕p p o 的构象，结果表明，浓度 为0 3 m g m l 的莲藕p p o ，其圆二色谱显示在2 0 9 n m 和2 2 2 n m 处有双负峰，分子中q 一 螺旋构象和1 3 一折叠构象分别占4 3 和5 7 。荧光光谱显示最大荧光强度在3 2 9 n m 处， 荧光强度为3 7 0 。结合氨基酸组成分析，荧光光谱表n t r p 残基和t y r 残基同时被激发 后，发生了从t y r 残基至u t r p 残基之间的能量转移。红外吸收中有明显的酰胺i 带和酰 胺带，分别位于1 6 5 8 c m 。和1 5 4 4 c m j 处，酰胺带在1 2 4 0c m 1 处有归属于q 一螺旋构 象的吸收峰。 3 微环境效应对莲藕多酚氧化酶溶液构象的影响 不n p h 值下莲藕p p o 的二级结构变化：莲藕p p o 在中性p h 环境中活性最高，圆 二色谱显示在2 0 9 n m 和2 2 2 n m 处有双负峰，分子中q 螺旋构象和1 3 折叠构象分别占 4 3 和5 7 。荧光光谱显示最大荧光强度在3 2 9 n m 处，荧光强度为3 7 0 。随着p h 值的 升高或降低，莲藕p p o 的活性和二级结构都发生显著变化，在p h 1 0 的条 件下，其活性显著降低，分子中a 一螺旋构象显著降低，同时b 折叠和无规则卷曲构 象明显增加；荧光入m a x 发生红移；荧光强度随着p h 值的升高而增强。p h 值通过微 扰莲藕p p o 的二级结构而影响其活性，莲藕p p o 的活性中心可能位于q 螺旋结构中， 莲藕p p o 中q 螺旋构象和b 一折叠构象的合理配置可能是保持其活性的适宜构象。 不同温度下莲藕p p o 的二级结构变化：随着温度的升高，莲藕p p o 活性上升， 当温度升高至6 0 并保温数分钟后，发生了热变性，活性开始下降，其二级结构中， 其q 一螺旋构象从4 2 4 降至0 8 ，1 3 折叠构象从5 6 7 上升至8 3 ，无规则卷曲含 量上升至1 6 2 。其荧光强度随着温度的升高而下降，最大发射波长蓝移了3 n m 。红 外光谱中各酰胺带均发生不同程度的位移，且其红外吸收减小，酰胺带中1 2 4 0c m 。1 处归属于q 。螺旋构象的吸收峰移至1 2 4 5c m 一。综上可推知，莲藕p p o 的热变性温度 为6 0 。 4 莲藕p p o 与底物之间的相互作用 活性实验结果表明，以邻苯三酚做底物，莲藕p p o 活性最高。圆二色谱结果表 明，莲藕p p o 与邻苯三酚、邻苯二酚、没食子酸作用后，其q 螺旋构象均显著降低， 华中农业大学2 0 0 8 届硕十：学位论文 1 3 折叠构象升高，无规则卷曲含量上升至1 6 5 左右。邻苯三酚与p p o 相互作用后， 其荧光强度下降，峰位不变。邻苯二酚与p p o 相互作用后，其荧光强度显著上升， 没食子酸与p p o 作用后，t r p 残基红移最显著，n - - i n 匕是t r p 过度地暴露所致。从溶液 构象的变化可知，t r p 残基的过度暴露不利于莲藕p p o 维持活性构象。 应用圆二色谱、荧光光谱研究莲藕自身底物与莲藕p p o 相互作用的二级结构变 化。结果表明，莲藕p p o 的二级结构中出现了1 0 3 的1 3 一转角，其一螺旋构象从3 7 1 降为1 2 3 ，1 3 折叠构象从6 2 9 下降至5 8 5 ，无规则卷曲含量上升至1 8 9 。 荧光光谱中，t r p 残基的荧光强度增加，最大发射波长红移至3 4 8 n m ，可知t r p 残基 暴露于部分疏水环境所致，可推知1 3 一转角结构为p p o 进行催化反应的重要的中间构 象，t r p 暴露于部分疏水环境有利于维持p p o 催化活性构象。 5 莲藕p p o 与抑制剂之间相互作用的研究 测定了莲藕p p o 在不同酶活抑制剂作用下的酶活性变化情况。比较了几种常用 酶活抑制剂抑制剂a 、氯化钙、半胱氨酸、柠檬酸、e d t a 一2 n a 等对莲藕p p o 活性的 抑制效应。结果表明：抑制剂a 、半胱氨酸及氯化钙对莲藕p p o 活性的抑制效果较强， 抑制率分别为9 6 2 ，8 6 8 及8 2 4 。柠檬酸及e d t a 抑制效果较低。 圆二色谱结果表明，抑制剂a 严重破坏了莲藕p p o - - 级结构中的q 一螺旋，其q 螺旋构象含量降为0 。氯化钙、半胱氨酸、柠檬酸及e d t a 也破坏了莲藕p p o - - 级结 构中的q 一螺旋，但q 一螺旋构象仍有残留。加入抑制剂后，莲藕p p o z 级结构中的1 3 一折叠构象含量及无规则卷曲含量普遍升高。荧光光谱结果表明，氯化钙、半胱氨酸、 柠檬酸及e d t a 与莲藕p p o 结合后，其荧光发射光谱峰位及峰型变化较相似，当加入 抑制剂a 后，其发射峰型发生显著变化，红移最显著，说明其 r r p 残基在亲水的环境 中暴露程度最大。 关键词：莲藕多酚氧化酶；纯化；溶液构象；相互作用；褐变抑制 i i ! 华中农业火学2 0 0 8 届硕士学位论文 s t u d i e so nt h ee x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i s t i c so f l o t u sr o o tp p oa n de n v i r o n m e n t a le f f e c t so ni t ss o l u t i o n c o n f o r m a t i o n s a bs t r a c t p o l y p h e n o lo x i d a s e ( p p o ) w a se x t r a c t e db yp h o s p h a t eb u f f e rf r o ml o t u sr o o t s ，a n dt h e b e s te x t r a c t i n gc o n d i t i o nw a sd e t e r m i n e d p p ow a sp u r i f i e dt h r o u g ha m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ，s e p h a d e xd e a ea 一5 0a n ds e p h a d e xg - 7 5c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t