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第二章PCR技术原理及其应用 第一节PCR技术原理 PCR PolymeraseChainReaction 聚合链式反应Threesteps denaturation primerannealing polymerization PeoplesChoiceReaction 一 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 引物酶 引物酶 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 DNA聚合酶 DNA聚合酶 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 8 KaryMullis 1985 发明过程Mullis在 偶然想出的聚合酶链反应 一文中写到 这种简单得令人惊奇 可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下 即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的 发展过程 开始使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段 该酶不耐热 每次加热变性DNA后都要重新补加 耗时 费力 易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得自动化 PCR技术简史 DNA的复制聚合酶链反应的发明 KaryB Mullis 1989年美国 Science 杂志列PCR为十余项重大科学发明之首 比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 12 专利官司1987年美国专利局专利授权1989年 DuPont异议 大小公司对簿公堂 将决定谁将获得诺贝尔奖 DuPont理由是 1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明 并公布于众 应当是公共产权 斯坦福大学Kornberg 研究DNA聚合酶获诺贝尔奖 也认为 任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR 美国专利局驳回DuPont异议 地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉 指出DuPont已侵犯另一项与 PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器 13 根据ABI 美国应用生物系统公司 和Roche 罗氏 的协议 PCR专利可分为方法专利和仪器专利 ABI得到仪器专利 Roche掌握方法专利 在应用领域 Roche的势力范围是诊断 亲子鉴定 兽医 ABI争到的领地包括研发 质控 法医 环境 农业等 对于科研人员来说 主要关注的是科研领域 也就是ABI的领地 PCR专利意味着什么 所有科研用途的仪器或者试剂的生产商在生产销售PCR相关产品时需要上缴专利使用费给ABI ABI平均每年获得的5千万美元PCR专利版税的来源 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 72 94 55 PCR循环 二 PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制 首先待扩增DNA模板加热变性解链 随之将反应混合物冷却至某一温度 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸 这种热变性 复性 延伸的过程就是一个PCR循环 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复 PCRCycle Step1 DenaturationTemplateDNAbyHeat 95oC TargetSequence TargetSequence PCR原理示意图 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 PCRCycle Step2 Temperatureislowered Tm andprimersannealtotargetsequences TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 PCRCycle Step3 At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 TaqDNAPolymerase 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链 Endofthe1stPCRCycle Resultsintwocopiesoftargetsequence TargetSequence TargetSequence 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 TargetAmplification No ofNo AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201 048 576301 073 741 824 1cycle 2Amplicon 2cycle 4Amplicon 3cycle 8Amplicon 4cycle 16Amplicon 5cycle 32Amplicon 6cycle 64Amplicon 7cycle 128Amplicon 三 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 PCR仪 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数 2nn循环次数实际拷贝数 1 x nX平均效率 约为0 85n循环次数 PCR反应 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 以DNA为模板的反应反应体积 50 100 l缓冲液引物底物 4种dNTP模板 102 105拷贝TaqDNA聚合酶矿物油 四 PCR反应体系 以mRNA为模板的反应 逆转录PCR 逆转录反应体系体积 20 l缓冲液底物 4种dNTP引物 oligo dT 12 18模板 RNA逆转录酶其他试剂 RNA酶抑制剂 MgCl2 DTT 牛血清白蛋白PCR反应体系同以DNA模板的反应体系 1 PCR反应成分 1 模板单 双链DNA均可 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 一般100ngDNA模板 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 2 引物浓度0 1 0 5 mol L浓度过低影响产量 偏高引起错配和非特异性产物增加 且可增加引物二聚体的产生几率 3 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 0 5 2 5U 50 l酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 4 dNTP20 200 mol LdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量 但特异性增加dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 5 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 0 5mmol L 2 5mmol L反应体系 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 10 50mmol LTris Cl缓冲液 72 时pH7 2 调节反应体系的pH值 使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性 