h e p u r i t y a n dm o l e c u l a r w e i g h t w e r ed e t e r m i n e d b y s d s - p a g e t h ez y m o l o g i c c h a r a c t e r i s t i c so fp p ow e r es t u d i e d e n v i r o n m e n t a le f f e c t so np p o ss o l u t i o n c o n f o r m a t i o nw e r es t u d i e db yc i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y ( f p ) a n df o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( f r - i r ) t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fp p of r o ml o t u sr o o t s p p ow a se x t r a c t e db yd i s o d i u mh y d r o g e np h o s p h a t e c i t r i ca c i db u f f e r ( i n c l u d i n g5 p v p pa n d1 0 n a c i ，p h5 4 ) f o r4ha t4 c ，t h es t u f fl i q u i dr a t i ob e i n g1 ：2 2 p p ow a s p r e c i p i t a t e db y8 0 s a t u r a t i o no fa m m o n i u ms u l f a t e ，p u r i f i e db yd e a es e p h a d e xa 一5 0 a n ds e p h a d e xg 一7 5g e lc o l u m n ，a n dg a i n e das i n g l eb a n db ys d s p a g e 2 t h ez y m o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c s m o l e c u l a rw e i g h ta n ds t r u c t u r ec h a r a c t e r i z a t i o no f p p of r o ml o t u sr o o t t h ep p o ss u b s t r a t ei sp y r o g a l l o l ，t h eo p t i m u mp hi s7 0 。t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s 5 0 c ，k mv a l u ei s1 1m m o l l c o m p a r i n gw i t ht h es t a n d a r dp r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h t ， t h es d s p a g es h o w e dt h a tp p o sm o l e c u l a rw e i g h ti sa b o u t21k d t h ep p o sa m i n oa c i dc o m p o s i t i o nw a sa n a l y s i s e d t h en u m b e ro ft o t a la m i n oa c i d si s a b o u t16 4 t h ec o n t e n to fn o n p o l a ra m i n oa c i d ( a l a ，v a j ，l e u ，i l e ，p r o ，m e t ，p h e ，t r p ) ， p o l a ra m i n oa c i d s ( g l y ，s e r ，t h r ，c y s ，t y r ，a s p ，g l u ，l y s ，a r g ，h i s ) ，a c i d i ca m i n oa c i d s ( a s p ，g l u ) ，b a s i ca m i n oa c i d s ( l y s ，a r g ，m s ) a r ea b o u t3 9 6 2 ，5 7 9 2 ，18 3 2 a n d 1 0 3 9 r e s p e c t i v e l y t v 华中农业大学2 0 0 8 届硕，l 学位论文 t h ec o n f o r m a t i o no fp p ow a ss t u d i e db yc i r c u l a rd i c h r o i s m ，f l u o r e s c e n c ea n d i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f0 3m g r n l ，p p o s a h e l i xc o n f o r m a t i o na n d1 3 - s h e e tc o n f o r m a t i o na c c o u n t e df o r4 3 a n d5 7 r e s p e c t i v e l y f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ys h o w e dt h a tt h el a r g e s te m i s s i v ew a v e l e n g t hw a sa t3 2 9 n m w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h et r pr e s i d u e sw e r ep a r t i a l l yb u r i e di nh y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n t t h ei n f r a r e da b s o r p t i o na t16 5 8c m 1a n d15 4 4c m - 1w e r ef o ra m i d eia n da m i d e1 1 r e s p e c t i v e l y t h ea b s o r p t i o na t12 4 0c m 一1f o ra m i d ei i ib a n dw a sa t t r i b u t et oa h e l i x 3 m i c r o e n v i r o n m e n te f f e c t so nt h es o l u t i o nc o n f o r m a t i o no fp p of r o ml o t u sr o o t s s e c o n d a r ys t r u c t u r a lc h a n g e so fp p o a td i f f e r e n tp hv a l u e ：a st h ep hv a l u ei n c r e a s e d o rd e c r e a s e d p p o sa c t i v i t ya n ds e c o n d a r ys t r u c t u r ec h a n g e ds i g n i f i c a n t l y w h e np h 1 0 ，p p o a c t i v i t yr e d u c e ds i g n i f i c a n t l y ，a - h e l i xc o n f o r m a t i o nd e c r e a s e dr a p i d l y ， 3 - s h e e t a n dr a n d o mc o i lc o n f o r m a t i o ni n c r e a s e dd i s t i n c t i v e l y ；t h el a r g e s te m i s s i v e w a v e l e n g t hr e ds h i f t e d ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h et r pr e s i d u e d sw e r ee x p o s e dt o t h e h y d r o p h i l i ce n v i r o n m e n t ；f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi n c r e a s e da sp hv a l u ee n h a n c e d p h v a l u ea f f e c tt h ep p o sa c t i v i t yb yd i s t u r b i n go nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fp p o a n d p p o sa c t i v ec e n t e rm a yb el o c a t e di nt h ea h e l i xc o n f o r m a t i o n ，t h er a t i o n a la l l o c a t i o no f - h e l i xc o n f o r m a t i o na n d1 3 - s h e e tc o n f o r m a t i o no fp p om a yb et h es u i t a b l ec o n f o r m a t i o n t om a i n t a i ni t sa c t i v i t y s e c o n d a r ys t r u c t u r a lc h a n g e so fp p oa t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ：p p o s a c t i v i t y i n c r e a s e da st e m p e r a t u r ei n c r e a s e d w h e nt h et e m p e r a t u r er o s et o6 0 * ( 2 ，p p o sa c t i v i t y s t a r t e dt od e c l i n e ，g t - h e l i xc o n f o r m a t i o nd e c r e a s e dw h i l e1 3 - s h e e tc o n f o r m a t i o na n dt h e r a n d o mc o i li n c r e a s e d t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yd e c r e a s e da st h et e m p e r a t u r ei n c r e a s e d a n dt h el a r g e s te m i s s i v ew a v e l e n g t hb l u e s h i f t e d3a m a m i d eb a n d ss h i f t e da n dt h e i n f r a r e da b s o r p t i o nd e c r e a s e da t6 0 。