缓冲液含50mmol L的KCl可促进引物退火 大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性 加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构 6 PCR反应的缓冲液 2 循环参数变性94oC 95oC30 60秒且最初在加Taq酶之前先于97oC充分变性5 10min 2 退火50oC 55oC60 90秒增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 3 延伸70oC 74oC60 120秒延伸时间由扩增片段长度决定 4 循环次数主要取决于模板DNA的浓度一般为25 35次次数过多 非特异扩增增加 五 PCR产物的积累规律 在PCR反应中 DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理 反应初期 目的DNA片段呈指数扩增 随着目的DNA产物逐渐积累 扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态 即出现 停滞效应 又称 平台期 到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数 PCR扩增效率 DNA聚合酶种类和活性 以及非特异产物的竞争等因素 到达平台期前 TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环 多数情况下 平台期在PCR反应中不可避免 PCR产物的积累规律示意图 一 一般原则 引物长度在15 30碱基 引物过短 会使特异性降低 过长会提高相应的退火温度 且合成引物的成本增加 引物中碱基的分布是随机的 避免4个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列 G C含量宜在45 55 左右 五 PCR引物的设计 避免两引物间的互补 特别是3 端互补 以免形成二聚体 引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性 引物的3 端不能有任何修饰 也不能有形成任何二级结构的可能 引物的5 端限定着PCR产物的长度 可根据产物的要求不同 可以选用不同的引物修饰法 引物与非扩增序列的同源性不应超过70 直接提交模板序列到特定网页 如 http genome www2 stanford edu cgi bin SGD web primer http frodo wi mit edu 引物设计软件 功能 首先是引物分析评价功能 其中以 Oligo6 最为优秀 其次是引物的自动搜索功能 各种软件在这方面的侧重点不同 二 引物设计的方法 六 PCR产物的检测 一 琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离 纯化和鉴定最常用的方法 其分辨率很高 可测出1ngDNA 一般800bp以上的片段用0 8 的胶 800bp以下的片段用1 0 2 0 的胶 灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高 主要用于分离制备小于1kb长度的低分子质量基因片段 因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测 适用于PCR扩增效率低时产物的检测 根据扩增片段的大小选择合适的胶浓度 电泳后可用银染或溴乙锭染色检测 银染比EB染色检测灵敏度高2 10倍 二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱 HPLC 是在常压基础上发展起来的一项现代化分析技术 其特点是分离速度快 效果好 是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一 离子交换层析 IEC 的基础是溶质分子所携带的电荷 而合成的基因片段恰好具有这一性质 因此 IEC分析广泛应用于DNA的合成及其扩增后的分离纯化 三 层析技术 为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段 或产物是否有突变 都需做分子杂交检测 分子杂交包括点杂交和Southern印迹杂交 点杂交灵敏度较高 特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析 Southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性 检测灵敏度可达10ng 基本过程是PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳 然后 印迹转移到尼龙膜上 再用标记的探针进行杂交检测 四 分子杂交 若知道PCR扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱 则可选择合适的限制酶消化PCR产物 再进行电泳分析 根据PCR酶切产物的电泳图谱 可判定PCR产物的特异性及是否存在突变 六 PCR扩增产物的直接测序直接序列分析是指在PCR扩增基因组DNA序列的基础上 直接进行基因核苷酸序列分析的方法 是检测基因突变最有效 最直接的方法 五 限制性内切酶酶切分析 六 PCR中应注意的事项 一 防止污染试剂小量分装吸头及Ep管一次性使用器皿及工作区域要分开 无菌操作 二 设立对照 阳性对照 阳性模板阴性对照 阴性模板试剂对照 除模板外的所有组分 七 PCR常见问题 无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性 第二节PCR技术应用 一 PCR技术的主要类型 反向PCR 锚定PCR 不对称PCR 原位PCR RT PCR 重组PCR 差异显示PCR 免疫PCR 实时定量PCR 多重PCR 1 反向PCR reversePCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 可对未知序列扩增后进行分析 如探索邻接已知DNA片段的序列 用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆 扩增基因文库的插入DNA 建立基因组步移文库 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 2 不对称PCR目的 扩增产生特异长度的单链DNA 方法 采用两种不同浓度的引物 分别称为限制性引物和非限制性引物 其最佳比例一般是0 01 0 5 M 关键是限制性引物的绝对量 用途 制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物 低浓度引物 3 RT PCR 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应 用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变 呈现mRNA多态性 克隆mRNA的5 和3 末端序列 以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库 基因 mRNA 蛋白质多肽链 mRNA cDNA 杂化双链 4 多重PCR 在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR 其结果是产生多个PCR产物 用于检测特定基因序列的存在或缺失 电泳 引物 某些病原微生物 某些遗传病或癌基因 型别较多 或突变或缺失存在多个好发部位 多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有 乙型肝炎病毒的分型 乳头瘤病毒的分型 单纯疱疹病毒的分型 杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等 多重PCR的特点 高效性 在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物 或对有多个型别的目的基因进行分型 特别是用一滴血就可检测多种病原体 系统性 多重PCR很适宜于成组病原体的检测 