c a m i d ei i ib a n da t1 2 4 0c m - 1w h i c ha t t r i b u t et o a - h e l i xc o n f o r m a t i o nm o v e dt o12 4 5c m 一1 f r o mt h ea b o v e ，p p o sd e g e n e r a t i o n t e m p e r a t u r ei s6 0 c v 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 4 t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns u b s t r a t e sa n dp p of r o ml o t u sr o o t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp p o sa c t i v i t yi s h i g h e s tu s i n gp y r o g a l l o la ss u b s t r a t e c i r c u l a rd i c h r o i s mr e s u l t ss h o w e dt h a tw h e ni n t e r a c t i n gw i t hp y r o g a l l o l ，c a t e c h o l ，g a l l i c a c i d ，t h ep p o sq - h e l i xc o n f o r m a t i o nd e c l i n es i g n i f i c a n t l y ，1 3 - s h e e tc o n f o r m a t i o ni n c r e a s e a n dr a n d o mc o i lg ou pt 01 6 5 w h e ni n t e r a c t i n gw i t hp y r o g a l l o l ，p p o sf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yd e c r e a s e d w h e ni n t e r a c t i n gw i t hc a t e c h o l ，i t sf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi n c r e a s e s s i g n i f i c a n t l y w h e ni n t e r a c t i n gw i t hg a l l i ca c i d ，t h et r pr e s i d u e sr e d - s h i f t e dm o s t s i g n i f i c a n t l y ，i tm a yb ec a u s e db ye x c e s s i v ee x p o s u r e f r o mt h ec h a n g e so fs o l u t i o n c o n f o r m a t i o n ，e x c e s s i v ee x p o s u r eo ft r pr e s i d u e sm a yb ed i s a d v a n t a g e o u st om a i n t a i n t h ea c t i v ec o n f o r m a t i o no fp p o s e c o n d a r yc o m f o r m a t i o nc h a n g e so fp p o si n t e r a c t i o nw i t he n d o g e n o u ss u b s t r a t e w e r es t u d i e db yc i r c u l a rd i c h r o i s ma n df l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y t h er e s u l t ss h o w e d t h a t1 3 - t u r nc o u l db eo b s e r v e di nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fp p o ，t h ea - h e l i xc o n f o r m a t i o n r e d u c e df r o m3 7 1 t o1 2 3 ，1 3 - s h e e tc o n f o r m a t i o nd r o p e df r o m6 2 9 t o5 8 5 ， r a n d o mc o i lr o s e u pt 0 1 8 9 f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r ys h o w e dai n c r e a s ei n t r p r e s i d u e sf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ，t h el a r g e s te m i s s i v ew a v e l e n g t hr e ds h i f t e dt o3 4 8n m ， t h i si n d i c a t e dt h a tt r pr e s i d u e sp a r t l ye x p o s e dt oh y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n t ，f i - t u mm a y b ea ni m p o r t a n tm i d d l ec o n f o r m a t i o ni nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fp p ow h e ni n t e r a c t w i t h e n d o g e n o u ss u b s t r a t e s ，t r p r e s i d u e s e x p o s u r e t ot h e p a r t l yh y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n tm a yp l a yar o l ei nt h em a i n t e n a n c eo ft h ea c t i v ec o n f o r m a t i o n 5 t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ni n h i b i t o r sa n dp p of r o ml o t u sr o o t t h ea c t i v i t yc h a n g e so fp p o i n t e r a c t i n gw i t hd i f f e r e n t i n h i b i t o rw e r ed e t e r m i n e d t h e i n h i b i t o r ye f f e c t so fs e v e r a lc o m m o n l yu s e di n h i b i t o r sa si n h i b i t o ra ，c a l c i u mc h l o r i d e ， h o m o c y s t e i n e ，c i t r i ca c i d ，e d t ao np p o sa c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a ti n h i b i t o ra ，h o m o c y s t e i n ea n dc a l c i u mc h l o r i d eh a ds t r o n g e re f f e c t so nt h ei n h i b i t i o n o ft h ea c t i v i t y ；t h ei n h i b i t i n gr a t e sa r e9 6 2 ，8 6 8 a n d8 2 4 r e s p e c t i v e l y c i t r i ca c i d a n de d t ah a dl o w e ri n h i b i t o r ye f f e c t s c i r c u l a rd i c h r o i s mr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n h i b i t o ra s e r i o u s l yd a m a g e dt h ea - h e l i x c o n f o r m a t i o n c a l c i u mc h l o r i d e ，h o m o c y s t e i n e ，a n dc i t r i ca c i de d t ac o u l dd a m a g et h e v i 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 q h e l i xp a r t l y p p o s 3 - s h e e ta n dr a n d o mc o i lc o n f o r r n a t i o ni n c r e a s e di ng e n e r a lb y i n h i b i t o r s f l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y r e s u l t ss h o w e dt h a tw h e nc a l c i u mc h l o r i d e ， h o m o c y s t e i n e ，c i t r i ca c i da n de d t ac o m b i n e dw i t hp p o ，t h ee m i s s i o ns p e c t r ag o ta s i m i l a r t y p ec h a n g e ；w h e ni n h i b i t o raa d d e d ，t h ee m i s s i o ns p e c t r ag o tad i s t i n g u i s h c h a n g e ，t h el a r g e s te m i s s i v ew a v e l e n g t hr e d s h i f t e dm o s ts i g n i f i c a n t l y ，i n d i c a t i n gt h a tt h e t r pr e s i d u e se x p o s em o s ti nt h eh y d r o p h i l i ce n v i r o n m e n t k e y w o r d s ：p o l y p h e n o lo x i d a s e ( p p o ) f r o ml o t u sr o o t s ；p u r i f i c a t i o n ；s o l u t i o n c o n f o r m a t i o n ；i n t e r a c t i o n ；b r o w n i n gi n h i b i t i o n v l l 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 英文简称 p p o p a p c g a c d f p f r 瓜 t p s d s p l a g e t p p b s 聊 t r p l c y s c a e d t a 缩略语表 英文全称 p o l y p h e n o lo x i d a s e p y r o g a l l i ca c i d p y r o c a t e c h i n e g a l l i ca c i d c i r c u l a rd i c h r o i s m f l u o r e s c e n c es p e c t r u m f o u r i e rt r a n s f o r mi n f a r e ds p e c t r o s c o p y t o t a lp o l y p h e n o l s d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s t 0 t a lp h e n o l p h o s p h o r i cb u f f e rs o l u t i o n t y r o s i n e t r y p t o p h a n l - c y s t e i n e c i t r i ca c i d e t h y l e n ed i a m i n et e t r a c e t i ca c i d v ! 