如肝炎病毒 肠道致病性细菌 性病 无芽胞厌氧菌 战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检 经济简便性 多种病原体在同一反应管内同时检出 将大大的节省时间 节省试剂 节约经费开支 为临床提供更多更准确的诊断信息 5 LP PCR Labelledprimers 利用同位素 荧光素等对 引物5 端进行标记 用以直观地检测目的基因 与常规PCR相比更为直观 省去了限制性内切酶酶切及分子杂交等繁琐步骤 而且可同时检测多种基因成分特别适合大量临床标本的基因诊断目前该方法只对PCR产物进行定性鉴定 标记引物 观察 PCR产物 6 锚定PCR anchoredPCR A PCR 主要用于分析具有可变末端的DNA序列锚定PCR首先合成第一链cDNA 然后再添加一同聚物尾 polydG 与同聚物尾配对的3 锚定引物 带有限制性内切位点polydC 一起作PCR扩增带有PolyG尾巴的引物是一个固定点 它可以并与PolyG尾巴结合 无论其余部分序列如何 只识别片段末端 利用此法可从前述mRNA中检出至少20种不同序列 每一种都是独特的 表明A PCR不对任何特殊序列有倾向性结果 可用于T细胞 肿瘤及其它部位抗体基因的研究 cDNA 末端核酸转移酶 3 GG GG 5 CC CC锚定引物 3 GG GG 5 CC CC 3 GG GG CC CC 7 原位 原位聚合酶链式反应 InStillPCR Is PCR 是由Haase等于1990年首创 它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段 在不破坏细胞的前提下 利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行 扩增 可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列 操作步骤1 细胞或组织固定 细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂 包括引物和Taq酶 进入2 PCR扩增细胞内目的片段3 原位杂交检测扩增产物 A 阳性对照 B 阴性对照 C 原位检测mRNA表达 温度梯度PCR 温度梯度曲线 ThermalImageof45 65 CGradientacrossaPTC 200witha96 wellAlpha 温度梯度PCR优化复性温度 Gradientoptimizationof12differenttemperaturesacrosstheblock testedbetween48 Cand68 C 热启动PCR是除了好的引物设计之外 提高PCR特异性最重要的方法之一 尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72 聚合酶在室温仍然有活性 因此 在PCR反应试剂配制过程中 以及在热循环刚开始 保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物 这些非特异性产物一旦形成 就会被有效扩增 限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液 并将其置于预热的PCR仪 这种方法简单便宜 但并不能完成抑制酶的活性 因此并不能完全消除非特异性产物的扩增 手动热启动法管底 DNA 预冷buffer dNTP和dH2O管壁 引物预热 80 加Taq酶 离心 开始PCR循环 专用热启动酶法抗体介导的抑制DNA聚合酶法化学阻断DNA聚合酶法其他DNA聚合酶抑制剂法 10 Touch downPCR1 概念 Touch downPCR又称降落PCR 即选定一个温度范围 如50 35 每降1 2 进行1 2个循环 然后在50度下进行15个循环 2 原理 随着退火温度的降低 特异性逐步降低 但特异性条带在温度较高时已经扩增出来 其浓度远远超过非特异性条带 随着退火温度的降低 特异性条带优先被扩增 3 选择初始复性温度的原则 起始复性温度应该比引物的Tm值高出5 10度 然后每个循环递减1 2度 4 Touch downPCR的应用范围模板DNA浓度较低 引物简并程度高或特异性低 RT PCR时使用oligo dT 11 荧光定量PCR real timePCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 对PCR产物进行标记跟踪 实时在线监控反应过程 结合相应的软件可以对结果进行分析 计算待测样品的初始模板量 内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes FRET 引物特异性探针Amplifluor Intergen SYBR GreenI 实时PCR技术原理 实时定量PCR real timePCR 通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量 可以很好的推算模板的起始浓度 这种工作方式称为实时定量PCR 实时荧光定量PCR 实时定量PCR在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析 故称为实时荧光定量PCR 1病原体测定由于PCR技术的问世 使得病原体检测能够快速而方便的进行 但由于其高灵敏性 实验操作很容易受到污染而出现假阳性 只要有微量病原体存在 PCR扩增即可为阳性结果 但并不能作为诊断依据 只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义 因此结模板定量显得特别重要 常规PCR由于不能定量而限制了其应用 然而PE公司研制的FQ PCR技术给解决这一问题提供了可能 目前该技术已经应用于丙肝病毒 人类乳头瘤病毒 结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究 Morris等用FQ PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒 HCV 进行了研究 FQ PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率 因此可作为一种检测HCV的有效方法 同时 由于FQ PCR可以测出血清中病原体浓度 故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据 以前常规检测大肠杆菌的方法 都因为繁琐 需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制 美国Witham等1996年将FQ PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究 针对不同血清变异型的大肠杆菌 他们设计应用不同的探针 从而提高了实验特异性 他们同时还对探针相对于引物的位置 反应液中探针浓度 镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验 以提高实验的准确性和精确性 由于TaqMan系统可以一次测量96管样品 还可对模板进行准确定量 又不需要进行电泳及EB染色后处理过程 实际应用方便 从而提高了实验的参考价值和应用价值 因此该实验方法是食品检测方面的一个突破 2 肿瘤研究意大利Gelmini等用FQ PCR技术检测乳腺癌标本c erbB 2基因拷贝数目变异情况 他们以 肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件 当扩增循环数在28 31之间时 RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系 他们在此条件下扩增了c erbB 2基因和 球蛋白基因 发现 RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系 虽然二者斜率不同 但是各个实验浓度下二者的 RQ之比却是恒定的 说明尽管二者发光效率不同 却不影响定量效果 他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性 n 25 r 0 94 P 0 01 3 基因表达研究由于Taq