1 1 中文全称 多酚氧化酶 邻苯三酚 邻苯二酚 没食子酸 圆二色谱 荧光光谱 傅立叶红外光谱 总酚 聚丙烯酰胺凝胶电泳 总酚 磷酸缓冲液 酪氨酸 色氨酸 l 半胱氨酸 柠檬酸 乙二胺四乙酸 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密舀 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究x - 作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生张铆辨 帆加口矿年二月。日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 k - 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：蝴碗坪孙签名：磊易k 签名日期：扫口8 年易月，o 日签名日期：加昭年二月，o 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 届硕i ：学位论文 第一章前言 莲藕( n e l u m b on u c i f e r ag u e r t n ) 为睡莲科属中能形成肥嫩根状茎的栽培种，是多 年生宿根水生草本植物，原产于中国和印度，在我国已有3 0 0 0 年的栽培历史，广泛 分布在黄河、长江、珠江流域的山东、湖南、湖北、浙江、广东等地。莲藕集营养 与保健于一体，是一种药食同源食品( 武汉植物研究所，1 9 8 7 ) 。莲藕营养成分极其 丰富，主要有淀粉，糖类、蛋白质( 精氨酸、酪氨酸等1 7 种氨基酸) 、脂肪和卵磷脂 等，还有少量的生物碱、黄酮类、胡萝卜素、核黄素( 维生素b 2 ) 尼克酸、维生素c 、 维生素b 6 和硫胺素及铜、锰、钦、磷等营养元素( 金波，1 9 9 7 ) 。另外还含有焦儿 茶素、绿原酸等多种酚类物质( 武汉植物研究所，1 9 8 7 ) 。莲藕因其食用及药用价值， 深受人民喜爱，并大量出口国外。但莲藕采收后，表皮及肉质部分极易褐变，直接 影响了莲藕的感官品质和内在质量，已成为影响莲藕贮藏和出口的主要原因。导致 莲藕褐变的原因可能有酶促氧化、抗坏血酸( v c ) 的氧化、无色花色素的变色等( 黄 秀珍，1 9 9 9 ) 。有研究表明莲藕组织切分后的褐变主要是由于组织中酚类物质在酚酶 的催化作用下氧化引起莲藕的褐变。( 李洁和王清章，2 0 0 0 ；李宁，郁志芳，赵友兴， 2 0 0 0 ；胡军，1 9 8 9 ；杨明，汪志君，1 9 9 6 ) 。莲藕多酚氧化酶( p o l y p h e n o lo x i d a s e ，p p o ) 是导致莲藕酶促褐变的关键酶，而酶的活力表现与酶分子构象的完整性密切相关， 溶液构象研究是从微观上掌握酶整体结构和了解酶在生理状态下发挥活性作用时的 结构状态的关键，观测环境因素改变时莲藕p p o 的构象改变与活力变化的关系，是 阐明p p o 结构与功能及作用机制的新方法，同时可以为寻找理想的抑制方法提供科 学依据。 1 莲藕褐变研究进展 1 1 莲藕多酚类化合物的研究进展 酚类物质是果蔬普遍存在的一类化合物，可以游离的( f p ) 或结合的( b p ) 方式存 在。酚类物质是植物体内一种次生代谢产物，且多认为是苯丙氨酸裂解酶( p a l ) 的催 化反应产物( 黄光荣，2 0 0 0 ) 。酚类物质按酚羟基的数目可分为一元酚( 如苯酚、愈 创木酚、酪氨酸等) 、二元酚( j l 茶酚、多巴、绿原酸、咖啡酸等) 、三元酚( 如焦性没 食子酸) 及多元酚。 果蔬中的酚类物质极易在酚酶作用下氧化形成醌，醌再进一步聚合成黑色物质， 华中农业人学2 0 0 8 屈硕士学位论文 即导致果蔬发生褐变。果蔬中一般含有多种酚类物质，不同果蔬引起褐变的底物也 有所不同，主要由某一种酚氧化引起。研究发现南果梨中绿原酸的氧化是其褐变的 主要原因( 马岩松，2 0 0 0 ) 。荔枝果皮中含有六种酚类化合物，其中只有一种是荔枝 果皮多酚氧化酶的作用底物，而其他酚类物质对褐变作用不大( 谭兴杰，1 9 8 7 ) 。香 蕉果皮的褐变与多巴胺的氧化密不可分( 蒋跃明，1 9 9 1 ) ，马铃薯和蘑菇( b o b ，1 9 8 9 ) 中对褐变起主要作用的物质是酪氨酸。 多酚氧化酶对底物的专一性极强，只能作用于某些酚类化合物，如荔枝果皮发 现含有六种酚类物质，其中p p o 只对一种酚类物质有活性( 谭兴杰，1 9 8 7 ) 。此外， 多酚氧化酶的最适作用底物并非总是和酶同时存在于一植物体中。如百合中p p o 可 氧化含量极少的多巴，却对含量较多的酪氨酸没有活性( 王璋，2 0 0 5 ) 。对高灌蓝越一 橘多酚氧化酶的研究发现，其多酚氧化酶的最适底物为邻苯三酚和绿原酸( 杨萌和 b r o v e l 等，2 0 0 3 ) 。 现有的研究对莲藕中多酚类化合物及莲藕p p o 的最适底物的研究非常有限，仅 王清章( 2 0 0 4 ) 从莲藕中鉴定出了儿茶素、没食子酸，儿茶酚，多巴。有研究表明， 这些酚类只占总酚的2 0 2 ，大量的酚类化合物的结构及其对莲藕褐变的影响有待 于进一步研究。与此同时，对莲藕p p o 的最适底物研究报道也非常有限，有研究认 为莲藕p p o 的最适作用底物为没食子酸( 王清章，2 0 0 4 ) ，而也有研究认为莲藕p p o 的最适作用底物为儿茶酚( 郁志芳，2 0 0 2 ) 。由于这二者均是以粗酶液为研究对象， 同时添加几种外源性底物，比较其与莲藕粗p p o 酶结合米氏常数的相对大小而得出 来的结论，均不能反映莲藕中的真实情况，因此对莲藕p p o 最适底物还有待进一步 研究。 1 2 莲藕褐变控制研究进展 新鲜果蔬切分后，进行包装前化学处理是其加工中不可缺少的环节。化学处理 可有效控制褐变，其中最常用的方法是采用酶抑制剂和抗氧化剂来控制酶活性和降 低氧浓度来抑制褐变( 天津轻工业学院，1 9 8 5 ) 。常用的化学物质有亚硫酸钠盐、柠 檬酸( c a ) 等。近年研究发现醋酸锌、氯化钙、( 异) 抗坏血酸( a a ) 及其钠盐、l - 半胧 氨酸( l - c y s ) 、4 取代基间苯二酚( 4 一h r ) ( m i es o o nl e e k i m ，1 9 9 7 ；m c e v i l y ，1 9 9 1 ) 等对于酶促反应的控制具有显著的效果。国外对土豆切片( l a n g d o n ，1 9 8 7 ) 、苹果 切片( p i z z o c a r o ，1 9 9 3 ) 、鲜切阳桃片( s a n t e r r e ，1 9 8 8 ) 的研究表明结合使用多